Name: Isolierung von Kardiomyozyten aus festen Herzen für die Immunzytochemie und Ploidie-Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von Kardiomyozyten aus festem Herzmuskelgewebe für Immunzytochemie und Ploidie-Analyse. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Zellerträge und visuelle Verifizierung der Kernzahl und Ploidie.

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JHvB wird durch Stipendien des NIH, Regenerative Medicine Minnesota und einen individuellen Biomedical Research Award der Hartwell Foundation unterstützt.

Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Minnesota genehmigt.
1. Vorbereitung der Lösungen und chirurgischen Geräte
<ol><li>Sterilisieren Sie vor der Isolierung die chirurgischen Geräte mit 70% Ethanollösung.</li>
	<li>Fügen Sie 2,24 g KCl zu 500 ml Phosphatgepufferte Saline (PBS) Lösung hinzu, um eine Endkonzentration von 60 mM zu erhalten. KCl-PBS-Lösung bei Raumtemperatur aufbewahren. Verwenden Sie 3 ml KCl-PBS-Lösung pro Maus.</li>
	<li>32% Paraformaldehyd (PFA) Lösung mit PBS in eine Endkonzentration von 4% PFA verdünnen. Bereiten Sie 10 ml von 4% PFA in PBS pro Maus vor. Verdünnte PFA-Lösung kann bei 4 °C für 2-3 Wochen in einem Glasbehälter gelagert werden. HINWEIS: Vorbereitete 4% PFA-Lösung kann bei -20 °C für längere Zeit gelagert werden.</li>
	<li>Bereiten Sie 1 ml Kollagennase-Lösung pro Maus vor, indem Sie 60 mg Kollagennase, Typ 2 pro 1 ml PBS hinzufügen.</li>
</ol>2. Perfusion und Fixierung des Herzens
<ol><li>Anästhesisieren Sie das Tier mit 2-5% Isofluran mit einer Sauerstoffdurchflussrate von 1 l/min. Bestätigen Sie die Anästhesie, indem Sie Bewegungsmangel und eine niedrigere Atmungsrate bestätigen. HINWEIS: Die Injektion von Heparin (100-500 U/kg) vor der Euthanasie kann die Zellqualität und Ausbeute erhöhen, indem Blutgerinnsel verhindert werden, wodurch eine effizientere Durchblutung des Herzens mit fixativen ermöglicht wird.</li>
	<li>Euthanisieren Sie das Tier nach zugelassenen Methoden. HINWEIS: Wir haben uns an die Richtlinien der American Veterinary Medical Association für die Euthanasie von Tieren und die lokale IACUC-Zulassung für Euthanasie befolgt.</li>
	<li>Legen Sie das eingeschläferte Tier in Supine-Position, und band nach unten verlängerte Gliedmaßen.</li>
	<li>Schneiden Sie durch die Brust, um das Herz mit stumpfen Ende Schere aussetzen. Schneiden Sie absteigende Aorta und minderwertige Kavalavene.</li>
	<li>Durch Injektion von 3 ml KCl-PBS-Lösung durch die linke Herzkammer mit einer Durchflussrate von 3 ml/min mit einer peristaltischen Pumpe, die an einem Infusionsset mit einer 23 G Schmetterlingsnadel (26 G für Neonate) befestigt ist, durchdringen. Achten Sie darauf, nicht durch das Septum zu durchbohren. HINWEIS: Alternativ können Sie eine Nadel verwenden, die an einer Spritze befestigt ist, um Lösungen zu injizieren.</li>
	<li>Durch Injektion von 10 ml 4% PFA-Lösung für 10 min mit einer peristaltischen Pumpe mit einer Rate von 1 ml/min.</li>
	<li>Entfernen Sie das ganze Herz mit einer Schere. Nach dem Entfernen des Herzens ist es möglich, eine bestimmte Region des Herzens durch Einschneiden zu isolieren. Legen Sie das Herz oder ein Segment davon in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, das 1 ml 4% PFA-Lösung enthält. Inkubieren Sie das Herz auf Rocker bei Raumtemperatur mit Schaukelgeschwindigkeit zwischen 20-30 Rpm für 1 h.</li>
</ol>3. Isolierung von festen Kardiomyozyten
<ol><li>Legen Sie das Herz in eine Petrischale mit PBS-Lösung. Drücken Sie das Herz, um alle PFA loszuwerden, die in Ventrikeln verbleiben, und waschen Sie sie in PBS.</li>
	<li>Setzen Sie das fixierte Herz in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit Kollagennaselösung (60 mg/ml). Legen Sie die Röhre auf Dieb (20-30 U/min) bei 37 °C für die nächtliche Inkubation. HINWEIS: Verlängern Sie die Inkubationszeit auf 1 Woche und füllen Sie die Kollagenaselösung alle zwei Tage auf, um die mögliche Ertragsvariation zu reduzieren, wenn die Herzen voraussichtlich fibrotisch sind, was eine längere Zeit der Kollagenaseverdauung erfordern könnte, um extrazelluläres Kollagen zu verdauen.</li>
	<li>Legen Sie Kollagenaselösung und das Herz in eine 35 mm Petrischale. Dissoziieren Sie das Herz in 1 mm Stücke mit Zangen oder Schere.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Transferpipette, um das dissoziierte Gewebe für 2 min weiter zu trituratieren. Wenn Gewebepartikel noch in der Schale verbleiben, verwenden Sie eine Transferpipette mit schmalerer Öffnung und setzen Sie die Triturierung fort. Fahren Sie fort, bis der Großteil des Gewebes abgebaut ist. HINWEIS: Über Trituration bewirkt, dass einzelne Kardiomyozyten brechen. Achten Sie darauf, nicht zu trituieren, indem Sie regelmäßig unter dem Mikroskop überprüfen.</li>
	<li>Legen Sie ein 200-600 m Nylongewebe über die Öffnung des 15 ml Zentrifugenrohrs. HINWEIS: Für hypertrophierte Kardiomyozyten wird empfohlen, 400 m Nylongewebe anstelle von 200 m zu verwenden.</li>
	<li>Fügen Sie der Petrischale, die dissoziierte Zellen enthält, 5 ml PBS hinzu und filtern Sie die Lösung durch Nylongewebe, einschließlich Gewebepartikel. Waschen Sie das Nylongewebe, indem Sie zusätzliche 4 ml PBS passieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die gefilterte Lösung bei 10-100 x g für 1 min. HINWEIS: 100 x g Zentrifugation ergibt keine 100% reine Kardiomyozytenpopulation, und einige Nicht-Kardiomyozytenzellen werden wahrscheinlich einbezogen.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand, es sei denn, man will auch Herzzellen ohne Kardiomyozyten färben/bewerten. Das Pellet in 10 ml PBS vor der Färbung wieder aufhängen.</li>
</ol>4. Färbung von Kardiomyozyten
<ol><li>Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 100 x g für 1 min und fügen Sie 5 ml Permeabilisationslösung hinzu (z. B. 0,5% Triton X-100 in PBS). 20 min bei Raumtemperatur auf Wippe inkubieren. HINWEIS: Verwenden Sie für die Schritte 4.1, 4.2 und 4.4 15 ml Zentrifugenrohre, da es einfacher ist, den Überstand zu entfernen, ohne das Zellpellet im Vergleich zu 1,5 ml Mikrozentrifugenrohren zu stören.</li>
	<li>Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 100 x g für 1 min, fügen Sie 5 ml Sperrpuffer hinzu (z. B. 3% Rinderserumalbumin [BSA] in PBS) und 30 min bei Raumtemperatur auf einer Wippe brüten.</li>
	<li>Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 100 x g für 1 min und fügen Sie 1 ml primäre Antikörperlösung (in PBS) mit dem entsprechenden Verdünnungsverhältnis hinzu. Übertragen Sie die Lösung in 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und inkubieren Sie Kardiomyozyten in Primärantikörperlösung unter optimierten Bedingungen (z. B. 4 °C über Nacht).</li>
	<li>Transfer Cardiomyozyten mit Primärantikörperlösung auf ein 15 ml Zentrifugenrohr übertragen und 9 ml PBS hinzufügen. Inkubieren Sie die Kardiomyozyten für 10 min bei Raumtemperatur auf einer Wippe.</li>
	<li>Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 100 x g für 1 min und fügen Sie 10 ml PBS hinzu. Inkubieren Sie die Kardiomyozyten für 10 min bei Raumtemperatur auf einer Wippe. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.</li>
	<li>Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 100 x g für 1 min und fügen Sie die sekundäre Antikörperlösung, die DAPI enthält. 30 min bei Raumtemperatur auf einer Wippe inkubieren, gefolgt von der Wiederholung von Schritt 4,5 zweimal, um Kardiomyozyten zu waschen.</li>
	<li>Legen Sie die Zellen entweder auf Abdeckungen oder mikroskopkompatible Platten und gehen Sie mit der Bildgebung fort. HINWEIS: Die im Manuskript enthaltenen Bilder wurden mit 10x- und 40x-Objektiven aufgenommen. Laser wurden verwendet: 405 nm für DAPI, 561 nm für Alpha Actinin und 640 nm für Edu.</li>
</ol>5. Setup Imaging-Software
HINWEIS: Folgen Sie diesen Schritten mit Supplementary File 1-SoftwareScreenshots.pdf.
<ol><li>Laden Sie die Fidschi-Distribution von ImageJ herunter.</li>
	<li>Öffnen Sie Fidschi. Klicken Sie auf Hilfe > Aktualisieren... > Update-Sites verwalten. Überprüfen Sie die Update-Sites "IJPB-plugins" und "Biomedgroup", um die Dependenncies Plugins Ellipse Split und Morpholibj herunterzuladen.</li>
	<li>Klicken Sie auf Schließen. Fidschi sollte mit dem Herunterladen der Abhängigkeiten beginnen. Starten Sie Fidschi neu, wenn Sie fertig sind.</li>
	<li>Laden Sie Rstudio herunter und öffnen Sie es.</li>
	<li>Kopieren Sie install.packages( c ("ggplot2", "autothresholdr", "dplyr", "purrr", "jsonlite", "shiny")) in die Befehlszeile der R-Konsole und drücken Sie die Eingabetaste. c Geben Sie "y" als Antwort auf alle Eingabeaufforderungen ein, um alle R-Abhängigkeiten zu installieren (Screenshot 1 in Der Zusatzdatei 1).</li>
</ol>6. Bildquantifizierung
<ol><li>Öffnen Sie Fidschi und ziehen Sie "AnalyzeNucleation.py" (als zusätzliche Codedatei geliefert) in die Statusleiste von Fidschi. Dadurch wird ein Skriptbearbeitungsfenster geöffnet. Klicken Sie in der linken unteren Ecke auf Ausführen, um sie zu starten (Screenshot 2 in Der Zusatzdatei 1).</li>
	<li>Es erscheint ein Dialogfeld (Ergänzende Datei 1: Screenshot 3), in dem nach dem Speicherort des Ausgabedatenverzeichnisses gefragt wird. Alle Analysedaten, Zahlen und anderen Daten, die von dieser Software verwendet werden, werden in diesem Ordner gespeichert. Ein weiteres, größeres Dialogfeld wird angezeigt, in dem alle Einstellungen für die Bildanalyse angezeigt werden(Ergänzende Datei 1: Screenshot 4).<ol>
<li>Wählen Sie den Speicherort des Verzeichnisses aus, das zu analysierende Bilder enthält.</li>
		<li>Geben Sie das Bilddateinamenformat mithilfe regulärer Ausdrücke ein. Geben Sie das Bilddateinamenformat ein, das angibt, welche Teile des Dateinamens Zeilen-, Spalten-, Kanal- und (optional) Site in klammernden Ausdrücken entsprechen. Legen Sie keine Leerzeichen in die geschweiften Klammern. Umgeben Sie Variable Teile des Dateinamenformats in geschweiften Klammern. Die Art und Weise, wie Dateien gespeichert werden, hängt von der Imaging-Software ab, und dieser Schritt ruft relevante Informationen aus dem Bilddateinamen ab. ANMERKUNG: Z. B. die Formatzeichenfolge r" Platte 1-(? P<row>[A-Za-z]+)(? P<spalte>[0-9]+)-(? P<channel>[A-Za-z]+).tif" beschreibt einen Dateinamen, der mit "Platte 1-" beginnt, gefolgt von einem oder mehreren alphabetischen Buchstaben, die die Zeile anzeigen, gefolgt von einer oder mehreren Ziffern, die die Spalte angibt, gefolgt von "-", gefolgt von einem oder mehreren Buchstaben, die den Kanal ananzeigen, gefolgt von ".tif". Die Buchstaben innerhalb der spitzen Klammern wie "<>" sind Variablennamen und werden automatisch in die Daten kopiert, wenn sie gesammelt werden. Einer der Variablennamen muss "<channel>" sein.</li>
		<li>Geben Sie den Namen der Kanäle an, in denen der nukleare Fleck sichtbar ist und wo die Kardiomyozyten sichtbar sind. Diese Namen müssen genau so sein, wie sie sich in dem Teil befinden, der mit der Variable "<channel>" in den Dateinamen des regulären Ausdrucks übereinstimmt.</li>
		<li>Geben Sie an, wie die Bilder mit durch Kommas getrennten Variablennamen gruppiert werden sollen. Alle Bilder innerhalb einer bestimmten Gruppe werden in einem Stapel geöffnet und analysiert. Wenn die Bilder z. B. in Sätze für jeden Brunnen unterteilt sind und es für jede eindeutige Kombination aus Zeile und Spalte einen Brunnen gibt, schreiben Sie "Zeile, Spalte" in dieses Feld. HINWEIS: Diese Gruppierungsvariablen müssen eine Teilmenge der Variablen sein, die in der Formatzeichenfolge verwendet werden. Verwenden Sie "Kanal" nicht als Gruppierungsvariable, dies trennt die entsprechenden Kanalbilder voneinander.</li>
		<li>Geben Sie an, ob Bilder in einem Brunnenbild zusammengenäht oder für jede Site getrennt sind. Im ersten Fall sollte die Site nicht in der Dateinamenformatzeichenfolge angegeben werden.</li>
		<li>Wählen Sie aus, welche Schwellenwertmethode verwendet werden soll, um Kerne vom Hintergrund zu trennen. Alle Standard-Schwellenwertmethoden von Fidschi sind verfügbar. Testen Sie verschiedene Schwellenwertmethoden, um zu bestimmen, welche für den Bildsatz am besten funktioniert. Wählen Sie in diesem Beispiel die Otsu-Methode aus.</li>
		<li>Geben Sie an, ob der Schwellenwert für jedes Standortbild neu berechnet werden soll oder ob für jedes Bild in der Gruppe derselbe Schwellenwert verwendet werden soll. Geben Sie an, ob die Kardiomyozytenbilder hellfeldsind oder einen fluoreszierenden Marker verwenden.</li>
		<li>Geben Sie die Kardiomyozytenschwellenmethode an. Wenn im vorherigen Schritt hellfeld ausgewählt wurde, wird diese Schwellenwertmethode auf randgefilterte Hellfeldbilder angewendet. Geben Sie an, ob der Schwellenwert für jedes Standortbild neu berechnet werden soll oder ob für jedes Bild in der Gruppe derselbe Schwellenwert verwendet werden soll.</li>
		<li>Geben Sie die Anzahl der Zeilen von Standortbildern an, die jeden Brunnen abdecken. Geben Sie die Anzahl der Spalten von Website-Images an, die jeden Brunnen abdecken. Geben Sie den minimalen Bereich der Kerne in Pixelanteilen an. Verwenden Sie eine großzügig niedrige Mindestgröße, ein höherer und präziserer Schwellenwert wird im Analyseschritt berechnet. Geben Sie den Mindestbereich von Kardiomyozyten an.</li>
