Name: Eine Screening-Methode zur Identifizierung von Heterochromatin-fördernden Medikamenten mit Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Erfahren Sie eine Screening-Methode zur Identifizierung heterochromatin-fördernder Verbindungen mit Drosophila. Dieses kostengünstige in vivo System nutzt Augenfarbphänotypen für die schnelle Arzneimittelentwicklung in der Krebsforschung.

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Wir danken J. Birchler, E. Bach und dem Bloomington Drosophila Stock Center für verschiedene Drosophila-Sorten; das National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program for the Oncology Set small-molecule drug library; UCSD Studenten wie Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza und Alex Chavez. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde durch ein Forschungsstipendium der American Thoracic Society an J.L. und die Finanzierung durch NIH: R01GM131044 an W.X.L. unterstützt.

1. Vorbereitung der Drogenbibliothek
<ol><li>Identifizieren und vorbereiten Sie eine Arzneimittelbibliothek, die mit geeignetem Lösungsmittel in einer gewünschten Konzentration (z. B. 10 mM in DMSO) untersucht werden soll. HINWEIS: Ein spezifisches Beispiel für eine Arzneimittelbibliothek ist das Onkologie-Set III des National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program (DTP). Verbindungen in diesem Set werden als 20 l bei 10 mM in 100% DMSO in zwei 96-Well PP U-Bodenplatten geliefert und bei -20 °C gelagert. Die NCI Plate Karten und die grundlegenden chemischen Daten der einzelnen Medikamente können auf den folgenden Websites gefunden werden: <a href="https://dtp.cancer.gov/dtpstandard/servlet/PlateMap?searchlist=4740&outputformat=html&searchtype=plate&Submit=Submit" target="_blank">NCI-Kennzeichen 4740</a> <a href="https://dtp.cancer.gov/dtpstandard/servlet/PlateMap?searchlist=4741&outputformat=html&searchtype=plate&Submit=Submit" target="_blank">NCI-Kennzeichen 4741</a>
</li>
</ol>2. Bildschirm für Heterochromatin fördernde Medikamente mit Drosophila
<ol><li>
Drosophila Zuchtstrategie (Abbildung 1A)<ol>
<li>Tag 1: Kreuz drei w1118/Y; DX1/CyO männliche Fliegen und drei oder mehr jungfräuliche w1118 weibliche Fliegen in einem 25 mm x 95 mm Lebensmittel-Fläschchen mit 9 ml Standard Drosophila Food Media (Bloomington Rezept). Richten Sie drei Replizien-Fläschchen für jedes Medikament und eine Steuerung für den Bildschirm ein. HINWEIS: DX1 Fliegen wurden freundlicherweise von James Birchler (University of Missouri)9,13zur Verfügung gestellt.</li>
		<li>Tag 2 und Tag 3: Lassen Sie die Fliegen Eier für 2 Tage bei Raumtemperatur (22 °C) legen.</li>
		<li>Tag 4: Verwenden Sie einen kurzen Ausbruch vonCO2-Gas, um die Elternfliegen zu beächen und die Elternfliegen in einer "Fliegen-Leichenhalle" (eine Flasche mit 70% Alkohol) zu entsorgen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Füttern Sie Medikamente zu Drosophila für das Screening.<ol>
<li>Verdünnen Sie jede Wirkstoffverbindung aus dem ursprünglichen Bestand (20 l bei 10 mM in 100% DMSO in 96-well PP U-Bodenplatten) auf eine Endkonzentration von 10 m mit 33 % DMSO in Wasser. Verwenden Sie 33% DMSO in Wasser ohne Medikament als Kontrolle. HINWEIS: Einige Medikamente sind in Wasser schlecht löslich und wurden in DMSO gelöst. 100% DMSO ist toxisch für Fliegen. 33 % sind tolerierbar.</li>
		<li>Tag 4: Pipette 60 l einer 10-M-Medikamentenlösung oder Kontrolle auf der Oberseite von Fliegenfutter. Stellen Sie an dieser Stelle sicher, dass die Elternfliegen entfernt wurden und es Fliegeneier und kriechende First-instar-Larven auf dem Futter gibt.</li>
		<li>Tag 6: Wiederholen Sie die Pipettierung von 60 l der gleichen 10-M-Medikamentenlösung auf die Lebensmitteldurchstechflasche. HINWEIS: Da dem Fliegenfutter Medikamente zugesetzt wurden, enthält die obere Oberfläche eine Konzentration von fast 10 m und die Grundnahrung konnte nicht vollständig durchdrungen werden. Alle Fliegen legen Eier auf die Nahrungsplatte und fressen die obere Oberfläche Nahrung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beobachten und bewerten Sie Augenfarbe Änderungen.<ol>
<li>Zwei Tage nach dem Auftauchen der F1-Fliegen (ungefähr am 14. Tag) untersuchen Sie die Fliegen. Verwenden Sie einen kurzen Ausbruch von CO2, um die F1-Fliegen zu beanästhesieren und die Fliegen aus ihrer Durchstechflasche auf ein poröses Sezieren pad mit CO2 zu entfernen, das unter einem Filterpapier durchnippt.</li>
		<li>Inspizieren Sie die Fliegen auf diesem Pad unter einem Seziermikroskop. Untersuchen Sie die gesamte Fliege und identifizieren Sie alle w1118/Y; DX1/+ heterozygotmännchen Männchen, da sie den CyO-dominanten lockigen Flügelphänotyp fehlten.</li>
