Name: Generation von Oligodendrozyten und Oligodendrozyten-Konditionierten Mediums für Co-Kultur-Experimente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Erfahren Sie die effiziente Methode zur Aufreinigung von Oligodendrozyten und zur Herstellung von konditioniertem Medium für Co-Kultur-Experimente mit Neuronen. Diese Technik ermöglicht Untersuchungen zur Myelinisierung und Remyelinisierung.

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Die Autoren danken Rémi Ronzano für seinen klugen Rat in der Manuskriptbearbeitung. Diese Arbeit wurde durch ICM, INSERM, ARSEP Stiftung Zuschuss an NSF und Bouvet-Labruyére Preis finanziert.

Die Pflege und Verwendung von Ratten in diesem Experiment entspricht den institutionellen Politiken und Leitlinien (UPMC, INSERM und Richtlinie 86/609/EWG des Rates der Europäischen Gemeinschaft). Das folgende Protokoll wird für einen Standard-Wurf von 12 Welpen eingerichtet.
1. Vorbereitung der Kolben (ca. 5 min)
HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte am Tag vor der Zerlegung in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen aus.
<ol><li>Beschichten Sie die 150 cm2 Kolben (T150) mit Filterkappe (1 Kolben für 2 Welpen) mit 5 ml Polyethylenimin (PEI, 100 mg/L, siehe Protokoll in Zusatzdatei 1).</li>
	<li>Lagern Sie die Kolben über Nacht bei 4 °C.</li>
	<li>Spülen Sie beschichtete Kolben 3 mal mit sterilem destilliertem Wasser am Tag der Zerlegung.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Medien (ca. 10 min)
HINWEIS: Führen Sie die Schritte in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen aus.
<ol><li>Bereiten Sie 500 ml Kulturmedium vor, bestehend aus Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), ergänzt durch 10% fetales Kalbsserum (FCS) und Penicillin-Streptomycin (100 I.E./ml).</li>
	<li>Bereiten Sie 20,6 ml des Enzymverdauungsmediums in einem 50 ml-Rohr vor, bestehend aus 20 ml DMEM, 200 l DNase (50 g/ml), 200 l Papain (30 U/ml) und 200 l L L-Cystein (0,24 mg/ml).</li>
	<li>Filtern Sie die Medien mit einem 0,22 m-Filter.</li>
	<li>Halten Sie die Medien in der laminaren Durchflusshaube bei Raumtemperatur (RT) bis zur Zerlegung.</li>
</ol>3. Vorbereitung für die Zerlegung (ca. 10 min)
HINWEIS: Führen Sie die Schritte in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen aus.
<ol><li>100 ml phosphatgepufferte Saline ohne Kalzium und Magnesium (PBS; 1x) vorbereiten. Filter-Sterilisieren mit einem 0,22-mm-Filter.</li>
	<li>Bereiten Sie 50 ml eiskalte 1x PBS-Lösung vor, die mit 750 l 45% Glukose ergänzt wird. Filter-Sterilisieren mit einem 0,22-mm-Filter.</li>
	<li>Füllen Sie eine 100 mm Petrischale mit 1x PBS für Reinigungsinstrumente und drei 60 mm Petrischalen mit eiskaltem PBS-Glucose für die Gewebeernte. Die Petrischalen auf Eis legen, bis sie zerlegt sind.</li>
</ol>4. Dissektion
HINWEIS: Die Dissektion wird von männlichen und weiblichen Wistar Rattenwelpen am postnatalen Tag (P) 2 durchgeführt.
<ol><li>Um eine sterile Umgebung zu gewährleisten, stellen Sie sicher, dass die Bank mit 100% Ethanol gereinigt wird. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Werkzeuge mit 100% Ethanol.</li>
	<li>Sprühen Sie den Hals des Welpen vorsichtig mit 70% Ethanol.</li>
	<li>Verwenden Sie große chirurgische Scheren, um das Tier zu enthaupten und legen Sie den Kopf in eine 100 mm Petrischale mit eiskaltem PBS-Glucose.</li>
	<li>Verwenden Sie gekrümmte Zangen, um den Kopf des Tieres auf Augenhöhe zu halten. Verwenden Sie kleine chirurgische Schere, um einen kleinen Schnitt an der Schädelbasis zu machen und schneiden Sie den Schädel nach der Gehirnmittellinie.</li>
	<li>Verwenden Sie Zangen, um die beiden Teile des Schädels sanft von der Mittellinie abzuziehen.</li>
	<li>Verwenden Sie einen kleinen chirurgischen Löffel, um das Gehirn aus der Kopfhöhle zu entfernen. Setzen Sie das Gehirn in eine 60 mm Petrischale, die eiskalte PBS-Glucose enthält.</li>
	<li>Betrachten unter einem Steromikroskop, verwenden Sie feine Zange, um das Kleinhirn, das Hirnstamm und olfaktorische Glühbirnen aus zerebralen Hemisphären zu entfernen.</li>
