Name: Isolierung von Tonsillar Mononukleären Zellen zur Untersuchung von Ex-Vivo-angeborenen Immunantworten in einem menschlichen Mukosal-Lymphgewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von Tonsillar-Mononukleärzellen zur Untersuchung angeborener Immunantworten in menschlichem Mukosa-Lymphgewebe. Diese Methode liefert lebensfähige Zellen für ex-vivo-Studien.

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Diese Arbeit wurde von der Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) für die Experimente und Das N.B.-Stipendium (AAP 2017 166). N.S. unterstützt das ANRS für Stipendien (AAP 2016 1), die European Molecular Biology Organization EMBO for Fellowship (LT 834 2017), das Startup-Förderprogramm "Baustein" der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm (LSBN.0147) und die Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1).

Die Proben werden nicht speziell für Forschungszwecke gesammelt und die Studie gilt nicht als invasiv. Die Sammlung menschlicher Mandeln bedarf jedoch der ethischen Zustimmung der zuständigen Behörden vor Ort. In unserem Fall wurde es vom Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847) genehmigt. Darüber hinaus wird die Zustimmung jedes Patienten oder gesetzlichen Vertreters einzuholen, um die personenbezogenen Daten der Spender (z. B. Geschlecht, Alter, Geschichte von HNO-Infektionen) zu erhalten, die bei der Interpretation experimenteller Ergebnisse helfen können.
1. Umgang mit dem menschlichen Tonsillargewebe
<ol><li>Legen Sie Mandeln von jedem Spender in eine sterile 50 ml Durchstechflasche mit 25 ml PBS 1x und transportieren Sie sie bei Raumtemperatur (RT) gemäß den Empfehlungen der Behörde ins Labor (verwenden Sie drei Schutzstufen: Fläschchen, einen Safe und einen Beutel). HINWEIS: Das gesamte Verfahren sollte in einem Labor der biologischen Sicherheitsstufe 2 durchgeführt werden. Alle menschlichen Exemplare sollten mit Vorsicht behandelt werden, da sie bisher nicht qualifiziert waren und Infektionserreger enthalten können.</li>
	<li>
Reinigen Sie alle Werkzeuge zwischen den einzelnen Verwendungen.
	<ol>
<li>Nach Gebrauch das Zellsieb zerlegen und mit allen anderen Instrumenten (z.B. Stößel, Zange) in einem Bad mit einer Waschmittellösung (1/10 Volumenwaschmittel in H2O) über Nacht aufbewahren.</li>
		<li>Bürsten Sie jedes Utensil, um das Gewebe zu entfernen und mit klarem Wasser zu waschen.</li>
		<li>Trocknen Sie alle Teile gut, bereiten Sie dann das Zellsieb (85 ml, 37 mm Durchmesser) vor, indem Sie ein 60-Mesh-Stahlgitter auf ein 10-Mesh-Stahlgitter legen und den Ring fest schließen.</li>
		<li>Legen Sie alle Werkzeuge in sterile Taschen und Autoklaven.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Zerlegung des menschlichen Tonsillargewebes und Isolierung der Tonsillar Mononuklezellen (TMCs)
<ol><li>Legen Sie das Zellsieb auf eine 150 x 25 mm2 (SPL150) Zellkulturschale und alle Instrumente in einem anderen SPL150, um sie steril zu halten.</li>
	<li>Übertragen Sie die Mandeln von der Durchstechflasche mit steriler Zange in das Zellsieb. Gießen Sie auch in alle PBS, die einige Zellen enthält, die die Mandeln ausgetreten sind. Fügen Sie ggf. weitere PBS hinzu, um das Raster einzutauchen. HINWEIS: Das Gewebe sollte jederzeit eingetaucht werden, um eine Austrocknung zu vermeiden.</li>
	<li>Entfernen Sie kauterisiertes, blutiges und fibroides Gewebe mit Zangen und einem Skalpell. HINWEIS: Tonsillen, die von Kindern entfernt wurden, brauchen diesen Schritt nicht.</li>
	<li>Schneiden Sie das Gewebe mit dem Skalpell und der gekrümmten Pinzette in kleine Stücke mit einem Durchmesser von weniger als 0,5 cm. Schneiden Sie das gesamte Gewebe, so dass die kleinen Stücke jederzeit eingetaucht werden können.</li>
	<li>Legen Sie ein paar Gewebestücke in das Zellsieb und kratzen Sie sie mit einem Glasschädling auf das Gitter, bis nur noch eine wirklich dünne Schicht weißer Stroma übrig bleibt. Entfernen und verwerfen Sie die Stroma, um eine Verstopfung des Rasters zu vermeiden.</li>