		<li>Score die Augenfarbe der einzelnen w1118/Y; DX1/+ heterozygote männliche Fliegen auf einer Skala von 1 bis 5 (Abbildung 1B). Der Prozentsatz der weißen Augenfarbe wurde wie folgt bewertet: 1. <5% rotes gestreutes Auge Gesamtfläche 2. 6% - 25% rote Flecken Augen Gesamtfläche 3. 26% - 50% rote Flecken Augen Gesamtfläche 4. 51% - 75% rote Flecken Augen Gesamtfläche 5. >75% rote Flecken Augen Gesamtfläche HINWEIS: Alternativ können Sie Fliegenköpfe in 100% Methanol homogenisieren und ein Spektrometer verwenden, um die Augenpigmentierung bei OD 450 nm zu messen. Wählen Sie nur Männer, weil PEV mehr pronouced in DX1 Männchen. Erzielen Sie mehr als 10 Männer in jeder Durchstechflasche.</li>
		<li>Berechnen Sie den mittleren Farbindex aller Männchen aus jeder durchstecherten Durchstechflasche. Führen Sie Triplicate für jede Verbindung durch (Abbildung 1C). HINWEIS: Da die Augenfarbe mit dem Alter variiert, ist dies ein zeitsensitiver Schritt. Die Augenfarbe sollte im gleichen Alter berechnet werden – 2 Tage alt. Normalerweise sollten >10 Fliegen in jeder Durchstechflasche gewertet werden.</li>
		<li>Um zu bestätigen, dass die Verbindungen tatsächlich die Heterochromatinbildung fördern, verwenden Sie eine andere Technik wie Western Blotting, um zu validieren (Abbildung 1G).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Morgan, M. A., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+signatures+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Development%22%5BJournal%5D)">Chromatin signatures of cancer.</a> Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).</li>
<li>Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+heterochromatin+formation+and+transcription+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 3(2015).</li>
<li>Allshire, R. C., Madhani, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+principles+of+heterochromatin+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ten principles of heterochromatin formation and function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Grewal, S. I., Moazed, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+and+epigenetic+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin and epigenetic control of gene expression.</a> Science. 301 (5634), 798-802 (2003).</li>
<li>Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delving+into+the+diversity+of+facultative+heterochromatin%3A+the+epigenetics+of+the+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 15 (5), 482-489 (2005).</li>
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<li>Dorer, D. R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansions+of+transgene+repeats+cause+heterochromatin+formation+and+gene+silencing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila.</a> Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).</li>
<li>Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+protein+1+binds+transgene+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays.</a> Chromosoma. 107 (5), 286-292 (1998).</li>
<li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK+signaling+globally+counteracts+heterochromatic+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing.</a> Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).</li>
<li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+STAT+is+required+for+directly+maintaining+HP1+localization+and+heterochromatin+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability.</a> Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).</li>
<li>Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-Element+repression+in+Drosophila+melanogaster+by+variegating+clusters+of+P-lacZ-white+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes.</a> Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).</li>
<li>Loyola, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+methotrexate+as+a+heterochromatin-promoting+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11673(2019).</li>
<li>Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+Heterochromatin+Protein+1+%28HP1%29+to+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression.</a> Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).</li>
<li>Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin%3A+Guardian+of+the+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin: Guardian of the Genome.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 265-288 (2018).</li>
<li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+tumour+suppression+occurs+via+heterochromatin-mediated+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing.</a> Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unphosphorylated+STAT5A+stabilizes+heterochromatin+and+suppresses+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Heterochromatin ist eine kondensierte Form der DNA, die eine zentrale Rolle bei der Regulierung der Genexpression spielt. Es wird immer mehr bei Krebs erkannt und kann als potenzielles Ziel für die Krebstherapie dienen15,16,17,18. Kleinmolekulare Verbindungen werden häufig in der Arzneimittelentwicklung aufgrund von Vorteilen bei der Herstellung, Konservierung und Stoffwechsel in menschlichen K...