		<li>Nachdem Sie die gewünschten Einstellungen ausgewählt haben, klicken Sie auf OK.</li>
	</ol></li>
	<li>Auf dem Bildschirm werden Bilder angezeigt, die denen in Abbildung 3 und Abbildung 4 ähneln und die verschiedenen Phasen der Analysepipeline zeigen. Überprüfen Sie diese Bilder, um sicherzustellen, dass Schwellenwerte und Segmentierung enden.</li>
	<li>Der ausgewählte Ergebnisordner sollte nun mit Analysedaten gefüllt werden(Ergänzende Datei 1: Screenshot 5). Andere Dateien als Analysedaten können sicher in diesem Ordner gespeichert werden, solange ihre Namen nicht mit "cm_", "nuclei_" oder "nucleilink_" beginnen.</li>
</ol>7. Datenanalyse
HINWEIS: Die erstellten csv-Dateien können manuell analysiert werden. Jede analysierte Bilduntermenge erzeugt ein Triplet von csv-Dateien mit dem Namen "nuclei(metadata).csv", "nucleilink(metadata).csv" und "cardiomyocytes(metadata),csv", wobei (Metadaten) durch eine Sequenz von Namens-Wert-Paaren der Form "_(name)=(value)" ersetzt werden, wobei (Name) und (Wert) Sequenzen von alphanumerischen Zeichen sind, die von Zeichenfolgen abgeleitet wurden, die zuvor von Zeichenfolgen abgeleitet wurden. (Wenn z. B. Zeile und Spalte in den Dateinamen angegeben wurden, sind Zeichenfolgen wie "_row=F" und "_column=8" vorhanden). Die unbenannte linke Spalte jeder Kern- und Kernlinkdatei ist eine Kern-ID-Nummer. Die "Min"-Spalte der Nucleilink-Datei ist die ID der Kardiomyozyten, die diesen Kern ganz oder 0 enthielt. Die Spalte "Max" der Kerne ist die ID der am höchsten nummerierten Kardiomyozyten, die diesen Kern teilweise enthielt, oder 0 sonst. Die Spalte "Mean" der Kardiomyozytendatei ist die Cardiomyozyten-ID-Nummer.
<ol><li>Öffnen Sie "AnalyzeMultinucleatedServer.R" in Rstudio (als zusätzliche Codedatei bereitgestellt).</li>
	<li>Am Anfang dieser Datei befindet sich eine Variable mit dem Namen "folderName". Daneben befindet sich ein Dateipfad. Geben Sie hier den Pfad zum Ausgabedatenordner ein, der im letzten Schritt ausgewählt wurde, ohne den letzten Schrägstrich(Zusatzdatei 1: Screenshot 6).</li>
	<li>In der oberen linken Ecke des Skriptbearbeitungsfensters sollte ein grüner Pfeil mit der Bezeichnung App ausführenangezeigt werden. Klicken Sie auf diesen Pfeil. Es kann einige Zeit dauern, bis die Daten geladen werden und die App angezeigt wird.</li>
	<li>Zunächst werden drei Gating-Diagramme sichtbar sein, eine zur Angabe des minimalen gültigen Schwellenwerts für den kerntechnischen Bereich, eine zur Angabe des minimalen Schwellenwerts für die zulässige mittlere Intensität des Kernwerts und eine zur Angabe des maximalen gültigen Mindestdurchmessers für Kardiomyozyten. Verwenden Sie die Schieberegler, um diese Schwellenwerte festzulegen (Zusatzdatei 1: Screenshot 7). HINWEIS: In jedem dieser Graphen sollte ein großer, breiter Spitzenwert vorhanden sein, der gültigen Kernen oder Kardiomyozyten entspricht, flankiert von breiten Schwänzen, die Trümmer oder fehlerhafte segmentierte Kardiomyozyten darstellen. Verwenden Sie die Schwellenwerte, um einen Schwanz jedes der Peaks abzuschneiden.</li>
	<li>Scrollen Sie nach unten. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausgewählte Schwellenwerte anwenden (unten in der Zusatzdatei 1: Screenshot 7).</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Plot Intensitätsverteilung. Dadurch wird die Kernintensitätsverteilung sowohl der gesamten Probe als auch separate Subplots für jede Gruppierungsvariable dargestellt. HINWEIS: Wenn z. B. <row> und <column> Gruppierungsvariablen in den regulären Ausdruck im Fidschi-Dialog eingegeben wurden, werden hier Diagramme angezeigt, die die Intensitätsverteilung nach Zeile und Spalte angeben (Ergänzende Datei 1: Screenshot 8). Wenn die Beleuchtungs- und Färbebedingungen in den verschiedenen Teilen der Probe konstant waren, sollten diese Diagramme alle deutlich zwei Intensitätsspitzen aufweisen, einen Dimmer, einen größeren für die diploiden Kerne und einen helleren, kürzeren für die tetraploiden Kerne.</li>
	<li>Intrasample-Variation führt dazu, dass dieses Muster im gesamten Stichprobendiagramm nicht sichtbar ist und es eine große Vielfalt an der Position der diploiden und tetraploiden Spitzen nach Zeile, Spalte oder einer anderen Gruppierungsvariablen gibt. Im letzteren Fall scrollen Sie nach unten und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Separatenach Gruppe normalisieren, um diese Variante zu berücksichtigen(Ergänzende Datei 1: Screenshot 9).</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Ploidy berechnen (Zusatzdatei 1: Screenshot 9). Klicken Sie auf die Schaltfläche Plot Estimated Ploidy Distribution. Diagramme werden in den leeren Fenstern auf der rechten Seite angezeigt. Im normalisierten Gesamtstichprobendiagramm sollte das Zwei-Spitzen-Muster sichtbar sein, wenn es vorher nicht war.</li>
	<li>Wählen Sie Schwellenwerte aus, um die diploiden und tetraploiden Spitzen voneinander und Ausreißer mit den Schiebereglern zu isolieren (Ergänzende Datei 1: Screenshot 9). Scrollen Sie nach unten. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ploidy und Nukleation berechnen (Zusatzdatei 1: Screenshot 10).</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Plotten und Speichern in Ergebnisordner. Das im ausgewählten Ergebnisordner gespeicherte Diagramm wird auch in diesem interaktiven Fenster angezeigt(Ergänzende Datei 1: Screenshot 10).</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Da Kardiomyozyten in der Kultur nicht aufrechterhalten werden können, ist es wichtig, primäre Kardiomyozyten zu isolieren, um ihre Architektur und Funktion studieren zu können11. Daher sind Kardiomyozyten-Isolationstechniken im Herzbereich weit verbreitet. Wenn das Ziel ist, funktionelle Aspekte von Kardiomyozyten zu bestimmen, ist es wichtig, lebensfähige Kardiomyozyten zu isolieren. Diese lebenden Kardiomyozyten können auch verwendet werden, um Immunfärbung auf isolierten Kardiomyozyten durchzuführen. Die Optimierung der Technik der Isolierung von lebenden Kardiomyozyten ist jedoch technisch anspruchsvoll, und selbst die besten Techniken ergeben in der Regel nur 60-65% lebende stabförmige Kardiomyozyten, und die verbleibenden Kardiomyozyten sind alle aufgeballt und sterbenoder oder tot11,12. Hier haben wir eine Technik entwickelt, die es Forschern ermöglicht, zuerst das Herz zu reparieren und dann Kardiomyozyten effizient zu isolieren. Dieses neue Protokoll ermöglicht wesentlich höhere Erträge von stabförmigen Kardiomyozyten im Vergleich zu zuvor veröffentlichten Protokollen. Darüber hinaus haben wir eine bildgebende Analyseplattform entwickelt, um Kardiomyozyten automatisch basierend auf Keimbildung und Ploidie zu kategorisieren. Mit diesen neuen Methoden können Gruppen Kardiomyozyten für verschiedene Proteine färben und den Kardiomyozytenploidie- und Keimstatus als Ersatz für das regenerative Potenzial des Herzens untersuchen.
Das hier beschriebene Protokoll ist relativ einfach und kann ohne fortschrittliche Ausrüstung ausgeführt werden. Die Menge an Kollagenase und Inkubationszeit für die Verdauung kann je nach Kollagenase-Los und dem Unternehmen, das sie bereitstellt, variieren. Wir verwendeten Kollagenase Typ 2, da dies am häufigsten verwendet wird, um das Herz für die Gewinnung von lebenden Kardiomyozyten zu verdauen. Basierend auf unseren Beobachtungen haben wir festgestellt, dass die nächtliche Inkubation mit 60 mg/ml Kollagenase Typ 2 für fast alle Mausherzen unabhängig vom Fibrose-Niveau optimal ist. Wir hatten noch nie ein Problem der Überverdauung, da intrazelluläre Proteine fixiert sind und nicht so zugänglich sind wie extrazelluläres Kollagen. Wenn das Herz jedoch nicht richtig verdaut wird, kann eine kräftigere Triturierung erforderlich sein, die eine Zellfragmentierung aufgrund von Scherstress verursacht. Daher ist es wichtig, sicherzustellen, dass das Herz richtig verdaut wird, bevor sie zur Trituration übergeht. Die Steifigkeit des Herzens kann durch Drücken mit Zangen getestet werden, um den Grad der Verdauung zu beurteilen. Nach der Inkubation mit Kollagenase sollten Die Herzen weniger steif und leicht auseinander zu reißen sein. Andere Arten von Kollagenase können auch verwendet werden. In einem früheren Bericht wurde eine Kombination der Kollagenasen B und D14verwendet.
Darüber hinaus glauben wir, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um die Gesamtzahl der Kardiomyozyten im Herzen15zu bewerten. Wenn das Ziel jedoch darin besteht, alle Kardiomyozyten aus dem Herzen zu erhalten und zu quantifizieren, ist es wichtig, die Herzen für längere Zeit in der Kollagenaselösung zu bebrüten (z. B. 3-7 Tage), wo die Kollagenaselösung einmal täglich aufgefüllt werden sollte. Dadurch werden Inkonsistenzen in der Isolationseffizienz minimiert, da die Auswirkungen des Triturationsgrades auf die Kardiomyozytenausbeute eliminiert werden.
Die Verwendung von DNA-Inhalten zur Messung der Ploidie ist nicht neu und wird seit Jahrzehnten in der Durchflusszytometrie eingesetzt. Kürzlich wurde gezeigt, dass die Mikroskopie ähnlich verwendet werden kann, um den DNA-Gehalt pro Zellkern16zu schätzen. Hier haben wir diese Strategie umgesetzt, um die Ploidie von Kardiomyozytenkernen als Ersatz für neu gebildete Kardiomyozyten zu messen. Das Dogma auf dem Gebiet der Herzregeneration ist, dass nur mononukleierte, diploide Kardiomyozyten Zytokinese erleiden und neue Kardiomyozyten hervorrufen können. Da es sehr schwierig ist, die neue Kardiomyozytenbildung in vivo zu messen, wurde die Isolierung von Kardiomyozyten, die nach verabreichung eines DNA-Nukleotidanalogs gejagt wurden, und die Bestimmung des Niveaus mononukleierter, diploider Kardiomyozyten als Annäherung an die Fähigkeit des Herzens, neue Kardiomyozyten zu erzeugen,verwendet 17. Hier stellen wir ein Makro für ImageJ zur Verfügung, das eine einfache Quantifizierung der Kardiomyozytenploidie ermöglicht. Mindestens 500 Kerne müssen gemessen werden, um eine genaue Schätzung der Lage des G1-Peaks zu erreichen. Wenn darauf geachtet wird, dass die Färbe- und Bildbedingungen in allen Brunnen der abgebildeten Platte konsistent sind, müssen nur 500 Kerne in der gesamten Probe abgebildet werden, andernfalls müssen 500 Kerne pro Bildgruppe18,19vorhanden sein. Zu den Einschränkungen der bildgebenden Messung von Keimbildung und Ploidie gehört die Schwierigkeit, Kerne von anhaftenden Zellen von tatsächlichen Kardiomyozytenkernen zu unterscheiden, wenn zweidimensionale Bilder verwendet werden. Solche anhaftenden Zellen können zu einer Überschätzung der Menge an multinukleierten Zellen führen und die Genauigkeit der Messungen der tetraploiden Kardiomyozytenkernpopulation verringern. Eine mögliche Strategie, um dieses Problem zu lösen, wäre die Verwendung der Kardiomyozyten-Kernmarker PCM16,20. Wir hatten jedoch Schwierigkeiten, eine zuverlässige PCM1-Färbung an richtig fixierten Zellen oder Geweben zu erhalten.
Eine weitere mögliche Einschränkung ist, dass einige nukleare Fleckenbilder signifikante hintergrundzytoplasmatische Färbung haben könnten, um eine ordnungsgemäße Schwellenbildung mit den eingebauten Methoden der Fidschi-Inseln ohne umfangreiche Vorverarbeitung zu verhindern. Darüber hinaus verringert der unregelmäßige Beitrag dieser Hintergrundfluoreszenz zu ploidienmäßigen Schätzungen ihre Genauigkeit. Darüber hinaus bindet der Fluoreszenzfarbstoff nicht an die Sättigung innerhalb der Kerne, wenn die Zellen nicht ausreichend in der DNA-Färbungslösung verbleiben, und die Annahme einer linearen Beziehung zwischen nuklearintegrierter Intensität und DNA-Gehalt wird nicht mehr genau sein.
Es sollte beachtet werden, dass die Software Cardiomyozyten-Cluster nicht segmentieren kann und sie stattdessen aus der Analyse entfernt. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, Kardiomyozyten mit einer relativ geringen Dichte (z. B. 1000 Zellen/cm2)auszusäen. Darüber hinaus kann die Software nicht zwischen zwei Cardiomyozyten unterscheiden, die durchundgehend aufgereiht sind, und langen, einzigartigen Kardiomyozyten. Diese Art von Clustern kann fälschlicherweise Multinukleationsschätzungen aufblähen.
Obwohl die beschriebene Methode die Erzielung lebensfähiger Kardiomyozyten nicht zulässt und daher nicht zur Messung dynamischer zellulärer Prozesse verwendet werden kann, wenn das Ziel darin besteht, eine Immunfärbung durchzuführen, glauben wir, dass die beschriebene Methode bestehenden Protokollen mit höheren Erträgen an Kardiomyozyten und einer besseren Qualität in Bezug auf Morphologie und Proteinlokalisierung überlegen ist. Schließlich könnte die beschriebene Methode verwendet werden, um Kardiomyozyten aus klinischen Proben14,21zu isolieren. Wir glauben, dass die beschriebene Methodik verschiedenen Forschern helfen kann, hochwertige Kardiomyozyten zu erhalten und Keimbildung und Ploidie als Surrogate für neue Kardiomyozytenbildung zu messen.