	<li>Sobald alle Gewebe durch das Gitter gequetscht wurden, verwenden Sie eine 10 ml Pipette, um die gesamte Zellsuspension auf das Gitter zu übertragen und ein letztes Mal zu kratzen.</li>
	<li>Die Zellsuspension mit einer 10 ml Pipette in eine sterile Durchstechflasche übertragen. Waschen Sie das Gitter und das Zellsieb mit PBS 1x. Lassen Sie die Zellaufhängung für 5 min bei RT auf der Bank ruhen. Dieser Schritt ermöglicht die Ausfällung und Agglomeration der übrig gebliebenen Stroma, abgestorbener Zellen und jeder freigesetzten DNA und erleichtert den nächsten Schritt.</li>
	<li>Legen Sie ein steriles 70-m-Sieb auf eine neue 50 ml-Durchstechflasche (vorsichtig aus der Hülle entfernen) und übertragen Sie die Zellsuspension vorsichtig mit einer 10 ml Pipette darauf. Mischen Sie die Suspension nicht, da häufig ein Pellet vorhanden ist. Wenn das Sieb verstopft ist, verwenden Sie die Rückseite einer sterilen 1 ml Pipettenspitze, um die Zellen durch das Sieb zu kratzen. Ändern Sie das Sieb so oft wie nötig.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 x g für 10 min bei 4 °C.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet durch sanftes Mischen der Durchstechflasche wieder auf, und suspendieren Sie die Zellen dann in 35 ml PBS.</li>
	<li>In einer neuen Durchstechflasche ein neues 70-m-Sieb drauflegen und die Zellsuspension mit einer 10 ml Pipette darauf übertragen. Wenn das Sieb verstopft ist, verwenden Sie die in Schritt 2.7 beschriebene Technik.</li>
</ol>3. Isolierung der TMCs durch Zelldichtegradient
HINWEIS: Die TMCs können nach Schritt 2.10 verwendet werden. Um jedoch eine klarere Zelllösung zu erhalten und andere Zellablagerungen und alle roten Zellen zu entfernen, wird empfohlen, eine Zelldichtegradientenisolation der mononukleären Zellen durchzuführen.
<ol><li>Fügen Sie 15 ml des Dichtegradientenmediums (d = 1.076 g/ml) in eine neue 50 ml Durchstechflasche ein. Gießen Sie die TMCs-Lösung auf das Dichtegradientenmedium, wobei Sie darauf achten, das Mischen der Suspension mit dem Dichtegradientenmedium zu minimieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Lösung bei 1.000 x g für 30 min bei RT mit Beschleunigung und Abbruch.</li>
	<li>Mit einer 10 ml Pipette entfernen und die obere Schicht (die meist PBS 1x enthält) verwerfen, ohne die Schnittstelle zwischen den TMCs und dem Dichtegradientenmedium zu stören. HINWEIS: Die TMCs enthalten eine geringe Anzahl von Erythrozyten, daher ist die Lösung klar. Somit kann die Schnittstelle zwischen der Lösung von TMCs in PBS und dem Dichtegradientenmedium schwer zu visualisieren sein. Dementsprechend können Zellen in RPMI 1640 resuspendiert werden, ergänzt mit 20 mM HEPES (ohne FBS), bevor der Dichtegradient durchgeführt wird.</li>
	<li>Entfernen Sie die TMCs mit einer sterilen 1 ml Pipettenspitze und legen Sie sie in eine neue 50 ml Durchstechflasche.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen, indem Sie 50 ml PBS hinzufügen, die 2 % fetales Rinderserum (FBS) und 2 mM EDTA enthalten, und zentrifugieren Sie das Rohr bei 250 x g für 10 min bei 4 °C, um die verbleibenden Blutplättchen zu entfernen.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 3.5, zentrieren Sie aber das Rohr bei 400 x g für 10 min bei 4 °C.</li>
	<li>Bereiten Sie Kulturmedium (R10) durch Ergänzung RPMI 1640 mit 10% Hitze inaktiviert FBS, 2 mM L-Glutamin, und die Antibiotikum-Lösung (100 U/ml Penicillium und 100 g/ml Streptomycin).</li>
	<li>Setzen Sie die TMCs in 10 ml R10 wieder aus und zählen Sie die Zellen. Im Durchschnitt ergibt diese Technik 5 x 108-2 x 109 TMCs pro Paar Mandeln. Die Zellen können nun für Untersuchungen wie PBMCs aus Vollblut (z.B. Reinigung bestimmter Zelltypen, Zellkultur, Durchflusszytometrie, RT-qPCR, Gefrieren usw.) verwendet werden.</li>
	<li>
Einfrieren Sie die Zellen bei Bedarf für die weitere Verwendung mit Standardtechniken für das Einfrieren von Primärzellen.