	<li>Verwenden Sie feine Zangen, um die beiden zerebralen Hemisphären zu trennen. Verwenden Sie feine Zange, um die Meninges abzuschälen. Die Hirnkortika in einer 60 mm-Petrischale auf Eis legen. HINWEIS: Eiskalte Sedieb ist entscheidend für die richtige Entfernung von Meningen.</li>
</ol>5. Gewebedissoziation
HINWEIS: Führen Sie die Schritte in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen aus.
<ol><li>Verwenden Sie ein scharfes Skalpell, um die Zerebralparese fein zu hacken. Übertragen Sie das gehackte Gewebe in ein 50 ml-Rohr, das Enzymverdauungsmedium enthält.</li>
	<li>30 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%CO2inkubieren.</li>
	<li>Verwenden Sie eine p1000 Mikropipette, um das Enzymverdauungsmedium sanft zu entfernen und gleichzeitig sicherzustellen, dass das kortikale Gewebe am Boden des 50 ml-Rohrs verbleibt.</li>
	<li>Verwenden Sie eine p1000 Mikropipette, um 1 ml DMEM-10% FCS hinzuzufügen und das Gewebe sanft zu trituieren.</li>
	<li>Verwenden Sie einen 70-mm-Filter und einen Kolben einer 1 ml Spritze, um das Kortikalgewebe in ein 50 ml-Rohr zu filtern. HINWEIS: Mit DMEM-10% FCS kann restliches Gewebe mehrmals an der Innenrohrwand abspülen.</li>
	<li>Füllen Sie das 50 ml Rohr mit DMEM-10%FCS. Zentrifuge bei 423 x g für 5 min bei RT. Überstand vorsichtig entfernen und Zellpellet mit 2 ml DMEM-10%FCS wieder aufsetzen.</li>
	<li>Zellpellet mit einer p1000-Mikropipette und dann mit einer p200-Mikropipette sanft trituieren. Verdünnen Sie die Zellsuspension mit dem entsprechenden Volumen von DMEM-10%FCS. HINWEIS: Zwei Gehirne = ein T150 = 5 ml DMEM-10%FCS.</li>
	<li>Platte 5 ml der Zellsuspension auf einem T150 mit einer Dichte von 1 x 105 Zellen/cm2. Fügen Sie jedem T150 20 ml warmes DMEM-10%FCS hinzu. Inkubieren in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%CO2.</li>
	<li>Erneuern Sie die Hälfte des Kulturmediums nach 6 Tagen in vitro (DIV) mit warmem DMEM-10%FCS.</li>
</ol>6. Schüttelvorbereitung
<ol><li>Führen Sie die Schüttelvorbereitung am Tag vor dem Schütteln in einer laminaren Fließhaube unter sterilen Bedingungen durch.</li>
	<li>Erneuern Sie die Hälfte des Kulturmediums, indem Sie frisches warmes Kulturmedium in den Kolben einfließen lassen und bei 37 °C unter 5%CO2brüten.</li>
</ol>7. Schütteln
<ol><li>Drei 100 mm Petrischalen mit PEI beschichten. Lagern Sie sie bei 4 °C über Nacht.</li>
	<li>Bedecken Sie die Flaschenkappe mit Paraffinfolie und legen Sie die Kolben in eine Plastiktüte. Schütteln Sie Kolben mit Gliazellen über Nacht bei 250 U/min bei 37 °C. HINWEIS: Das erste Schütteln erfolgt bei 8 DIV und man kann bis zu drei verschiedene Schütteln durchführen (siehe Abbildung 1 für Timing).</li>
</ol>8. OL Linienzellen Ernte und Kultur
HINWEIS: Diese Schritte sollten in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
<ol><li>Am Tag nach dem Schütteln bereiten Bottenstein-Sato (BS) Mittel nach Tabelle 1vor.</li>
	<li>Spülen Sie beschichtete Petrischalen 3 mal mit sterilem destilliertem Wasser.</li>
	<li>Erntekolben',-Überstand, der hauptsächlich OL-Linienzellen, aber auch einige mikrogliaale Zellen enthält, und auf nicht beschichteten 100 mm Petrischalen plattieren. HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht die Entfernung von mikrogliaalen Zellen durch differenzielle schnelle Haftung auf der Telleroberfläche.</li>
	<li>Die Petrischalen 15 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%CO2inkubieren.</li>
	<li>Füllen Sie jeden T150 Kolben mit 25 ml warmem, frisch zubereitetem Kulturmedium und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%CO2 bis zum zweiten Schütteln.</li>
	<li>Übertragen Sie den Überstand aus den Petrischalen in neue unbeschichtete 100 mm Petrischalen, um die Haftung von verbleibenden Mikroglialzellen zu ermöglichen.</li>