Herzkrankheiten sind in den meisten westlichen Ländern seit vielen Jahrzehnten die häufigste Todesursache1,2. Obwohl viele Verbesserungen bei der Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen das Überleben verbessert haben, gibt es derzeit keine Behandlungen, die verlorene Kardiomyozyten ersetzen können. Daher, Studien im Zusammenhang mit Kardiomyozytenfunktion, Proliferation, Apoptose und Hypertrophie waren und sind ein Schwerpunkt der wissenschaftlichen Gemeinschaft. Da das erwachsene Säugetierherz eine sehr begrenzte Regenerationskapazität hat, mit einer geschätzten Kardiomyozytenerneuerungsrate von weniger als 1% pro Jahr, ist es von entscheidender Bedeutung, kardiomyozytenproliferative Ereignisse zuverlässig zu identifizieren3,4. Die meisten Strategien, die proliferative Ereignisse messen, basieren entweder auf der Färbung für eingebaute DNA-Nukleotid-Analoga, um die vorherige oder aktuelle Proliferation zu bewerten, oder Flecken für kerntechnische Marker aktiver Proliferation5. Es ist besonders wichtig, kardiomyozyten proliferative Ereignisse zuverlässig zu identifizieren, da die Gesamtzahl der proliferativen Kardiomyozyten so niedrig ist3,6. Zum Beispiel, basierend auf einer 1% Erneuerungsrate von endogenen Kardiomyozyten pro Jahr, kann man erwarten, zwischen 25 und 50 Kardiomyozyten zu einem bestimmten Zeitpunkt im erwachsenen Mausherz7,8zu proliferativ zu finden. Ungenauigkeiten bei der Identifizierung von Kardiomyozytenkernen können zu falsch positiven Ergebnissen führen. Daher ist es wichtig, Kardiomyozytenkerne zuverlässig zu identifizieren, was sich aus den histologischen Abschnitten9als schwierig und unzuverlässig erwiesen hat. Die Identifizierung von Kardiomyozyten ist viel genauer von Einzelzellen als von Gewebeabschnitten, da es schwierig sein könnte, Kardiomyozyten von anderen Zelltypen zu unterscheiden, selbst wenn Marker wie α-Actinin verwendet werden, obwohl PCM1 ein zuverlässiger Marker von Kardiomyozytenkernen in histologischen Abschnitten10sein könnte.
Aktuelle Protokolle basieren auf der Isolierung von lebenden Kardiomyozyten vor der Fixierung, die bekanntermaßen zum Tod von mindestens 30% der Kardiomyozyten führt und zu einer unbeabsichtigten Auswahl bestimmter Populationen von Kardiomyozyten führen kann11. Darüber hinaus sind diese Protokolle notorisch schwierig zu optimieren, um reproduzierbare Ergebnisse zu liefern. Selbst optimierte Isolationstechniken können in der Regel nicht mehr als 65 % lebende, stabförmige Kardiomyozyten mit unterschiedlichen Erträgen12produzieren.
Um diese Probleme zu überwinden, haben wir ein Protokoll entwickelt, das es Forschern ermöglicht, feste Kardiomyozyten zu isolieren. Da die Proben vor der Isolierung fixiert sind, wird die Ausbeute maximiert und die In-vivo-Morphologie gut erhalten. Darüber hinaus ist es mit diesem Protokoll möglich, Kardiomyozyten aus klinischen Proben zu isolieren, die in der Regel unmittelbar nach der Beschaffung fixiert werden. Darüber hinaus ist es bei der Identifizierung neu generierter Kardiomyozyten wichtig, den Keim- und Ploidiestatus einzelner Kardiomyozyten zu messen, da in der Regel nur diploide Kardiomyozyten als neu gebildet angenommen werden. Die Durchflusszytometrie kann Multinukleation und Polyploidie nicht unterscheiden und ist ein relativ zeit- und ressourcenintensives Protokoll. Die manuelle Umrissung und Messung von Kernen in Bildern ist sehr geringer Durchsatz und anfällig für menschliche Voreingenommenheit. Die automatisierte Quantifizierung von Bildern von festen, isolierten DAPI-befleckten Kardiomyozyten löst beide Probleme. Die bildgebende Bestimmung der Nukleation und der Ploidie-Verteilung kann mit einem Minimum an Zeit und Reagenzien mit Grundausstattung erreicht werden.