	<ol>
<li>Zählen Sie die Anzahl der Zellen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellen und entfernen Sie den Überstand. Lösen Sie das Pellet in ausreichend 100% FBS für eine Endkonzentration von 1 x 108 Zellen/ml auf, und fügen Sie dann das gleiche Volumen einer 80% FBS + 20% DMSO-Lösung hinzu. Die Zellen werden dann bei 5 x 107 Zellen/ml sein. Dieser Schritt sollte bei 4 °C durchgeführt werden und die FBS- und DMSO-Lösung sollte vor der Verwendung bei 4 °C gehalten werden.</li>
		<li>1 ml der Zelllösung in Kryoröhren verteilen und in einen langsamen Gefrierbehälter geben, der über Nacht bei 4 °C lag, um die Rate des Einfrierens von Zellen zu kontrollieren. Legen Sie es bei -80 °C.</li>
		<li>Um die Zellen aufzutauen, legen Sie die Kryovials in ein warmes Bad bei 37 °C für ein paar Sekunden mit ständiger Erregung. Sobald die Zellen zu tauen beginnen, übertragen Sie sie auf 49 ml R10 und Zentrifuge, um die DMSO zu entfernen. Zählen Sie die Zellen und verwenden Sie sie als PBMCs. HINWEIS: Obwohl das Einfrieren und Auftauen der TMCs Schmutz entfernen wird, werden auch einige seltene Zelltypen beschädigt. Wenn nach dem Auftauen Klumpen oder Ablagerungen vorhanden sind, ist es am besten, die Zellsuspension durch ein steriles 70-m-Sieb zu passieren, bevor Sie es verwenden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Phenotypisierung von TMCs durch Durchflusszytometrie
<ol><li>Rufen Sie 5 x 106 Zellen aus der vorherigen Lösung für jedes Antikörper-Gemisch-Panel ab, das getestet werden muss, und legen Sie es in ein 5 ml Zytometrierohr. Rufen Sie 1 x 106 Zellen für die unbefleckte Steuerung ab.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen in PBS und Zentrifuge bei 400 x g für 5 min bei 4 °C. Setzen Sie sie in 500 l PBS (1 x 106 Zellen/ml) wieder auf und inkubieren Sie sie mit einem Lebensfähigkeitsfleck für 30 min bei 4 °C im Dunkeln.</li>
	<li>Fügen Sie 5 l inaktiviertes menschliches AB-Serum pro 100 l Zellsuspension hinzu und inkubieren Sie 15 min bei 4 °C im Dunkeln.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen in PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA (Waschpuffer) und Zentrifuge bei 400 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Setzen Sie die TMCs in 500 l Waschpuffer mit den Antikörpern gemäß Tabelle 1wieder aus. Inkubieren Sie die Zellen 30 min bei 4 °C im Dunkeln.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen in Waschpuffer und Zentrifuge bei 400 x g für 5 min bei 4 °C. Setzen Sie die TMCs in 500 l PBS mit 0,5 % Paraformaldehyd (PFA) aus. Bei 4 °C bei 4 °C bis zur Erfassung durch Durchflusszytometrie im Dunkeln halten. HINWEIS: PFA ist gefährlich. Verwenden Sie eine kommerzielle Gebrauchslösung, um die 0,5% PFA-Lösung vorzubereiten.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antikörper</td>
			<td>Klon</td>
			<td>Fluorochrom</td>
			<td>Unternehmen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Live-Dead</td>
			<td></td>
			<td>BV405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>SP34-2</td>
			<td>V500</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>SK1</td>
			<td>Amcyan</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>BW135/80</td>
			<td>VioBlue</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>RPA-T4</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>HI30</td>
			<td>PerCP-cy5.5</td>
			<td>Bd</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>HD237</td>
			<td>Ecd</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD20</td>
			<td>2H7</td>
			<td>Alexa Fluor 700</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD14</td>
