Name: Analyse von angeborenen Herzfehlern bei Mausembryonen mit qualitativen und quantitativen histologischen Methoden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Erfahren Sie standardisierte Gewebeanalysetechniken zur Untersuchung angeborener Herzfehler bei Mausembryonen. Diese qualitativen und quantitativen Methoden unterstützen die kardiologische Diagnostik.

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Das Aguirre Lab wird vom National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health unter der Nummer K01HL135464 und von der American Heart Association unter der Nummer 19IPLOI34660342 unterstützt.

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</ol>

Die Autoren haben keine Angaben zu berichten.

Dieses Protokoll untersucht die Techniken, die an der Analyse der Herzentwicklung in embryonalen Herzen beteiligt sind. Einige Einschränkungen dieser Methode sind die erforderliche körperliche Geschicklichkeit für die Vorbereitenden Techniken, die Übung erfordern können, und Geschicklichkeit mit Mikroskop-Bildgebung. Wenn die am Kryostat erhaltenen Scheiben chaotisch sind, die Hämatoxylin- und Eosinfärbung nicht klar ist, oder wenn die am Mikroskop aufgenommenen Bilder eine schlechte Beleuchtung haben, dann funktioniert ...

CHDs sind die häufigste Art von Geburtsfehler beim Menschen und sind die Hauptursache für Geburtsfehler-bedingte Todesfälle1,2,3,4,5,6. Obwohl etwa 90% der neugeborenen Kinder CHD überleben, wird es häufig mit signifikanter Morbidität und medizinischen Interventionen im Laufe der Jahre verbunden, was eine schwere Belastung für das Leben der Patienten und das Gesundheitssystem7,8,9,10. Außerhalb rein genetischer Faktoren sind die Ursachen der CHD schlecht verstanden4. Unbekannte Ursachen machen 56-66% aller CHD-Fälle nach der American Heart Association und anderen Quellen2,3,4,11. Bekannte Faktoren sind genetische Mutationen, CNVs, de novo Single Nukleotid-Varianten und Aneuploidie. Es wird vermutet, dass Umwelt- und Ernährungsfaktoren auch wichtige Quellen sind, die zur CHD beitragen, wie epidemiologische Studien nahelegen, die den mütterlichen Lebensstil2,12, wirtschaftliche Benachteiligung und Rasse13, und durch die Erforschung von Ernährungsfaktoren wie Folsäure11,14 und die bioaktive Lipid-Retinsäure15,16. Die Untersuchung der Mechanismen und Ursachen von CHD und anderen kardiovaskulären Defekten ist wichtig, um präventive Strategien und neuartige therapeutische Optionen zu entwickeln1,4,17,18,19.
Die sich entwickelnde Maus ist ein Eckpfeiler modellt, um CHD bei Säugetieren zu untersuchen. Einige der angewandten Methoden und Analysen, wie z. B. Sezierungen zur Erhaltung der Herzmorphologie, Analyse von Entwicklungsstadien und Identifizierung von CHD-assoziierten Defekten, können jedoch für Wissenschaftler, die neu in der Analyse muriner Herzen sind, beängstigend sein. Das Ziel der in diesem Protokoll beschriebenen Methoden ist es, qualitative und quantitative Leitlinien für diese Prozesse anzubieten. So erklären wir in diesem Protokoll, wie man zeitnahe Paarungen durchführt, um Embryonen des gewünschten Schwangerschaftsstadiums zu produzieren, schwangere Weibchen für eine intakte Herzregeneration (einschließlich assoziierter Gewebe wie dem Abflusstrakt), Herzfixierung und Kryostatschnitt, grundlegende histologische Methoden, quantitative Analysen von allgemeinen Herzfehlern und qualitative Analyse der Herzmuskelverdichtung, ein häufiger Vorläufer-Phänotyp für einige Arten von KHK.

<table><tbody><tr><td>15 mL konische RöhrchenFisher</td> <td>Scientific</td><td># 1495970C</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Mäuse</td><td>Jackson Labs</td><td>C57BL/6J - Lager 000664</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Färbegläser (x6)</td><td>VWR Scientific</td><td># 25457-006</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser 24X50MM #1,5</td><td>VWR Scientific</td><td># 48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat - Leica CM3050S</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschale(n)</td><td>Fisher Scientific</td><td># 50930381</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Feine Pinzette (x2)</td><td>Fine Science Tools</td><td># 11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y Lösung</td><td>Millipore Sigma</td><td># HT110116-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalkohol (rein, 200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td># BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td># E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Millipore Sigma</td># <td>03989-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Feine Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td># 14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszierendes Stereomikroskop Leica M165 FC</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Millipore Sigma</td># <td>410225-250G</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td># 11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 8 Software</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td># 06666A</td><td></td></tr><tr><td>Mayer's Hämatoxylin-Lösung</td><td>Millipore Sigma</td><td># MHS16-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenspitze(n) - p200</td><td>Fisher Scientific</td><td># 02707448</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel Software</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>VWR Scientific</td><td># 102094-106</td><td></td></tr><tr><td>Olympus CkX53 Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinsel (mindestens 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>VWR Scientific</td><td># 0215014601</td><td>In 4%ige Lösung verwandeln (gelöst in PBS)</td></tr><tr><td>Pasteurpipette(n)</td><td>Fisher Scientific</td><td># 13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 15140122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 70011044</td><td>Vor Gebrauch von 10x auf 1x verdünnen</td></tr><tr><td>Waage</td><td>Mettler Toledo</td><td># MS1602TS</td><td></td></tr><tr><td>Waage</td><td>Mettler Toledo</td><td># MS105</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff #3</td><td>VWR Scientific</td><td># 10161-918</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklingen</td><td>VWR Scientific</td><td># 21909-612</td><td></td></tr><tr><td>Quadratische Form</td><td>VWR Scientific</td><td># 100500-224</td><td>Für OCT-Formen</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Millipore Sigma</td># <td>S9378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td># 1255015</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td># 14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Accu-Edge Einweg-Mikrotomklingen</td><td>VWR Scientific</td><td># 25608-964</td><td></td></tr><tr><td>Reisewaage</td><td>Acculab</td><td>VIC 5101</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Millipore Sigma</td><td>214736-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse von angeborenen herzfehlern bei mausembryonen mit qualitativen und quantitativen histologischen methoden