Heterochromatin ist eine kondensierte Form der DNA, die eine zentrale Rolle bei der Genexpression, bei der Regulierung der Chromosomensegregation während der Zellteilung und beim Schutz vor Genominstabilität1spielt. Heterochromatin gilt als Regulierer für die Genrepression und zum Schutz der Chromosomenintegrität bei der Zellmitose2,3. Es ist mit der Di- und Tri-Methylierung von Histon H3 Lysin 9 (H3K9me) während der AbstammungSverpflichtung4,5verbunden. Darüber hinaus wird die Rekrutierung von Chromodomain-Proteinen von Heterochromatin Protein 1 (HP1) auch als mit Heterochromatin und epigenetischer Unterdrückung der Genexpression6assoziiert. Diese Proteine sind wesentliche Bestandteile und Marker der Heterochromatinbildung.
Da die genomische Instabilität es Zellen ermöglicht, genetische Veränderungen zu erwerben, die die Karzinogenese fördern, wird Heterochromatin in der Krebsentwicklung immer stärker anerkannt und kann für dieKrebsbehandlung7,8ins Visier genommen werden. Derzeit gibt es keine Medikamente, die gut etabliert sind bei der Unterstützung der Heterochromatin-Bildung. Hier präsentieren wir eine einfache und schnelle und dennoch effiziente Methode zum Screening von kleinmolekularen Verbindungen, die die Heterochromatinbildung fördern. Das Screening erfolgt durch die Behandlung von Drosophila mit einer Bibliothek von kleinmolekularen Medikamenten. Diese Methode nutzt einen bunten Augenfarben-Phänotyp in der DX1Drosophila-Sorte, der von Heterochromatin-Spiegeln beeinflusst wird. DX1-Fliegen enthalten ein Tandem-Array von sieben P[lac-w]-Transgenen, die je nach Heterochromatinisierung die bunte Expression/Depression aufweisen, daher spiegelt das Ausmaß der Variegation in der Augenfarbe den Heterochromatinspiegel wider. Insbesondere konnte das zunehmende Heterochromatin durch den steigenden Anteil der bunten Augenfarbe (weißes Auge) nachgewiesen werden. Im Gegenteil, abnehmendes Heterochromatin würde durch den steigenden Anteil der P[lac-w] Transgenexpression (rotes Auge)9,10,11,12erkannt.
Daher nutzen wir dieses Drosophila-Transgensystem, das einen bunten Augenfarbphänotyp erzeugt, da seine Expression direkt mit der Menge an Heterochromatin korreliert. Bei der Entdeckung von Verbindungen, die im Verdacht stehen, die Heterochromatinbildung zu fördern, können wir diesen Verdacht mit anderen Methoden wie Western Blot bestätigen. Diese heterochromatinfördernden Substanzen können in Zukunft für klinische Studien bei Patienten weiterentwickelt werden.