<table><tbody><tr><td>96-Well-Platte für die Bildgebung</td><td>Corning</td><td>3340</td><td>Wir verwenden diese Platten, da sie für die Bildgebung geeignet sind, obwohl Glasbodenplatten besser für die konfokale Bildgebung geeignet wären</td></tr><tr><td>Alpha-Actinin</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-32462</td><td>Dieser Antikörper wird als Marker für Kardiomyozyten-Sarkomere verwendet</td></tr><tr><td>Stumpfe Schere</td><td>Feine Scherenwerkzeuge</td><td>14072-10</td><td>Wir bevorzugen eine stumpfe Schere, da die Wahrscheinlichkeit, Herzgewebe zu zerreißen, geringer ist, wenn das Herz freigelegt wird</td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>Das Jackson Laboratory</td><td>664</td><td>Wird für die Bildgebung, Beurteilung von Ploidie und Keimbildung in Kardiomyozyten-Population</td></tr><tr><td>CD-1-Mäusen</td><td>verwendet Charles River</td><td>22</td><td>Wird für die Bildgebung verwendet, um Ploidie und Nukleation in Kardiomyozyten-Population</td></tr><tr><td>zu beurteilen Kollagenase 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>Für die Zwecke dieses Protokolls sind die Unterschiede von Charge zu Charge minimal und beeinträchtigen nicht die Gesamtausbeute und die Qualität der Isolierung</td></tr><tr><td>Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203165-10G</td><td>Für die Färbung von Edu</td></tr><tr><td>Cy5 Picolyl Azid</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>1177-25</td><td>Azid für die Färbung von Edu</td></tr><tr><td>Cytation3</td><td>BioTek-Wird</td> <td>für die automatisierte Bildgebung für die DNA-Analyse verwendet</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td>DAPI wird für die DNA-Färbung verwendet. Die Bestände wurden in destilliertem Wasser aufgelöst.</td></tr><tr><td>Esel-Anti-Maus IgG-Alexa568</td><td>Life Technologies</td><td>A10037</td><td>Sekundärantikörper zum Nachweis von Alpha-Actinin-Färbung in Kardiomyozyten</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5137</td><td>Wir verwenden diese gebogene, stumpfe Pinzette, obwohl auch gerade Pinzetten verwendet werden können</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144212</td><td>Um den pH-Wert von Tris-HCl-Puffer auf pH 8,5</td></tr><tr><td>einzustellen BildJ</td><td><a href="https://imagej.net/Fiji/Downloads">imagej.net/Fiji/Downloads</a></td><td>-</td><td>Wird für die Analyse von Bildern</td></tr><tr><td>verwendet L-Ascorbinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255564-100G</td><td>Für die Färbung von Edu</td></tr><tr><td>Nadel für die Infusion</td><td>TERUMO</td><td>SV*23BLK</td><td>Wir verwenden im gesamten Protokoll geflügelte Infusionssets, da es einfach ist, die Position der Nadel mit diesen Sets während der Injektion zu manipulieren</td></tr><tr><td>Nikon A1R HD25</td><td>Nikon-Zur</td> <td>Aufnahme von konfokalen Bildern von Alpha-Aktinin-Färbungen</td><td></td></tr> <tr><td>Nylon-Netz 200 Mikron</td><td>Elko-Filterung</td><td>03-200/54</td><td>Netz zur Filterung regulärer Kardiomyozyten (nicht hypertrophiert)</td></tr><tr><td>Nylon-Netz 400 Mikron</td><td>Elko-Filterung</td><td>06-400/38</td><td>Netz zur Filterung hypertrophierter adulter Kardiomyozyten</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1X)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>Diese kann auch im Labor hergestellt werden. Obwohl die Sterilität in diesem Experiment wichtig ist, halten wir es für ausreichend, PBS herzustellen und zu filtrieren</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid, Granulat</td><td>Mallinckrodt</td><td>6858</td><td>Granuliertes Kaliumchlorid wurde von uns bevorzugt, da es bei Lagerung bei Raumtemperatur weniger Aggregate bildet</td></tr><tr><td>R</td><td><a href="http://www.r-project.org/">r-project.org</a></td><td></td>-<td>Wird für die Datenanalyse der Messungen aus Bildern verwendet</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher</td><td>Scientific BP152-5</td><td>Zur Pufferung der EdU-Färbereaktion</td></tr></tbody></table>