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Angeborene Herzfehler (CHD) sind die häufigste Art von Geburtsfehler beim Menschen und betreffen bis zu 1% aller Lebendgeburten. Die zugrunde liegenden Ursachen für DIE CHD sind jedoch noch immer schlecht verstanden. Die sich entwickelnde Maus stellt ein wertvolles Modell für die Untersuchung von CHD dar, da kardiale Entwicklungsprogramme zwischen Mäusen und Menschen stark konserviert sind. Das Protokoll beschreibt detailliert, wie Mausembryonen des gewünschten Schwangerschaftsstadiums hergestellt werden können, Methoden zur Isolierung und Erhaltung des Herzens für die nachgeschaltete Verarbeitung, quantitative Methoden zur Identifizierung gängiger CHD-Typen durch Histologie (z. B. ventrikuläre Septum Defekte, vorgerichtliche Septumdefekte, Patent ductus arteriosus) und quantitative Histomorphometriemethoden zur Messung gängiger Muskelverdichtungsphänotypen. Diese Methoden artikulieren alle Schritte, die bei der Probenvorbereitung, -entnahme und -analyse erforderlich sind, sodass Wissenschaftler DIE CHD korrekt und reproduzierbar messen können.

Der Muskelverdichtungsindex wurde zwischen Herzen verglichen, die sich unter zwei verschiedenen Umgebungen, einer Steuerung und einer experimentellen Gruppe, entwickeln. Diese Protokolle wurden verwendet, um die Verdichtung von Muskelgewebe quantitativ zu analysieren, was statistische Analysen ermöglichte. Die Muskelverdichtung zeigte sich in den Versuchsherzen signifikant reduziert im Vergleich zu den Embryonen, die sich unter nichtexperimentellen Bedingungen entwickelten.
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In diesem Protokoll beschreiben wir Verfahren zur qualitativen und quantitativen Analyse von Entwicklungsphänotypen bei Mäusen, die mit angeborenen Herzfehlern assoziiert sind.

Analyse von angeborenen Herzfehlern bei Mausembryonen mit qualitativen und quantitativen histologischen Methoden

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

Dieses Protokoll standardisiert neue Gewebeanalysetechniken, so dass sie von anderen Gruppen, die auch angeborene Herzfehler untersuchen, weiter verbreitet werden können. Da sowohl qualitative als auch quantitative Analysetechniken ihre Vor- und Nachteile haben, verwendet diese Methode sowohl die breiteste Palette experimenteller Fragen. Diese Techniken können sich positiv auf die kardiologischen Diagnosemethoden auswirken.Beispielsweise könnten Pathologen unsere mikroskopischen Herzgewebeanalysetechniken anwenden, um menschliche Herzkrankheiten aus Biopsieproben zu diagnossieren. Dieses Protokoll kann für die Entwicklungskardiologie oder die allgemeine Kardiologieforschung verwendet werden. Diese Methoden bieten jedoch auch verschiedene nützliche Techniken, die auf jede Gewebeanalyse angewendet werden können.Um den embryonalen Tag 15 bis 15,5 Herzen zu sammeln, sichern Sie die Gliedmaßen einer trächtigen Mutter und beginnen Sie um die Harnröhre bis zum Brustbein, machen Sie vorsichtig einen I-förmigen Schnitt entlang des Oberkörpers. Mit Zangen in einer Schaufelbewegung, heben Sie sanft die Gebärmutter aus der Bauchhöhle greifen die oberflächlichen Gewebe der Gebärmutter nach Beda

analysis-congenital-heart-defects-mouse-embryos-using-qualitative

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Fetalen und perinatalen Tod ist ein gemeinsames Merkmal bei der Untersuchung genetischer Veränderungen beeinflussen kardiale Entwicklung. Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung hat 2-D-Auflösung verbessert und kann ausgezeichnete Informationen über frühe Herz-Entwicklung bieten und ist eine ideale Methode, um die Auswirkungen auf die kardiale Struktur und Funktion vor dem Tod zu erkennen.