<table><tbody><tr><td>Drosophila</td><td></td><td>DX1 Stamm</td><td>DX1 Fliegen wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von James Birchler (University of Missouri)</td></tr><tr><td>Drosophila food media</td><td>UCSD fly</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kitchen Methotrexat</td><td>NCI drug library</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl </td><td>Alkohol Sigma</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr></tbody></table>

eine screening-methode zur identifizierung von heterochromatin-fördernden medikamenten mit drosophila

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila ist ein ausgezeichneter Modellorganismus, der verwendet werden kann, um Verbindungen zu überprüfen, die für die Krebstherapie nützlich sein könnten. Die hier beschriebene Methode ist eine kostengünstige In-vivo-Methode zur Identifizierung von Heterochromatin fördernden Verbindungen mit Drosophila. Die DX1-Sorte der Drosophila, die einen bunten Augenfarb-Phänotyp hat, der die Ausdehnungen der Heterochromatin-Bildung widerspiegelt und damit ein Werkzeug für einen heterochromatinfördernden Wirkstoff-Bildschirm bietet. Bei dieser Screening-Methode wird die Augenvariegation auf der Grundlage der Oberfläche der roten Pigmentierung quantifiziert, die Teile des Auges einnimmt, und auf einer Skala von 1 bis 5 bewertet. Das Screening-Verfahren ist einfach und empfindlich und ermöglicht die Prüfung von Verbindungen in vivo. Arzneimittel-Screening mit dieser Methode bietet eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, Heterochromatin fördernde Medikamente zu identifizieren, die positive Auswirkungen in Krebstherapeutika haben könnten. Die Identifizierung von Verbindungen, die die Bildung von Heterochromatin fördern, könnte auch zur Entdeckung epigenetischer Mechanismen der Krebsentwicklung führen.

Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um Verbindungen zu untersuchen, die die Heterochromatinbildung in Drosophilafördern, das ein effizientes und kostengünstiges In-vivo-System für die Arzneimittelentwicklung ist (Abbildung 1). Wir haben eine kleinmolekulare Arzneimittelbibliothek, Oncology Set III, untersucht, die aus 97 von der FDA zugelassenen Onkologie-Medikamenten besteht, mit dem DX1-Stamm von Drosophila melanogaster (Abbildung 1...

Drosophila ist ein weit verbreitetes experimentelles Modell, das für das Screening von Medikamenten mit potenziellen Anwendungen für die Krebstherapie geeignet ist. Hier beschreiben wir die Verwendung von Drosophila-Variegated-Augenfarbphänotypen als Methode zum Screening von kleinmolekularen Verbindungen, die die Heterochromatinbildung fördern. Drosophila

Eine Screening-Methode zur Identifizierung von Heterochromatin-fördernden Medikamenten mit Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Derzeit gibt es keine Medikamente, die bei der Förderung der Heterochromatin-Bildung gut etabliert sind. Hier präsentieren wir eine einfache und effiziente Methode zur Identifizierung kleiner Molekülverbindungen, die diesen Prozess fördern. Unser Screening-Protokoll bietet ein einfaches, kostengünstiges, leicht zu verfolgendes In-vivo-System zur Heterochromatin-fördernden Arzneimittelidentifikation.Die Identifizierung von Verbindungen, die die Heterochromatinbildung fördern, kann zur Entdeckung von Mechanismen von Krebs führen, die sich vermändern und Krebstherapie. Diese kostengünstige wurde für die Identifizierung von Heterochromatin fördernden Verbindungen in Drosophila gemessen könnte auch verwendet werden, um FormTreffer zu zählen, da es eine vorbeugende Maßnahme zu einem höchsten Zellpool von Zellscreening ist. Unser Screening-Protokoll könnte auch für schnelle Pilotbildschirme nützlich sein, da dieses Drosophila TranSheet-System einen bunten Augenfarbphänotyp erzeugt, der umgekehrt mit der Menge an Heterochromatin korreliert, die in der Fliege vorhanden ist.Mit dabei, das Verfahren zu demonstrieren, wird Kenny Dao helfen, ein Student aus unserem Labor. Nach der Identifizieru

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Genetik

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