	<li>Die Petrischalen 15 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%CO2inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand, der nicht anhaftende OL-Linienzellen enthält, und übertragen Sie ihn in 50 ml-Rohre (Überstand aus 2 Petrischalen für ein 50 ml-Rohr). Entsorgen Sie Petri-Gerichte, die mit Mikroglia überzogen sind.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie den Überstand für 5 min bei 423 x g. Entfernen Sie überstand es und setzen Sie das Zellpellet vorsichtig mit 1 ml BS-Medium aus. Alle Pellets in einem gemeinsamen 50 ml-Rohr bündeln und volumen auf 10 ml mit BS-Medium einstellen.</li>
	<li>Bestimmen Sie Zellen, die zellendichte zählen, unter dem Mikroskop. HINWEIS: Es sollte eine Zelldichte zwischen 3 x 105/ml und 5 x 105/ml erreicht werden.</li>
	<li>Fügen Sie 20 ml BS hinzu, wenn die Zelldichte größer oder gleich 4 x 105/ml ist, um ein Endvolumen von 30 ml zu erhalten, oder fügen Sie nur 10 ml BS hinzu, wenn die Zelldichte kleiner als 4 x 105/ml ist, um ein Endvolumen von 20 ml zu erhalten.</li>
	<li>Platte zwei oder drei vorbeschichtete 100 mm Petrischalen mit 10 ml Zellaufhängung. Inkubieren in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%CO2.</li>
	<li>Reinigen Sie die Trümmer der Petri-Gerichte, indem Sie das gesamte BS-Medium 2 H später erfrischen. HINWEIS: Untersuchen Sie die Kultur unter dem Mikroskop vor und nach der Räumung, um die Zelldichte und die Effizienz der Entfernung von Schmutz zu überprüfen.</li>
	<li>2 Tage in BS-Medium in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%CO2inkubieren. HINWEIS: Untersuchen Sie die Kultur unter dem Mikroskop. Der Zusammenfluss sollte 70 % bis 80 % betragen.</li>
</ol>9. OCM-Produktion
HINWEIS: Führen Sie diese Schritte in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen aus.
<ol><li>Vorbereiten NB-B27low Medium nach Tabelle 2.</li>
	<li>Erneuern Sie das Kulturmedium mit 10 ml warmem NB-B27low Medium. 2 Tage in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%CO2inkubieren.</li>
	<li>Ernten Sie das OCM, d.h. Überstand, der OL-Sekretfaktoren enthält. Filtern Sie OCM mit einem 0,22-mm-Filter. HINWEIS: OCM maximal 2 Monate bei 4 °C lagern.</li>
</ol>10. OCM-Zusatz
HINWEIS: Die Schritte sollten in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. OCM kann gereinigten Hippocampus-Neuronenkulturen hinzugefügt werden, die nach dem folgenden Protokoll14hergestellt und durch Zugabe von 24 h nach Isolation, den Anti-Mito-Wirkstoffen Uridin und 5-Fluorodeoxyuridin (5 m) für 36 h erhalten werden.
<ol><li>Bei 3 DIV entfernen Sie alle Neuronenkulturmedium mit Anti-Mitotik-Mitteln und fügen Sie 500 l frische warme OCM.</li>
	<li>Erneuern Sie alle 3 Tage die Hälfte des Mediums mit frisch zubereitetem warmen NB-B27. HINWEIS: Solche Kulturen können bis zu 21 DIV beibehalten werden.</li>
</ol>11. Zugabe von OL zur gereinigten Hippocampus-Neuronenkultur
HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte in einer laminaren Durchflusshaube unter sterilen Bedingungen aus. OLs können gereinigten Hippocampuskulturen hinzugefügt werden, die auf die gleiche Weise erhalten werden wie oben beschrieben.
<ol><li>Vorbereiten von Co-Kultur-Medium gemäß Tabelle 3.</li>
	<li>Rufen Sie die OL-Kultur bei 70% bis 80% Zusammenfluss ab. Spülen Sie mit 2 ml warmem 1x PBS.</li>
	<li>Um die Zellen zu lösen, fügen Sie 2 ml 0,25% Trypsin zu einer 100 mm Petrischale hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie für 5 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C unter 5%CO2.</li>
	<li>Fügen Sie 2 ml DMEM-10% FCS hinzu, um die enzymatische Reaktion zu blockieren. Ernten Sie den Überstand, der OL-Abstammungszellen enthält.</li>
	<li>Zentrifuge bei 423 x g für 5 min bei RT. Überstand vorsichtig entfernen und das Zellpellet in warmem Co-Kulturmedium wieder aufsetzen, um eine Konzentration von 1,25 x 105 Zellen/ml zu erhalten.</li>
	<li>Fügen Sie OL zu gereinigten Hippocampus-Neuronen Kultur durch entfernen 200 l Neuronkultur Medium und Hinzufügen von 200 l Zellsuspension pro Brunnen (2,5 x 104 Zellen/ Well) einer 24-Well-Platte.</li>
	<li>Erfrischen Sie alle 2-3 Tage die Hälfte des Co-Kulturmediums. HINWEIS: Kokulturen können bis zu 24 DIV gepflegt werden.</li>
</ol>