Murine fetale Echokardiographie

Ultrahochfrequenz-Ultraschall ist ein leistungsstarkes Live-Imaging-Tool, um Herzrhythmusstörungen bei Kleintieren zu untersuchen. Seine Nichtinvasivität ermöglicht die Aufrechterhaltung der physiologischen Zustand der Embryonen. Hier zeigen wir die Verwendung von M-Mode-Ultraschall, um die Herzfrequenz von Embryonen bei E18.5 in utero zu messen.

In utero Messung der Herzfrequenz in Mouse von Nichtinvasive M-Mode-Echokardiographie

Mutationen, die zu angeborenen Herzfehlern führen, profitieren von der in vivo Untersuchung der Herzstruktur während der Entwicklung, aber hochauflösende Strukturstudien im embryonalen Herzen der Maus sind technisch anspruchsvoll. In dieser Arbeit stellen wir eine robuste Immunfluoreszenz- und Bildanalysemethode vor, um Kardiomyozyten-spezifische Strukturen im sich entwickelnden Mausherz zu beurteilen.

Analyse Cardiomyocyte Entwicklung mit Immunfluoreszenz in embryonalen Maus Herz

Echokardiographische Untersuchung wird häufig bei Mäusen verwendet. Teure hochauflösende Ultraschall-Geräte wurden für diesen Zweck entwickelt. Dieses Protokoll beschreibt eine erschwingliche echokardiographische Verfahren kombiniert mit histologischen morphometrische Analysen kardiale Morphologie zu bestimmen.

Echokardiographische und histologische Untersuchung der kardiale Morphologie in der Maus

Hier beschreiben wir ein Protokoll für ganze Berg Immunfluoreszenz und Image-basierten quantitativen volumetrische Analyse der frühen Stadium Mausembryonen. Wir präsentieren diese Technik als ein leistungsfähiger Ansatz qualitativ und quantitativ kardialen Strukturen während der Entwicklung zu bewerten, und schlagen vor, dass es möglicherweise sehr anpassungsfähig an andere Organsysteme.

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung der fetalen Maus bildgebenden Auflösung verbessert und bieten präzise nicht-invasive Charakterisierung der kardialen Entwicklung und strukturelle Mängel. Die hier beschriebenen Protokoll soll in Echtzeit fetalen Mäuse Echokardiographie in Vivodurchführen.

Fetale kardiovaskuläre Bildgebung mit einem Hochfrequenz-Ultraschall (30 / 45MHZ) Maus

Wir präsentieren Ihnen die Protokolle, um die Maus Herz Entwicklung mit ganzen Berg Epifluorescent Mikroskopie auf Mausembryonen seziert von ventrikulären spezifische MLC-2v-TdTomato Reporter Knock-in Mäusen zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht es uns, jede Stufe der ventrikulären Formation während der Maus Herz Entwicklung ohne arbeitsintensive histochemische Methoden direkt zu visualisieren.

Analyse der Entwicklung der kardialen Kammer in der Maus Embryogenese mit ganzen Mount Epifluoreszenz

Dieser Artikel beschreibt die diagnostischen Methoden der angeborenen Herzfehler (KHK) der Maus unter Verwendung der fetalen Echokardiographie, der Nekropsie und der episkopischen Fluoreszenzbilderfassung (EFIC) unter Verwendung der episkopischen konfokalen Mikroskopie (ECM), gefolgt von einer dreidimensionalen (3D) Rekonstruktion.

Eine Pipeline zur Charakterisierung struktureller Herzfehler in der fetalen Maus

Hier berichten wir über die doppelte Kennzeichnung von neuralen Kammzellen und Blutgefäßen mit KükenGFP Neuralröhre Intraspezies Transplantation kombiniert mit intravaskulären DiI-Injektion. Diese experimentelle Technik ermöglicht es uns, die Entwicklung des NCC-abgeleiteten (enterischen) Nervensystems und des Gefäßsystems während der Organogenese gleichzeitig zu visualisieren und zu untersuchen.

Dual-Kennzeichnung von neuralen Kammzellen und Blutgefäßen innerhalb von Hühnerembryonen mit ChickGFP Neural Tube Grafting und Carbocyanin Dye DiI Injektion

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Ultraschall Mikrobläschenkontrastmittel in Wohn-, isoliert späten Schwangerschaftsphase murine Embryonen zu injizieren. Dieses Verfahren ermöglicht die Untersuchung der Perfusion Parameter und vaskulärer molekularer Marker innerhalb des Embryos mit kontrastverstärkten hochfrequenten Ultraschall-Bildgebung.

Contrast Imaging in Maus Embryonen Verwendung von Hochfrequenz-Ultraschall

Erfahren Sie standardisierte Gewebeanalysetechniken zur Untersuchung angeborener Herzfehler bei Mausembryonen. Diese qualitativen und quantitativen Methoden unterstützen die kardiologische Diagnostik.

Analyse von angeborenen Herzfehlern bei Mausembryonen mit qualitativen und quantitativen histologischen Methoden

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