			<td>M5E2</td>
			<td>PE-cy7</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD14</td>
			<td>M5E2</td>
			<td>Apc</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD16</td>
			<td>3G8</td>
			<td>APC-H7</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>MEM188</td>
			<td>Pe</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD123</td>
			<td>7G3</td>
			<td>Pe</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>BDCA-1</td>
			<td>L161</td>
			<td>Pacific Blue</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>BDCA-3</td>
			<td>AD5-14H12</td>
			<td>Fitc</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
		</tr>
<tr>
<td>BDCA-4</td>
			<td>AD5-17F6</td>
			<td>Apc</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
		</tr>
<tr>
<td>HLA-DR</td>
			<td>G646-6</td>
			<td>PerCP-cy5.5</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11c</td>
			<td>3.9</td>
			<td>Alexa Fluor 700</td>
			<td>ebiowissenschaften</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Liste der Antikörper für die Zellcharakterisierung durch Durchflusszytometrie.
5. Beispiel für die Aktivierung von TMCs und Messung der Zytokinproduktion
<ol><li>Verdünnen Sie die TMCs in R10 medium, um eine Konzentration von 2 x 106 Zellen/ml zu erhalten.</li>
	<li>Verteilen Sie 400.000 TMCs in 200 l R10 in einer 96 gut runden Bodenplatte.</li>
	<li>Um die Zellen zu aktivieren, fügen Sie über Nacht 5 g/ml des TLR7/8-Agonisten-Resiquimods (R848) hinzu.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Platten und holen Sie den Überstand der TMCs ab und frieren Sie sie für weitere Analysen ein. Die Cytokinproduktion wird mit Perlen-basierten Immunoassays bewertet, um mehrere lösliche Zytokine gleichzeitig mit einem Durchflusszytometer nach dem Herstellerprotokoll zu quantifizieren.</li>
	<li>Bewerten Sie die Lebensfähigkeit der Zellen anhand eines lumineszierenden Zelllebensfähigkeits-Assays nach dem Herstellerprotokoll. Fügen Sie kurz 60 l Zelllebensfähigkeitslösung in die Brunnen ein und messen Sie die Lumineszenz innerhalb von 10 min (Erfassung für 1 s/well).</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Menschliche Mandeln stellen ein integratives und physiologisches Ex-vivo-Modell dar, um angeborene Immunantworten an der Schleimhautschnittstelle zu untersuchen, da sie die Rolle eines sekundären Lymphorgans imitieren. Interessanterweise ist die zelluläre Zusammensetzung der TMCs den PBMCs ähnlich und umfasst alle wichtigen Zellpopulationen, obwohl ihr Prozentsatz von PBMCs aus Blut abweichen kann (Abbildung 1). Zusätzliche Populationen können auch gefunden werden, da alle Immunantworten in ...

Studien an menschlichen Organen sind aufgrund der Zugänglichkeit sowie offensichtlicher ethischer Gründe eingeschränkt. Sie sind jedoch unerlässlich, um die Komplexität der menschlichen Biologie vollständig zu verstehen. Kulturen isolierter Zellen (Primärkulturen oder Zelllinien) sind aufgrund ihrer Verfügbarkeit ein Standardsystem in zellbiologischen Studien. Während isolierte Zellkulturen hervorragende Entdeckungen ermöglicht haben, ist die Verwendung von Zelllinien genauer unter die Lupe genommen worden, weil sie die in vivo Organbiologie nicht vollständig imitieren. Die Kultur der dreidimensionalen Zellen oder Gewebeexplanten ist jedoch hochkomplex4,5,6. Tatsächlich ist ein Stück Gewebe oder Organ sehr heterogen, da seine Zellzusammensetzung je nach Lokalisierung im Gewebe unterschiedlich ist. Daher erfordert die Verwendung von Gewebeblöcken die Analyse vieler technischer und biologischer Repliken, was zu einer großen Anzahl von Spendern oder Patienten führt.