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</ol>

Keiner der Autoren hat konkurrierende oder gegensätzende Interessen.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um hoch angereicherte oligodendrogliale Linienzellkulturen aus gemischten Gliakulturen zu erhalten, angepasst an eine zuvor veröffentlichte Methode16, und die anschließende Produktion von OL-konditioniertem Medium. Diese Schütteltechnik ist nicht teuer, kann dreimal wiederholt werden und ist optimal, um eine hohe Menge an gereinigten OLs zu erhalten, da Zellen, die in Bottenstein-Sato (BS) Medium kultiviert werden, das PDGF-Vermehrung ent...

Oligodendrozyten (OLs) sind Gliazellen des Zentralnervensystems (ZNS), die Myelin um Axone herum umwickeln. OLs stammen von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs), die sich innerhalb der ventrikulären Zonen des embryonalen ZNS vermehren und dann in vollausgereifte OLs (d.h. Myelin-bildende Zellen) migrieren und differenzieren1. OPCs sind während der frühen Entwicklung reichlich vorhanden, aber auch im erwachsenen Gehirn bestehen, wo sie die haupthäufigste proliferative Zellpopulation darstellen2. Ein einzelnes OL verschließt mehrere Axone in nicht erregbaren Abschnitten (d. h. Internodien), und der Rand jeder Myelinschleife wird an dem Axon befestigt, der die paranodale Domäne bildet, die für die isolierenden Eigenschaften von Myelin1,3entscheidend ist. Zwischen den Paranoden befinden sich kleine, unmyelinierte Lücken, die als Knoten von Ranvier bezeichnet werden. Diese Knoten sind reich an spannungsgebundenen Natriumkanälen (Nav), was die Regeneration und schnelle Ausbreitung von Aktionspotentialen durch salzatorische Leitung4ermöglicht. Diese enge Wechselwirkung ermöglicht auch axonale Energieunterstützung durch neuronale Aufnahme von Laktat aus OLs5,6.
Die Reifung von oligodendroglialen Abstammungszellen und der Myelinisierungsprozess werden durch ihre Wechselwirkungen mit Neuronen streng reguliert7. Tatsächlich exprimieren OLs und OPCs, auch NG2-Zellen genannt, eine Reihe von Rezeptoren für Neurotransmitter und können Input von exzitatorischen und hemmenden Neuronen erhalten, so dass sie neuronale Aktivität spüren können, die ihre Proliferation und/oder Differenzierung in myelinierenden Zellen auslösen kann2. OPCs/OLs wiederum sezernieren Mikrovesikund und Proteine in den extrazellulären Raum, der allein oder synergistisch neuromodulative und neuroprotektive Funktionen8,9,10,11,12. Die molekularen Mechanismen, die die verschiedenen Arten von Wechselwirkungen zwischen oligodendroglialen Abstammungszellen und Neuronen steuern, müssen jedoch noch vollständig entschlüsselt werden.
Darüber hinaus sind oLs in mehreren zNS-pathologischen Erkrankungen in erster Linie betroffen und stören so ihre Interaktion mit Neuronen. Zum Beispiel, bei Multipler Sklerose (MS), neurologische Dysfunktion wird durch fokale Demyelination im ZNS verursacht, sekundär zu OLs Verlust, der zu axonalen Schäden und damit verbundenen Behinderung Akkumulation führen kann. Eine Remyelination kann stattfinden, wenn auch in den meisten Fällen nicht ausreichend13. Fortschritte in den letzten zehn Jahren aufgrund der Entwicklung von Immuntherapien haben die Rückfallrate reduziert, aber die Förderung der Remyelination bleibt bis heute ein unerfülltes Bedürfnis. Daher ist ein besseres Verständnis der Rolle, Funktionen und Einflüsse von OLs für die Entwicklung neuer Therapien für ein breites Spektrum von ZNS-Bedingungen von besonderem Interesse.
Hier beschreiben wir die Methoden der OLs Reinigung und Kultur. Dies ermöglicht eine genaue Untersuchung der intrinsischen Mechanismen, die ihre Entwicklung und Biologie regulieren. Darüber hinaus ermöglichen solche hoch angereicherten OLs-Kulturen die Produktion von oligodendrozyten-konditionierten Medien (OCM), die gereinigten Neuronenkulturen hinzugefügt werden können, um Einblicke in die Auswirkungen von OLs-sekretionierten Faktoren auf die neuronale Physiologie und Konnektivität zu gewinnen. Darüber hinaus beschreiben wir, wie ein In-vitro-Kokultursystem implementiert wird, in dem gereinigte Oligodendrozyten und Neuronen miteinander kombiniert werden, so dass die Mechanismen, die die (Re-)Myelinisierung regulieren, angegangen werden können.