isolierung von kardiomyozyten aus festen herzen für die immunzytochemie und ploidie-analyse

Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis

Das erwachsene Säugetierherz besteht aus verschiedenen Zelltypen, darunter Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten. Da es schwierig ist, Kerne von Kardiomyozyten auf histologischen Abschnitten zuverlässig zu identifizieren, verlassen sich viele Gruppen darauf, lebensfähige Kardiomyozyten vor der Fixierung zu isolieren, um eine Immunfärbung durchzuführen. Diese Live-Kardiomyozyten-Isolationstechniken erfordern jedoch eine Optimierung, um die Ausbeute, Lebensfähigkeit und Qualität der Proben zu maximieren, mit inhärenten Schwankungen von Probe zu Probe trotz maximaler Optimierung. Hier berichten wir über ein reproduzierbares Protokoll mit Fixierung vor der enzymatischen Verdauung des Herzens, das zu einer maximalen Ausbeute führt und gleichzeitig die In-vivo-Morphologie einzelner Kardiomyozyten beibehalte. Wir haben eine automatisierte Analyseplattform entwickelt, um die Anzahl der Kerne und den DNA-Gehalt pro Kern für einzelne Kardiomyozyten zu bestimmen. Nach der Entlarvung der Brusthöhle wurde das Herz in Diastole durch Perfusion mit 60 mM KCl in PBS verhaftet. Als nächstes wurde das Herz in 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung fixiert und dann mit 60 mg/ml Kollagenaselösung verdaut. Nach der Verdauung wurden die Zellen durch Trituration singuliert und die Kardiomyozytenfraktion wurde durch Differentialzentrifugation angereichert. Isolierte Kardiomyozyten wurden für Troponin T und α-Actinin gefärbt, um die Reinheit der erhaltenen Population zu beurteilen. Darüber hinaus haben wir eine Bildanalyseplattform entwickelt, um die Kardiomyozytenkernbildung und den Ploidie-Status nach DAPI-Färbung zu bestimmen. Bildbasierte Ploidy-Bewertungen führten zu konsistenten und reproduzierbaren Ergebnissen. So ist es mit diesem Protokoll möglich, die native Morphologie einzelner Kardiomyozyten zu erhalten, um Immunzytochemie und DNA-Gehaltsanalyse zu ermöglichen und gleichzeitig eine maximale Ausbeute zu erzielen.