Die Schleimhaut-assoziierten Lymphgewebe (MALT) sind strukturell den Lymphknoten ähnlich, haben aber einzigartige Funktionen, da ihre Hauptaufgabe darin besteht, die Schleimhautimmunität zu regulieren7. Im Gegensatz zu den Lymphknoten, die sich in der Regel in einiger Entfernung vom Gewebe befinden, befindet sich MALT in der Regel direkt unter dem Epithel des Schleimhautgewebes. Histologisch bestehen sie hauptsächlich aus hohen Konzentrationen von B- und T-Zellen, aber auch aus Antigen-präsentierenden Zellen wie Makrophagen und dendritischen Zellen. MALT machen etwa 50% des Lymphgewebes im menschlichen Körper aus. MALT sind je nach Standort in neun Gruppen unterteilt: GALT (gut-), BALT (bronchus-), NALT (nasal-), CALT (konjunktiv), LALT (Larynx-), SALT (skin-), VALT (vulvo-), O-MALT (organisiert) und D-MALT (diffus). Der O-MALT besteht hauptsächlich aus den Mandeln des Waldeyer Tonsillar-Rings und ist der zugänglichste MALT8,9. Tatsächlich stellen Mandeln im Oropharynx die Hauptbarriere zum Schutz der Verdauungs- und Atemwege vor (potenziellen) invasiven Mikroorganismen10dar. Darüber hinaus werden die Mandeln von einem fein geschichteten Plattenepithel ohne Keratinisieren bedeckt, das von einer Kapsel aus Bindegewebe unterstützt wird, die Blutgefäße, Nerven und Lymphatik enthält und einen einfachen Zugang zu den Immunzellen11,12ermöglicht. Darüber hinaus ist die Tonsillektomie, der chirurgische Akt der Entfernung von Mandeln, ein häufiges Verfahren, das bei Kindern mit schlafgestörter Atmung durchgeführt wird, wodurch Mandelnin physiologischen Umgebungen leicht zugänglich sind.
Tonsillen ermöglichen die Untersuchung der Immunzellreaktion in Pathologien mit Schleimhautimmunität. In der Tat, bei HIV-Infektion, weil Mandeln aus einer hohen Konzentration von Immunzellen bestehen, sind sie das Hauptziel der Virusreplikation, sondern produzieren auch eine große Menge an Zytokinen, die nicht im Kreislauf14,15nachgewiesen werden. In stabilen Zuständen sind seltene Populationen von angeborenen Zellen in verschiedenen Schleimhautgeweben vorhanden, einschließlich der Mandeln, aber im Wesentlichen fehlen im Blut.
Daher sind mononukleäre Zellen aus Mandeln (TMCs) ein relevanteres und komplexeres Modell als PBMCs und können tiefergehende Fragen beantworten. Andererseits kann die Verwendung von Gewebeexplantationen komplex und nicht immer relevant für angeborene Immunstudien sein. So haben wir ein Modell zur Untersuchung der Mukosal-Immunaktivierung mit TMCs16erstellt. Hier beschreiben wir eine Methode zur effizienten Isolierung von TMCs von frischen menschlichen Mandeln. Diese Methode ermöglicht die Wiederherstellung einer großen Anzahl von Immunzellen unter Beibehaltung ihrer Integrität für Ex-vivo-Studien.