<table><tbody><tr><td>5-Fluordeoxyuridin</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoselösung</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>DNase (Desoxyribonuklease I)</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100% </td><td>Sigma</td><td>32221-M</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 70%</td><td>VWR Chemicals</td><td>83801.360</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>ThermoFisher</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>ThermoFisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>A1285601</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimin (PEI)</td><td>Sigma</td><td>P3143</td><td></td></tr><tr><td>Tetraborat-Decahydrat</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Uridin</td><td>Sigma</td><td>U3750</td><td></td></tr><tr><td>Bottenstein-Sato (BS) media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>apo-Transferrin human</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Rinderserumalbumin)</td><td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>PDGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-13A</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Putrescindihydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Natriumselenit</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>T3 (3,3',5-Trijod-L-thyronin-Natriumsalz)</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>T4 ( L-Thyroxin)</td><td>Sigma</td><td>T1775</td><td></td></tr><tr><td>Co-culture media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>apo-Transferrin human</td><td>, Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td>, <td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Rinderserumalbumin)</td><td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Ceruloplasmin</td><td>Sigma</td><td>239799</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-Cystein</td><td>Sigma</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>ThermoFisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Putrescin</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Human CNTF</td><td>Sigma</td><td>450-13</td><td></td></tr><tr><td>Natriumselenit</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>T3 (3,3',5-Trijod-L-thyronin-Natriumsalz)</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin B12</td><td>Sigma</td><td>V6629</td><td></td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; m Filter</td><td>Sartorius</td><td>514-7010</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Spritze</td><td>Terumo</td><td>1611127</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petrischale</td><td>Dutscher</td><td>193100</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Röhrchen</td><td>Corning Life Science</td><td>734-1867</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Röhrchen</td><td>Corning Life Science</td><td>734-1869</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petrischale</td><td>Dutscher</td><td>067003</td><td></td></tr><tr><td>70 & Mikro; m filter</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Binokularmikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Gebogene Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Große chirurgische Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14008-14</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>Swann-morton</td><td>233-5528</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleine chirurgische Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Kleiner chirurgischer Löffel</td><td>Bar Naor Ltd</td><td>BN2706</td><td></td></tr><tr><td>T150 cm2 Flasche mit Filterkappe</td><td>Dutscher</td><td>190151</td><td></td></tr><tr><td>Animal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 Wistar rat</td><td>Janvier</td><td>RjHAn:WI</td><td></td></tr></tbody></table>

generation von oligodendrozyten und oligodendrozyten-konditionierten mediums für co-kultur-experimente

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

Im zentralen Nervensystem sind Oligodendrozyten für ihre Rolle bei der Axonmyelination bekannt, die die Ausbreitung von Aktionspotentialen durch salzatorische Leitung beschleunigt. Darüber hinaus deuten immer mehr Berichte darauf hin, dass Oligodendrozyten mit Neuronen jenseits der Myelinisierung interagieren, insbesondere durch die Sekretion von löslichen Faktoren. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das die Reinigung von oligodendroglialen Linienzellen aus Gliazellkulturen ermöglicht, die auch Astrozyten und mikrogliaale Zellen enthalten. Die Methode beruht auf dem nächtlichen Schütteln bei 37 °C, das eine selektive Ablösung der darüber liegenden Oligodendroglialzellen und Mikrogliazellen ermöglicht, und der Eliminierung von Mikroglia durch Differentialhaftung. Wir beschreiben dann die Kultur der Oligodendrozyten und die Produktion von Oligodendrozyten-konditioniertem Medium (OCM). Wir bieten auch die Kinetik der OCM-Behandlung oder Oligodendrozyten Zusätzlich zu gereinigten Hippocampus-Neuronen in Co-Kultur-Experimente, Studium der Oligodendrozyten-Neuron-Wechselwirkungen.

In diesem Protokoll werden OL-Linienzellen aus Gliakulturen gereinigt, indem Astrozyten und Mikroglia abgeschüttelt werden. Reinheit und phänotypische Untersuchung von OL-Kulturen kann durch Immunfärbung mit Gliamarkern15beurteilt werden. Die Analyse der Expression verschiedener Marker ergab, dass OL-Kulturen meist Vor-OLs waren, wobei 90 % 4 % der O4+-Zellen, 85 % bei 7 % NG2+ Zellen und 4,7 % 2,1 % der PLP+ Zellen, während 7,2 % b...

Hierin zeigen wir eine effiziente Methode zur Reinigung von Oligodendrozyten und zur Herstellung von Oligodendrozyten-konditionierten Medien, die für Kokulturexperimente verwendet werden können.