Cardiomyozyten wurden gemäß dem oben beschriebenen Protokoll isoliert. Mit dieser Methode erhalten wir in der Regel einheitlich singuläre Kardiomyozyten, die relativ rein sind, ohne nicht-kardiomyozyten Zellen zu kontaminieren (Abbildung 1A). Kardiomyozyten lassen sich unter der Hellfeldmikroskopie aufgrund ihrer charakteristischen Größe und Birefreringität leicht identifizieren. Diese Technik ist einfach zu implementieren und liefert konsistente Ergebnisse aus verschiedenen Isolationen mit vergleichbaren Kardiomyozytenausbeuten und Qualität (Abbildung 1B). Isolierte Kardiomyozyten können vor der weiteren Anwendung bei 4 °C gelagert werden.
Kardiomyozyten, die gemäß dem obigen Protokoll isoliert wurden, können für verschiedene nachgeschaltete Anwendungen verwendet werden, wie z. B. die Messung der Kardiomyozytengröße, der Kardiomyozytenploidie und der Immunzytochemie. Als repräsentatives Ergebnis zeigen wir, dass nach diesem Protokoll isolierte Kardiomyozyten mit Antikörpern und fluorchromekonjugierten Aziden für die Klickchemie gefärbt werden können, um die Lokalisierung bestimmter Proteine zu erkennen bzw. die DNA-Replikation von Kardiomyozyten zu erkennen. Zum Beispiel haben wir Kardiomyozyten mit Antikörpern gefärbt, die α-Aktinin erkennen, um das charakteristische Z-Linien-Färbemuster von Sarkomen zu zeigen (Abbildung 2A). In einem separaten Experiment verabreichten wir Mäusen das Thymidin-Analog-Analog-5-Ethynyl-2'-Deoxyuridin (EdU), bevor wir feste Kardiomyozyten isolierten. Nach der Kardiomyozytenisolierung färbten wir edU mit den Standardprotokollen13und konnten Kardiomyozyten, die die S-Phase durchlaufen hatten, entweder in mononukleierten, binucleierten und trinukleierten Kardiomyozyten erkennen (Abbildung 2B).
Um den Nutzen der Isolationsmethode weiter auszubauen, haben wir eine Pipeline entwickelt, die die Quantifizierung der Kardiomyozytenploidie auf Basis integrierter DNA-Färbung ermöglicht. Um den Ploidie-Status von Zellen oder Kernen messen zu können, mussten wir Kerne und Kardiomyozyten segmentieren. Abbildung 3 zeigt eine Darstellung der Strategie, die wir verwendet haben, um einzelne Kerne zu identifizieren. Zunächst wird das Originalbild DNA-gebeiztes Bild (Abbildung 3A) basierend auf der Intensität(Abbildung 3B) schwellenwertiert. Hier verwendeten wir DAPI, um DNA zu färben, aber jeder andere Kernfarbstoff, der eine lineare Korrelation mit dem DNA-Inhalt zeigt, würde funktionieren. Das Programm ermöglicht es, eine der Intensitätsschwellenmethoden von Fidschi zu wählen, aber in diesem Beispiel wurde Otsu-Methode verwendet. Kernmasken, die den Rand des Bildes berühren oder kleiner als der angegebene Schwellenwert für den Minimalpixelbereich sind, werden ausgeschlossen. Dann sind Ellipsen auf die Kernmasken abgestimmt und segmentieren einzelne Kerne. Abbildung 3C zeigt diese Ellipsen, die auf dem Originalbild überlagert sind. Als Nächstes werden Löcher in die Masken gefüllt, und die Pixel des Bildes werden dann in Gebiete partitioniert, basierend auf der Ellipse, die sie am proximalsten sind (Abbildung 3D). Die Grenzen dieser Gebiete werden dann verwendet, um Linien durch Kerncluster zu ziehen und den nuklearen Segmentierungsprozess zu beenden (Abbildung 3E).
Der nächste Schritt beinhaltet die Detektion von Kardiomyozyten. Bei Kardiomyozytenbildern, die auf der Grundlage fluoreszierend gefärbter Zellen gewonnen werden (Abbildung 4A), ist der Prozess dem für Kerne sehr ähnlich. Das Bild wird basierend auf einem Intensitätswert, der von der ausgewählten Schwellenwertmethode, in diesem Fall der Dreiecksmethode, berechnet wird, schwellenwertiert. Identifizierte Kardiomyozytenmasken, die die Grenze des Bildes berühren oder unter einer bestimmten Größe liegen, werden ausgeschlossen und Löcher werden in die Masken gefüllt, um richtig segmentierte Kardiomyozyten bereitzustellen (Abbildung 4B). Da Kardiomyozyten eine unregelmäßigere Form als Kerne haben, wird kein Versuch unternommen, Kardiomyozyten-Cluster zu segmentieren. Stattdessen werden diese Cluster aufgrund ihres hohen Minimaldurchmessers von Feret während des Analyseschritts ausgeschlossen. Die Segmentierung von Hellen Feldbildern verläuft etwas anders. Zunächst wird das ursprüngliche helle Feldbild (Abbildung 4C) mit einem Sobel-Kantenfilter verarbeitet. Dieser Filter berechnet den absoluten Wert des Farbverlaufs jedes Pixels innerhalb des Bildes. Pixel in Regionen mit schnellen Änderungen erhalten hohe Werte und Pixel in glatten Bereichen des Bildes erhalten niedrige Werte. Dieses kantengefilterte Bild wird dann mit der Triangle-Methode durch Intensität abgegrenzt, was zu maskierten Kardiomyozyten führt (Abbildung 4D). Diese hochgradig unregelmäßigen Masken werden dann geglättet und durch morphologisches Schließen mit einem Kreis mit einem Radius von 2 Pixeln miteinander verbunden, der alle weißen Bereiche im Bild ausfüllt, in denen der Kreis nicht passen kann, ohne einen schwarzen Bereich zu überlappen (Abbildung 4E). Schließlich werden Löcher in den Masken gefüllt, Bereiche, die den Rahmen berühren, ausgeschlossen und kleine Partikel entfernt, wodurch der Kardiomyozytensegmentierungsprozess abgeschlossen wird (Abbildung 4F).
Mit der skizzierten Segmentierungsstrategie können wir dann den Keimzustand einzelner Kardiomyozyten bestimmen. Mit diesem Ansatz ermittelten wir den Keimzustand von Kardiomyozyten, die aus Herzen von ausgezüchteten CD-1-Mäusen zu frühen postnatalen Zeitpunkten isoliert wurden. Die Herzen von neugeborenen Mäusen (erster Tag des Lebens) zeigten, dass die Mehrheit der Kardiomyozyten zu diesem Zeitpunkt mononukleiert sind(Abbildung 5: neonatal). Diese hohe Häufigkeit mononukleierter Kardiomyozyten ist bei jugendlichen Mäusen (2 Wochen alt) viel geringer, wo mononukleierte Kardiomyozyten etwa 25 % der gesamten Kardiomyozytenpopulation ausmachen(Abbildung 5: juvenile). Schließlich können wir den Ploidy-Status einzelner Kerne in Kardiomyozyten messen und feststellen, ob sie diploid oder tetraploid sind. Diese Ergebnisse zeigen eine höhere Häufigkeit von Tetraploidenkernen bei jugendlichen Mäusen (Abbildung 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60938/60938fig1.jpg"> Abbildung 1: Effizienz der Kardiomyozytenisolation nach Fixierung. (A) Repräsentatives Bild isolierter Kardiomyozyten, die mit DAPI gefärbt sind, um Kerne zu zeigen. (DAPI (blau), Hellfeld (grau)) (B) Ausbeute von Kardiomyozyten, die von verschiedenen Mäusen im Alter von 3 Monaten isoliert wurden. Skalenbalken = 50 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/60938fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60938/60938fig2.jpg"> Abbildung 2: Immunzytochemie isolierter Kardiomyozyten. (A) Repräsentatives Bild von Kardiomyozyten, die für α-Actinin (α-Actinin (rot) und DAPI (blau)) gefärbt sind. (B) Kardiomyozyten für eingebaute EdU (rot) und DAPI (blau). Gezeigt werden repräsentative Kardiomyozyten, die mononukleiert (links), binucleated (Mitte) und trinukleiert (rechts) und EdU positiv sind. Skalenbalken = 50 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/60938fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60938/60938fig3.jpg"> Abbildung 3: Strategie für die nukleare Segmentierung. (A) Original DAPI-Kanalbild. (B) Schwellenbild (in diesem Beispiel wurde die Otsu-Methode verwendet). (C) Masken, die anhand der auf dem ursprünglichen DAPI-Befleckten Bild überlagerten Schwellenwerte identifiziert wurden. (D) Voronoi Tessellation auf der Grundlage von Kernmasken. (E) Endsegmentierte Kerne, mit hervorgehobenen geteilten Clustern. Skalenbalken = 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/60938fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60938/60938fig4.jpg"> Abbildung 4: Strategie für die Kardiomyozytensegmentierung. (A) Original fluoreszierendes Troponin I gefärbt Cardiomyozyten Bild. (B) Dreiecksschwellenbild, nach dem Füllen von Löchern und dem Ausschluss kleiner Objekte und der berührenden Rahmen. (C) Original helles Kardiomyozytenbild (D) Kantengefiltertes und dreiecksbeschnittenes Kardiomyozytenbild (E) Kantengefiltertes Bild nach morphologischem Schließen mit einem Radius von zwei Pixeln (F) Gleiches Bild nach dem Füllen von Löchern und dem Ausschluss kleiner Objekte und der erberührenden Rahmen. Skalenbalken = 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/60938fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60938/60938fig5.jpg"> Abbildung 5: Klassifizierung von Kardiomyozyten basierend auf der Anzahl der Kerne. Neonatale Herzen (1 Tage alt) enthalten mehr mononukleierte Kardiomyozyten als jugendliche Herzen (14 Tage alt). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/60938fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60938/60938fig6.jpg"> Abbildung 6: Verteilung des Kardiomyozyten-DNA-Gehalts pro Zellkern. Bei Neonaten (links) sind 13,5 % der mononukleierten CM-Kerne tetraploid und 11,9 % der binucleierten CM-Kerne tetraploid. Bei Juvenilen (rechts) sind 33,9% der mononukleierten CM-Kerne tetraploid und 31,2% der binucleatierten CM-Kerne tetraploid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/60938fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Datei 1: Software-Screenshots. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/SoftwareScreenshots.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).</a>
Ergänzende Datei 2: AnalyzeNucleation.py. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/AnalyzeNucleation.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).</a>
Ergänzende Datei 3: AnalyzeMultinucleatedServer.R. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/AnalyzeMultinucleatedServer.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).</a>