<table><tbody><tr><td>10 Maschen Stahlgitter - 1910 & Mikro; m</td><td>Dutscher</td><td>198586</td><td>Zum Einschieben in das Zellensieb Cellector</td></tr><tr><td>60 Maschen Stahlgitter - 230 & Mikro; m</td><td>Dutscher</td><td>198591</td><td>Zum Einfüllen in das Zellsieb Cellector</td></tr><tr><td>70 & micro; m weiß ClearLine Zellsiebe</td><td>Dutscher</td><td>141379C</td><td></td></tr><tr><td>Anios Excell D Waschmittel</td><td>Dutscher</td><td>59852</td><td>Detergens</td></tr><tr><td>Antibiotische Lösung, 100x</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>100 U/mL Penicilium und 100 &mu; g/mL Streptomycin - zur Zugabe zu Nährmedien</td></tr><tr><td>BD FalconTM Röhrchen mit rundem Boden, 5 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td>FACS Röhrchen</td></tr><tr><td>Zellsieb Cellector, 85 mL und 37 mm Durchmesser</td><td>Dutscher</td><td>198585</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo (CTG) Lumineszierender Zellviabilitätsassay</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>Viabilitätsassay</td></tr><tr><td>Zentrifuge 5810</td><td>R Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konische Röhrchen Falcon 50 mL</td><td>Dutscher</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Gebogene Pinzette</td><td>Dutscher</td><td>711200</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Ohne Calcium und</td></tr><tr><td>Magnesium EnVision</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Misst die Lumineszenz</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td></td><td></td><td>Zur Zugabe zu Nährmedien</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmarkierungen Antikörper</td><td>Siehe Tabelle 1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasstößel</td><td>Dutscher</td><td>198599</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1 m)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630056</td><td>Verwendung im 20</td></tr><tr><td>mM Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel</td><td>BioLegend</td><td>740390</td><td>Bead-basierter Immunoassay</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>StemCell</td><td>7801</td><td>Dichtegradientenmedium</td></tr><tr><td>Mr. Frosty Behälter</td><td>Thermo Fisher</td><td>5100-0001</td><td>Behälter mit langsamem Gefrieren</td></tr><tr><td>Pierce 16% Formaldehyd (w/v), Methanolfrei</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Resiquimod (R848)</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-r848</td><td>TLR7/8 Agonist</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>SPL Zellkulturschale, 150 mm x 25 mm (SPL150)</td><td>Dutscher</td><td>330009</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Klinge steril N&deg; 23</td><td>Dutscher</td><td>132523</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads Compensation Beads</td><td>Thermo Fisher</td><td>01-2222-41</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td>Zur Herstellung von Waschpuffer in PBS</td></tr></tbody></table>

isolierung von tonsillar mononukleären zellen zur untersuchung von ex-vivo-angeborenen immunantworten in einem menschlichen mukosal-lymphgewebe

Isolation of Tonsillar Mononuclear Cells to Study Ex Vivo Innate Immune Responses in a Human Mucosal Lymphoid Tissue

Die Untersuchung isolierter Zellen aus Mukosa-assoziierten Lymphgeweben (MALT) ermöglicht das Verständnis der Reaktion von Immunzellen in Pathologien mit Schleimhautimmunität, da sie Wirtspathogen-Wechselwirkungen im Gewebe modellieren können. Während isolierte Zellen aus Geweben das erste Zellkulturmodell waren, wurde ihre Verwendung vernachlässigt, da Gewebe schwer zu erhalten sein kann. Im vorliegenden Protokoll erklären wir, wie man mononukleäre Mandelzellen (TMCs) von gesunden menschlichen Mandeln leicht verarbeiten und kulturieren kann, um angeborene Immunantworten bei aktivierung zu untersuchen und eine Virusinfektion in Schleimhautgeweben nachzuahmen. Die Isolierung von TMCs von den Mandeln ist schnell, da die Mandeln kaum Epithel haben und bis zu Milliarden aller großen Immunzelltypen erwirtschaften. Diese Methode ermöglicht den Nachweis der Zytokinproduktion mit verschiedenen Techniken, einschließlich Immunoassays, qPCR, Mikroskopie, Durchflusszytometrie usw., ähnlich wie bei der Verwendung von peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) aus Blut. Darüber hinaus weisen TMCs eine höhere Empfindlichkeit gegenüber Arzneimitteltests auf als PBMCs, die bei zukünftigen Toxizitätstests berücksichtigt werden müssen. Daher sind ex vivo TMCs Kulturen ein einfaches und zugängliches Schleimhautmodell.

Wir charakterisierten zunächst das Immunprofil der in der Kultur vorhandenen Zellen und analysierten die Menge der TMCs. Wir phäphierten die TMCs aus Mandeln mit Durchflusszytometrie. Wie in Abbildung 1dargestellt, waren alle wichtigen Immunzelltypen, die in PBMCs aus Blut vorkommen, in den TMCs aus Mandeln dargestellt. Bei TMCs war die Häufigkeit aller Zelltypen mit Ausnahme von B-Zellen jedoch niedriger als bei PBMCs.
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Im vorliegenden Protokoll erklären wir, wie man mononukleäre Tonbandzellen von gesunden Menschen, die sich einer partiellen chirurgischen Tonsillektomie unterziehen, leicht verarbeitet und kultiviert, um angeborene Immunantworten bei aktivierung zu untersuchen und eine Virusinfektion in Schleimhautgeweben nachzuahmen.