Generation von Oligodendrozyten und Oligodendrozyten-Konditionierten Mediums für Co-Kultur-Experimente

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Wir beschreiben eine effiziente Methode der oligodendroglialen Linienzellen Reinigung und Kultur. Dies ermöglicht es, die molekularen Mechanismen zur Steuerung der Differenzierung von Oligodendrozyten und deren Wechselwirkungen mit Neuronen während des Myelinnationsprozesses zu adressieren. Diese Schütteltechnik ist nicht teuer und optimal, um eine hohe Menge an Oligodendrozyten zu erhalten.Solche Kulturen ermöglichen die Produktion von Oligodendrozyten-konditionierten Medium und Ko-Kulturen von Oligodendrozyten mit Neuronen. Multiple Sklerose ist eine Krankheit, die durch fokale De-Myelination im zentralen Nervensystem verursacht wird, sekundär zu Oligodendrozyten Verlust. Oligodendrozyten Kultur bieten ein Werkzeug für ein besseres Verständnis, wie re-Myelination zu fördern.Nur oligodendrogliale Zellkultur könnte Einblicke in intrinsische Mechanismen geben, die Entwicklungen und Biologie von Oligodendrozyten regulieren. Ko-Kulturen mit Neuronen ermöglichen es, Einblicke in ihre Auswirkungen auf die neuronale Physiologie zu gewinnen. Verwenden Sie zunächst gekrümmte Zangen, um den Kopf des Tieres auf Augenhöhe zu halten.Verwenden Sie kleine chirurgische Schere, um einen kleinen Schnitt an der Schädelbasis zu machen und schneiden Sie den Schädel nach der Gehirnmittellinie. Verwenden Sie Zangen, um die beiden Teile des Schädels sanft von der Mittellinie abzuziehen. Verwenden Sie einen kleinen chirurgischen Löffel, um das Gehirn aus der Kopfhöhle zu entfernen.Setzen Sie das Gehirn in eine 60-Millimeter-Petrischale mit eiskaltem PBS-Glukose auf Eis. Betrachten Sie unter einem Stereomikroskop, verwenden Sie feine Zange, um das Kleinhirn, den Hirnstamm und die olfaktorischen Glühbirnen aus den zerebralen Hemisphären zu entfernen. Verwenden Sie feine Zangen, um die beiden zerebralen Hemisphären zu trennen.Verwenden Sie feine Zange, um die Meninges abzuschälen. Die Zerebralparese in einer 60-Millimeter-Petrischale auf Eis legen. Verwenden Sie in einer laminaren Fließhaube ein scharfes Skalpell, um die Zerebralparese fein zu hacken.Übertragen Sie das gehackte Gewebe in eine 50-Milliliter-Röhre, die Enzymverdauungsmedium enthält. Inkubieren Sie für 30 Minuten in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid. Danach verwenden Sie eine Pipette, um das Enzymverdauungsmedium sanft zu entfernen und gleichzeitig sicherzustellen, dass das kortikale Gewebe am Boden des Rohres verbleibt.Verwenden Sie eine P1000 Mikropipette, um einen Milliliter DMEM 10%fetales Kalbsserum hinzuzufügen und das Gewebe sanft zu trituieren. Verwenden Sie einen 70-Mikron-Filter und den Kolben einer Ein-Milliliter-Spritze, um das Kortikalgewebe in ein 50-Milliliter-Rohr zu filtern. Spülen Sie das Restgewebe an der inneren Rohrwand des 50-Milliliter-Rohrs mehrmals mit DMEM 10%fetalem Kalbsserum.Füllen Sie das 50-Milliliter-Rohr mit DMEM 10%fetales Kalbsserum. Zentrifuge bei 423 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und setzen Sie das Zellpellet mit zwei MilliliterDMEM 10% fetalem Kalbsserum wieder auf.Das Zellpellet vorsichtig mit der Mikropipette P1000 und dann mit der P200-Mikropipette trituieren. Verdünnen Sie die Zellsuspension mit dem entsprechenden Volumen von DMEM 10%fetales Kalbsserum. Platte fünf Milliliter der Zellsuspension auf einem T-150 Kolben mit einer Dichte von ein mal 10 bis fünf Liter pro Quadratzentimeter.Fügen Sie 20 Milliliter warmes DMEM 10%fetales Kalbsserum zu jedem T-150 Kolben hinzu. Inkubieren Sie in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid. Nachdem sie die Probe über Nacht bei 250 U/min und 37 Grad Celsius geschüttelt hat, ernten Sie den Überstand im Kolben, der