Ziel dieser Arbeit ist es, eine Methode zu entwickeln, um Kardiomyozyten reproduzierbar vom Erwachsenenherz zu isolieren und DEN DNA-Gehalt und die Keimbildung zu messen.

Isolierung von Kardiomyozyten aus festen Herzen für die Immunzytochemie und Ploidie-Analyse

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably ...

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Isolierung von stabförmigen Kardiomyozyten aus jedem Herzgewebe, die dann verwendet werden kann, um den Ploidy- und Keimstatus dieser Kardiomyozyten ohne manuelle Analyse zu messen. Im Vergleich zu anderen Techniken bietet unser Protokoll konsistentere Zellerträge und Zellmorphologie, und im Gegensatz zur Durchflusszytometrie sind wir in der Lage, den Keim- und Ploidiestatus von Kardiomyozyten visuell zu überprüfen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da die Herzgewebeteilung und -assoziation leichter zu erkennen ist.Beginnen Sie, indem Sie die eingeschläferte Maus in eine Supine-Position setzen und die verlängerten Gliedmaßen herunterkleben. Verwenden Sie stumpfköpfige Scheren, um durch die Brust zu schneiden, um das Herz zu belichten. Dann schneiden Sie die absteigende Aorta und die inferialvencava.Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe, die an einem Infusionsset mit einer 23 Gauge Schmetterlingsnadel befestigt ist, um das Herz zu durchdringen, indem Sie drei Milliliter Kaliumchlorid-PBS-Lösung durch den linken Ventrikel injizieren. Achten Sie darauf, nicht durch das Septum zu durchbohren. Dann injizieren Sie 10 Milliliter 4%PFA Lösung für 10 Minuten mit einer Rate von einem Milliliter pro Minute.Verwenden Sie eine Schere, um das ganze Herz zu entfernen. Und wenn gewünscht, isolieren Sie eine bestimmte Region. Legen Sie das Gewebe in ein 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr, das einen Milliliter 4%PFA-Lösung enthält.Inkubieren Sie es auf einem Rocker für eine Stunde. Legen Sie das Herz in eine Petrischale mit PBS-Lösung. Drücken Sie es, um alle PFA loszuwerden, die in den Ventrikeln verbleiben, und waschen Sie es in PBS.Legen Sie das fixierte Herz in eine neue 1,5-Milliliter-Röhre mit Kollagenlösung. Dann bebrüten Das Herz auf einer Wippe bei 37 Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Tag das Herz in eine 35-Millimeter-Petrischale mit Kollagenlösung geben und mit Zangen oder Schere in einen Millimeter zerlegen.Verwenden Sie dann eine Transferpipette, um das dissoziierte Gewebe für zwei Minuten weiter zu trituieren. Wenn Gewebepartikel noch übrig bleiben, verwenden Sie eine Pipette mit einer schmaleren Spitze und setzen Sie die Triturierung fort, bis der Großteil des Gewebes abgebaut ist. Legen Sie ein 200 bis 600 Mikrometer Nylongewebe über ein 15-Millimeter-Zentrifugenrohr.Fügen Sie den dissoziierten Zellen fünf Milliliter PBS hinzu und filtern Sie sie durch das Nylongewebe. Waschen Sie das Nylongewebe, indem Sie weitere vier Milliliter PBS passieren. Zentrifugieren Sie dann die gefilterte Lösung bei 10 bis 100 mal G für eine Minute.Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter PBS vor der Färbung wieder auf. Nachdem Sie die Fidschi-Distribution von Bild J heruntergeladen haben, öffnen Sie Fidschi und klicken Sie auf Hilfe, aktualisieren und verwalten Sie Update-Sites. Überprüfen Sie die Biomed-Gruppe und IFPB-Plugins.Um die Abhängigkeiten Plugins herunterzuladen, Ellipse Split und morpho lib J.Dann klicken Sie auf Schließen und Änderungen anwenden. Als Nächstes laden Sie RStudio herunter und öffnen Sie es. Kopieren Sie den Code aus dem Textmanuskript in die Befehlszeile von RConsole und drücken Sie die Eingabetaste.geben Sie dann Y als Antwort auf alle Eingabeaufforderungen ein, um alle unsere Abhängigkeiten zu installieren. Um die Bildquantifizierung durchzuführen, öffnen Sie Fidschi und ziehen Sie die Analyse. py in die Statusleiste.Wenn das Skriptbearbeitungsfenster geöffnet wird, klicken Sie in der linken unteren Ecke auf Ausführen. Ein Dialogfeld wird angezeigt, in dem nach dem Speicherort des Ausgabedatenverzeichnisses gefragt wird. Wählen Sie den Ordner aus, in dem alle Analysedaten, Zahlen und anderen von der Software verwendeten Daten gespeichert werden sollen.Wählen Sie in den Analyseparametern die Position der zu analysierenden Bilder aus, und geben Sie das Bilddateinamenformat mithilfe regulärer Ausdrücke ein. Nachdem Sie die gewünschten Einstellungen ausgewählt haben, klicken Sie auf OK. Wenn Bilder aus verschiedenen Phasen der Analysepipeline auf dem Bildschirm angezeigt werden, überprüfen Sie sie, um sicherzustellen, dass die Schwellenwerte und segmentieren ordnungsgemäß auftreten. Open analyzemultinuatedserver.r in Rstudio. Geben Sie als Nächstes den Dateipfad in den Ausgabedatenordner ein, der im letzten Schritt ohne den endgültigen Schrägstrich ausgewählt wurde. Klicken Sie in der oberen linken Ecke des Skriptbearbeitungsfensters auf App ausführen.Verwenden Sie die Schieberegler, um Schwellenwerte für die minimale gültige nukleare Mittlere Intensität, den minimalen gültigen Schwellenwert für den Kernbereich und den maximal gültigen Mindestdurchmesser für Frettchen für Kardiomyozyten festzulegen. Scrollen Sie nach unten, und klicken Sie auf Ausgewählte Schwellenwerte anwenden, und klicken Sie dann auf die Plotintensitätsverteilung, wodurch ein Diagramm der Kernintensitätsverteilung der gesamten Stichprobe sowie separate Subplots für jede Gruppierungsvariable gerendert werden. Um die Intrasample-Variation zu berücksichtigen, scrollen Sie nach unten und überprüfen Sie die Normalisierung separat nach Gruppe, und klicken Sie dann auf Ploidie berechnen und die geschätzte Ploidieverteilung darstellen.Sobald das normalisierte gesamte Beispieldiagramm angezeigt wird, sollten die beiden Spitzenmuster sichtbar sein. Verwenden Sie die Schieberegler und wählen Sie Schwellenwerte aus, um die diploiden und tetraploiden Spitzen voneinander und Ausreißer zu isolieren. Scrollen Sie dann nach unten und klicken Sie auf Ploidie und Keimbildung berechnen.Klicken Sie schließlich auf das Schaltflächendiagramm und speichern Sie es im Ergebnisordner. Diese Methode kann verwendet werden, um gleichmäßig singuläre Kardiomyozyten zu isolieren, die relativ rein sind, ohne Zellen zu kontaminieren. Es ist einfach zu implementieren und bietet konsistente Cardiomyozytenausbeute und Qualität aus verschiedenen Isolationen.Mit diesem Protokoll isolierte Kardiomyozyten können mit Antikörpern und fluorchromen konjugierten Aziden gefärbt werden. Um das charakteristische Z-Linien-Färbemuster von Sarkomen zu zeigen, wurden die Zellen mit Antikörpern gefärbt, die Alpha-Actinin erkennen. In einem separaten Experiment wurde EdU Mäusen verabreicht, bevor sie feste Kardiomyozyten isolierte.Nach der Isolierung wurden die mononukleierten, binucleierten und trinukleierten Kardiomyozyten, die eine S-Phase durchlaufen hatten, nachgewiesen. Um einzelne Kerne zu identifizieren, wurde das ursprüngliche DNA-gefärbte Bild basierend auf der Intensität abgeschwellt. Ellipsen passten zu den Kernmasken und segmentieren einzelne Kerne.Als nächstes wurden die Pixel des Bildes in Gebiete aufgeteilt, die auf der Ellipse basieren, zu der sie am proximalsten sind, und die Grenzen dieser Territorien wurden verwendet, um Linien durch nukleare Cluster zu zeichnen. Ein ähnlicher Segmentierungsprozess wurde verwendet, um Kardiomyozyten zu erkennen. Diese Segmentierungsstrategie zeigte, dass die Mehrheit der Kardiomyozyten von neugeborenen Mäusen mononukleiert sind.Die Häufigkeit mononukleierter Kardiomyozyten ist bei zwei Wochen alten Mäusen, wo sie etwa 25% der gesamten Kardiomyozytenpopulation ausmachen, viel geringer. Bei der Messung des Ploidie-Status einzelner Kerne in Kardiomyozyten wurde bei jugendlichen Mäusen eine höhere Häufigkeit von Tetraploidenkernen nachgewiesen. Bei der Isolierung von Kardiomyozyten ist es wichtig zu überprüfen, ob alle Zellklumpen ihre Trituration abgebrochen haben.