Isolierung von Tonsillar Mononukleären Zellen zur Untersuchung von Ex-Vivo-angeborenen Immunantworten in einem menschlichen Mukosal-Lymphgewebe

Studying isolated cells from mucosa-associated lymphoid tissues (MALT) allows understanding of immune cells response in pathologies involving mucosal ...

Tonsiller mononukleäre Zellen sind relevanter und komplexer als Blutzellen, und ihre Isolierung ermöglicht die Untersuchung der Immunzellreaktion in Pathologien mit Schleimhautimmunität. Die von uns etablierte Technik ermöglicht die Rückgewinnung einer großen Anzahl von Immunzellen aus einem Schleimhautgewebe und behält gleichzeitig ihre Integrität für Ex-vivo-Studien. Die Methode ist recht einfach, aber die Mandeln müssen schnell und mit Sorgfalt behandelt werden, um den Ertrag zu maximieren.Transportieren Sie das menschliche Tonsillergewebe ins Labor, wie im Manuskripttext beschrieben. Als nächstes legen Sie das Zellsieb auf eine 150 mal 25 Millimeter große Kulturschale. Legen Sie alle Sezierinstrumente in ein anderes Gericht, um sie steril zu halten.Alle Ihre Hauptproben sollten mit Vorsicht behandelt werden, da sie noch nicht qualifiziert wurden und Infektionserreger enthalten können. Dann gießen Sie die PBS aus der Durchstechflasche in ein Sieb, weil es einige Zellen enthalten wird, die die Mandeln ausgetreten sind. Mit sterilen Zangen die Mandeln aus der Durchstechflasche mit steriler Zange in die Kulturschale übertragen.Fügen Sie ggf. weitere PBS hinzu, um das Raster einzutauchen. Die Sezierung dauert etwa 45 Minuten pro Tonnen. Es ist entscheidend, dass während dieser Zeit die Mandeln untergetaucht werden, um eine gute Lebensfähigkeit und Zellerträge zu gewährleisten.Entfernen Sie kauterisiertes blutiges und fibroides Gewebe mit Zangen und einem Skalpell. Schneiden Sie das Gewebe mit dem Skalpell und der gekrümmten Pinzette in kleine Stücke von weniger als einem halben Zentimeter Durchmesser. Schneiden Sie das gesamte Gewebe, so dass die kleinen Stücke jederzeit eingetaucht werden können.Legen Sie ein paar Gewebestücke in das Zellsieb. Schrotten Sie sie mit einem Glasschädling auf das Gitter, bis nur noch eine sehr dünne Schicht weißer Stroma übrig bleibt. Entfernen und verwerfen Sie die Stroma, um eine Verstopfung des Rasters zu vermeiden.Verwenden Sie dann eine 10-Milliliter-Pipette, um die Zellsuspension auf das Gitter zu übertragen und ein letztes Mal zu kratzen. Als nächstes verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um die Zellsuspension in eine sterile Durchstechflasche zu übertragen. Waschen Sie das Gitter und das Zellsieb einmal mit PBS und übertragen Sie die PBS auch auf die Durchstechflasche.Bevor Sie fortfahren, lassen Sie die Zellaufhängung fünf Minuten bei Raumtemperatur auf der Bank ruhen. Legen Sie ein steriles 70-Mikrometer-Sieb auf eine neue 50-Milliliter-Durchstechflasche. Übertragen Sie die Zellsuspension vorsichtig mit einer 10-Milliliter-Pipette auf das Sieb.Wenn das Sieb verstopft ist, verwenden Sie die Rückseite einer sterilen Ein-Milliliter-Pipettenspitze, um die Zellen durch das Sieb zu kratzen. Ändern Sie das Sieb so oft wie nötig. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen. Setzen Sie das Pellet durch sanftes Tippen auf die Durchstechflasche wieder auf, und setzen Sie die Zellen dann in 35 Milliliter PBS wieder auf. Um die erste Phase der Zellisolierung abzuschließen, legen Sie ein neues 70-Mikrometer-Sieb auf eine neue Durchstechflasche und übertragen Sie die Zellsuspension mit einer 10-Milliliter-Pipette darauf.Um eine klarere Zelllösung zu erhalten, fügen Sie zunächst 15 Milliliter eines Dichtegradientenmediums zu einer neuen 50-Milliliter-Durchstechflasche hinzu. Gießen Sie die TMC-Lösung auf das Dichtegradientenmedium, wobei Sie darauf achten, das Mischen zu minimieren. Als nächstes zentrifugieren Sie die Lösung bei 1000 mal g für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Beschleunigung und Abbremsen.Nachdem Sie die Durchstechflasche aus der Zentrifuge entfernt haben, verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um die obere Schicht zu entfernen und zu verwerfen. Stören Sie nicht die Schnittstelle zwischen den TMCs und dem Dichtegradientenmedium. Entfernen Sie dann die TMCs mit der sterilen Ein-Milliliter-Pipettespitze und geben Sie sie in eine neue 50-Milliliter-Durchstechflasche.Um die Zellen zu waschen, fügen Sie zuerst 50 Milliliter PBS mit 2% fetalem Rinderserum und 2 Millimolar EDTA hinzu. Dann zentrifugieren Sie das Rohr bei 250 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen wieder, aber dieses Mal Zentrifuge das Rohr bei 400 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.Bereiten Sie R10 Kulturmedium durch Ergänzung RPMI 1640 mit 10% hitzeinaktivierten FBS, 2 Millimolar L-Glutamin, und die Antibiotikum-Lösung. Setzen Sie die TMCs in 10 Milliliter R10 wieder aus. Zählen Sie dann die Zellen.Die Zellen können entweder sofort oder eingefroren für die zukünftige Verwendung verwendet werden, wie im Manuskript beschrieben. TMCs wurden mit Antikörpern befleckt, inkubiert und mit Durchflusszytometrie charakterisiert. TMCs enthielten alle wichtigen Immunzelltypen, die in peripheren mononukleären Zellen aus Blut, abgekürzt PMBC, vorhanden sind.Die Frequenzen aller Zelltypen, mit Ausnahme von B-Zellen, waren jedoch in TMCs niedriger als bei PBMCs. Um die Zellaktivierung in der Zytokinproduktion zu untersuchen, wurden TMCs über Nacht mit Resiquimod R848 stimuliert. TMCs, blau geplottet, produzierten alle getesteten Zytokine mit Ausnahme von IFN Lambda 2/3 und IL-8, obwohl die Produktion niedriger war als in PBMCs, grün dargestellt.Die Falterhöhungen im Vergleich der R848 Stimulation mit keiner Stimulation sind rot notiert. Gereinigte und isolierte TMCs, blaue und tonsillierte Gewebeblöcke, orange, wurden 24 Stunden lang mit dem Influenza-A-Virus IAV stimuliert. Die IFN-Produktion wurde in TMCs nachgewiesen, aber nicht im Überstand der Gewebeblöcke, was darauf hindeutet, dass Gewebeexate nicht das beste Modell für die Untersuchung der Zytokinsekretion und Zellaktivierung sind.Nach der Vorinkubation mit dem toxischen Medikament C1 und der Stimulation mit R848 wurden TMCs und PBMCs auf Ihre Lebensfähigkeit geprüft. TMCs waren empfindlicher gegenüber C1. Dies legt nahe, dass neue Medikamente in zukünftigen Behandlungen in Zellen aus Geweben getestet werden sollten, nicht nur an Zelllinien, PBMCs oder Gewebeexplantationen. Dieses Verfahren ermöglicht es uns, die TMCs wie PBMCs aus Vollblut zu verwenden und die gleichen zellulären Experimente durchzuführen, wie die Reinigung eines bestimmten Zelltyps, Zellkultur, Durchflusszytometrie oder Einfrieren.Isolierungen von TMCs ermöglichen es, in einem relevanten Modell die Immunantwort in sekundären Lymphorganen in Pathologien mit Schleimhautimmunität besser zu charakterisieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Isolierung von Tonsillar Mononukleären Zellen zur Untersuchung von Ex-Vivo-angeborenen Immunantworten in einem menschlichen Mukosal-Lymphgewebe (Video) | JoVE Journal

Isolierung von Tonsillar Mononukleären Zellen zur Untersuchung von Ex-Vivo-angeborenen Immunantworten in einem menschlichen Mukosal-Lymphgewebe

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