hauptsächlich Oligodendrozyten-Linienzellen, aber auch einige mikrogliale Zellen enthält, und auf unbeschichtete 100-Millimeter-Petrischalen aufsieben.Die Petrischalen 15 Minuten lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid bebrüten. Dies ermöglicht die Entfernung von mikrogliaalen Zellen durch differenzielle schnelle Haftung auf der Telleroberfläche. In der Zwischenzeit jeden T-150 Kolben mit 25 Milliliterwarmem, frisch zubereitetem Kulturmedium füllen und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid bis zum zweiten Schütteln brüten.Als nächstes übertragen Sie den Überstand aus den Petrischalen in neue unbeschichtete 100-Millimeter-Petrischalen, um die Haftung von verbleibenden Mikroglialzellen zu ermöglichen. Die Petrischalen 15 Minuten lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid bebrüten. Entfernen Sie den Überstand aus allen zwei Petrischalen, die nicht haftende Oligodendrozyten-Linienzellen enthalten, und übertragen Sie ihn in eine 50-Milliliter-Röhre.Entsorgen Sie die mit Mikroglia überzogenen Petri-Gerichte. Zentrifugieren Sie die Rohre für fünf Minuten bei 423 mal g. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und setzen Sie das Zellpellet mit einem Milliliter Bottenstein-Sato-Medium wieder auf.Bündeln Sie alle Pellets in einem gemeinsamen 50-Milliliter-Rohr und stellen Sie das Volumen je nach Zelldichte mit Bottenstein-Sato-Medium auf 20 oder 30 Milliliter ein. Platte zwei oder drei vorbeschichtete 100-Millimeter-Petrischalen mit 10 Millilitern der Zellsuspension. Inkubieren Sie in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid.Zwei Stunden später, löschen Sie die Trümmer aus den Petri-Gerichten, indem Sie das gesamte Bottenstein-Sato-Medium erfrischen. Inkubieren Sie für zwei Tage im Medium in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid. Nach zwei Tagen, untersuchen Sie die Kultur unter dem Mikroskop.In einer laminaren Durchflusshaube, unter sterilen Bedingungen, erneuern Sie das Kulturmedium mit 10 Milliliter nwarmmp-27 low medium. Inkubieren Sie für zwei Tage in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid. Um das OCM zu ernten, sammeln Sie den Überstand, der Oligodendrozyten enthält, die von den Sezern zerseitierten Faktoren werden.Filter sterilisieren sie den OCM mit einem 0,22-Mikron-Filter. In diesem Protokoll wurden Oligodendrozyten-Linienzellen aus Gliakulturen gereinigt, indem Astrozyten und Mikroglia abgeschüttelt wurden. Die Analyse der Expression verschiedener Marker ergab, dass Oligodendrozytenkulturen meist Voroligodendrozyten mit 90 plus oder minus 4% der O4-positiven Zellen, 85 plus oder minus 7%NG2-positiven Zellen und 4,7 plus oder minus 2,1% der PLP-positiven Zellen waren, während 7,2 plus oder minus 2,5% der Zellen GFAP-positive Astrozyten waren.OCM, das aus solchen Kulturen hergestellt wurde, wurde an drei Tagen in vitro zu gereinigten Hippocampus-Neuronkulturen hinzugefügt. Diese Behandlung fördert die Clusterbildung von Notalproteinen. Die Myelinisierung von Hippocampus-Neuronen wurde durch Zugabe von Oligodendroctyes nach 14 Tagen in vitro untersucht.Von 20 bis 24 Tagen in vitro ermöglichte die Immunfärbung von Myelinmarkern wie Myelin-Basisprotein die Visualisierung der Myelinsegmente und Knoten von Ranvier. Core PBS ist wichtig für Meninges Entfernung. Das lebhafte Clearing ist entscheidend für die Oligodendroctyes-Lebensfähigkeit und die Realisierung der Stärken des mit der Pipette aufgebrachten Durchflusses.Oligodendrozyten-konditioniertes Medium kann neuronalen Kulturen hinzugefügt werden, um Einblick in die Auswirkungen von oligodendroctyes sezernierten Faktoren auf die neuronale Physiologie zu gewinnen. Ko-Kulturen von Oligodendrokty mit Neuronen können auch durchgeführt werden, um den Myelinationsprozess zu studieren.