isolation-cardiomyocytes-from-fixed-hearts-for-immunocytochemistry

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Adult Herzmuskelzellen sind primäre Zellen, die aus tierischen Herzen isoliert und kultiviert für mehrere Tage. Innerhalb dieses Zeitraums Kultur adenoviralen Gentransfer können verwendet werden, um genetisch kodierte Biosensoren (GEBS) oder fluoreszierende Fusionsproteine ​​zu exprimieren. Beide Ansätze erlauben zellulären Untersuchungen mittels der konfokalen Mikroskopie.

Isolation und genetische Manipulation von Adult Herzmuskelzellen für konfokale Imaging

Cardiac Kerne über Dichte Sedimentation isoliert und mit Antikörpern gegen immunmarkiert pericentriolar Material 1 (PCM-1) zu identifizieren und zu sortieren Kardiomyozyten Kerne durch Durchflusszytometrie.

Isolierung von Kardiomyozyten Kerne von Post-mortem Gewebe

Hier beschreiben wir die Isolierung von adulten Maus cardiomyoctyes mit einem Langendorff-Perfusion-System. Die resultierenden Zellen sind Ca2 +-tolerant, elektrisch Ruhe und kultiviert und mit Adeno-oder Lentiviren, um die Genexpression zu manipulieren transfiziert werden. Ihre Funktionalität kann auch mit dem MMSYS System und Patch-Clamp-Techniken analysiert werden.

Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes

Einzelne Kardiomyozyten aus Wildtyp- und mutierten Mäusen können aus dem Herzen isoliert werden, um ihre Kontraktilität und Kalziumtransienten zu untersuchen. Dies ermöglicht die Charakterisierung des Beitrags zellulärer Dysfunktion zur Herzfunktionsstörung aus beliebiger Ursache.

Isolation und physiologische Analyse von Maus Kardiomyozyten

Die Quantifizierung des Kardiomyozytenumsatzes ist eine Herausforderung. Das hier beschriebene Protokoll leistet einen wichtigen Beitrag zu dieser Herausforderung, indem es eine genaue und empfindliche Quantifizierung der Bildung von Neokardiomyozytenkernen und der Kernploidie ermöglicht.

Die gleichzeitige Bewertung der Cardiomyocyte DNA-Synthese und Ploidy: Ein Verfahren zur Förderung des Quantifizierung von Cardiomyocyte Regeneration und Umsatz

Um die Zellteilung von Zellzyklusvariationen in Kardiomyozyten zu unterscheiden, präsentieren wir Protokolle mit zwei transgenen Mauslinien: Myh6-H2B-mCh-transgene Mäuse, zur eindeutigen Identifizierung von Kardiomyozytenkernen, und CAG-eGFP-Anillin-Mäuse, zur Unterscheidung der Zellteilung von Zellzyklusvariationen.

Visualisierung von Zellzyklus-Variationen und Bestimmung der Nukleation in postnatale Kardiomyozyten

Mehrere Protokolle wurden entwickelt und beschrieben für die Isolierung von verschiedenen Herzzelltypen von einem Rattenherz. Hier wird ein optimiertes Protokoll beschrieben, das die Isolierung von hochwertigen Hauptkardiometertypen (Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten) aus einer einzigen Präparation ermöglicht, wodurch die experimentellen Kosten reduziert werden.

Gleichzeitige Isolierung von hochwertigen Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten aus einem erwachsenen Rattenherz

Präsentiert wird ein Protokoll zur Isolierung von humanen und tierischen ventrikulären Kardiomyozyten aus vibratomegeschnittenen Myokardscheiben. Hohe Erträge von kalziumtoleranten Zellen (bis zu 200 Zellen/mg) können aus kleinen Gewebemengen (&lt;50 mg) gewonnen werden. Das Protokoll gilt für Myokard, das bis zu 36 h kalten Ischämien ausgesetzt ist.

Isolierung menschlicher ventrikulärer Kardiomyozyten aus Vibratome-Cut Myokardscheiben

Wir entwickelten eine einfacheMethode zur Isolierung hochwertiger einzelner Mausherzzellen durch die antegrade Perfusionstechnik. Diese Methode ist Langendorff-frei und nützlich zur Isolierung von ventrikulären und vorhofialen Myozyten oder interstitiellen Zellen, wie Herzfibroblasten oder Vorläuferzellen.

Eine antegrade Perfusionsmethode zur Kardiomyozytenisolation von Mäusen

Der Goldstandard in der Kardiologie für zelluläre und molekulare Funktionsexperimente sind Kardiomyozyten. Dieser Artikel beschreibt Anpassungen an die Nicht-Langendorff-Technik zur Isolierung von Maus-Kardiomyozyten.

Eine einfache und effektive Methode zur konsistenten Isolierung von Maus-Kardiomyozyten

Erfahren Sie die Isolierung von Kardiomyozyten aus festem Herzmuskelgewebe für Immunzytochemie und Ploidie-Analyse. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Zellerträge und visuelle Verifizierung der Kernzahl und Ploidie.

Isolierung von Kardiomyozyten aus festen Herzen für die Immunzytochemie und Ploidie-Analyse

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