generation-oligodendrocytes-oligodendrocyte-conditioned-medium-for-co

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Ableitung von angereicherten Populationen von murinen Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) in primären Kultur, die, um zu reifen Oligodendrozyten (OLS) produzieren differenzieren. Darüber hinaus beschreibt dieser Bericht Techniken zur Herstellung murine myelinisierenden Co-Kulturen durch Impfen Maus OPCs auf einen Neuriten Bett Maus Spinalganglien Neuronen (DRGNs).

Ableitung von Enriched Oligodendrozyten Kulturen und Oligodendrozyten / Neuron myelinisierenden Co-Kulturen von Post-Natal Mausgeweben

Primary, vermehren humanen fötalen brain-derived, multipotente...

Progenitor-abgeleiteten Oligodendrozyten Culture System von Human Fetal Gehirn

Dieses Video zeigt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung der lateralen Ventrikelwände aus dem erwachsenen Mausgehirn und zur Durchführung einer enzymatischen Gewebedissoziation, um einzelne Zellen zu erhalten. Diese Zellen werden dann spezifischen Kulturbedingungen ausgesetzt, die die Proliferation von neuralen Stammzellen selektiv fördern und ihre Differenzierung in Co-Kulturen von Oligodendrozyten und Astrozyten fördern.

Gewinnung einer gemischten Oligodendrozyten- und Astrozytenkultur aus adulten neuralen Stammzellen der Maus

Dieses Video zeigt die Etablierung einer Co-Kultur von humanen induzierten Neuronen (iNs) und induzierten Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (iOPCs). iNs werden mit iOPCs in einer Co-Kultur gemischt und dann inkubiert, um die Reifung von iNs zu Neuronen und iOPCs zu Oligodendrozyten zu unterstützen. Neuronen bilden synaptische Verbindungen mit anderen Neuronen und Oligodendrozyten, während Oligodendrozyten Myelinscheiden um die Axone der Neuronen bilden.

Eine Co-Kultur-Methode zur Modellierung von Neuron-Oligodendrozyten-Interaktionen

Das Video demonstriert ein Protokoll zur Differenzierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) in Oligodendrozyten und zur Induktion der Myelinisierung in einer Co-Kultur mit Neuronen des dorsalen Wurzelganglion (DRG). Die OPCs werden mit lentiviralen Vektoren transduziert, die für ein Signalprotein kodieren, das die Myelinisierung reguliert. Die transduzierten OPCs werden mit DRG-Neuronen co-kultiviert, um die Differenzierung in Oligodendrozyten und die Signalprotein-induzierte...

Ein in vitro Transduktions-induzierter Myelinisierungsassay für Oligodendrozyten-Vorläuferzellen

Dieses Video zeigt die Produktion von Oligodendrozyten-konditioniertem Medium (OCM) aus Zellen der Oligodendrozytenlinie, indem es sie betont, um ihre molekulare Freisetzung in das Medium zu verbessern. Dieses Medium, das reich an Wachstumsfaktoren, Zytokinen und anderen bioaktiven Molekülen ist, kann Neuronenkulturen zugesetzt werden, um Einblicke in den Einfluss von Oligodendrozyten-sezernierten Faktoren auf die neuronale Physiologie und Konnektivität zu erhalten.

Verfahren zur Erzeugung von Oligodendrozyten-konditioniertem Medium

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Isolierung und Kultivierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) aus der Hirnrinde von Mäusen.

Isolierung und Kultivierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus dem Gehirnkortex von Maus-Welpen

Globoidzellen sind ein definierendes pathologisches Merkmal der Krabbe-Krankheit, einer Leukodystrophie, für die es derzeit keine wirksame Langzeittherapie gibt. Wir haben ein Zellkulturmodell entwickelt, um die angeborene Biologie und das pathogene Potenzial aktivierter Mikroglia und ihre Umwandlung in Globoidzellen zu untersuchen.

Ein In-vitro- Modell für die Untersuchung der zellulären Pathophysiologie in Globoidzell- Leukodystrophie

Hier präsentieren wir Protokolle, die eine flexible und strategische Grundlage für die virale Manipulation von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen bieten, um interessante Proteine zu überexprimieren, um ihre Rolle in Oligodendrozyten spezifisch über das in vitro-Modell der Myelinisierung des Zentralnervensystems zu untersuchen.

Herstellung und Verwendung von Lentivirus, um selektiv zu transduzieren Primäre Oligodendrozyten Vorläuferzellen für In-vitro- Myelinisierung Assays

Die Neuron-Glia-Interaktionen bei der Neurodegeneration sind aufgrund unzureichender Werkzeuge und Methoden nicht gut verstanden. Hier beschreiben wir optimierte Protokolle zur Gewinnung induzierter Neuronen, Oligodendrozytenvorläuferzellen und Oligodendrozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen und geben Beispiele für die Werte dieser Methoden zum Verständnis zelltypspezifischer Beiträge bei der Alzheimer-Krankheit.

Generierung humaner Neuronen und Oligodendrozyten aus pluripotenten Stammzellen zur Modellierung von Neuron-Oligodendrozyten-Interaktionen

Wir beschreiben die Produktion von Mischkulturen von Astrozyten und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, die aus fetalen oder adulten neuralen Stammzellen gewonnen werden, die sich in reife Oligodendrozyten unterscheiden, und in vitro die Modellierung schädlicher Reize. Die Kopplung mit einer zellbasierten High-Content-Screening-Technik bildet ein zuverlässiges und robustes Wirkstoff-Screening-System.

High-Content-Screening-Differenzierungs- und Reifungsanalyse von fetalen und adulten neuralen Stammzellen-abgeleiteten Oligodendrozyten-Vorläuferzellkulturen

Erfahren Sie die effiziente Methode zur Aufreinigung von Oligodendrozyten und zur Herstellung von konditioniertem Medium für Co-Kultur-Experimente mit Neuronen. Diese Technik ermöglicht Untersuchungen zur Myelinisierung und Remyelinisierung.

Generation von Oligodendrozyten und Oligodendrozyten-Konditionierten Mediums für Co-Kultur-Experimente

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