Name: Reinigung von Fibroblasten und Schwannzellen von sensorischen und motorischen Nerven in Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Erfahren Sie eine effiziente Methode zur Reinigung von Fibroblasten und Schwann-Zellen aus sensorischen und motorischen Nerven in vitro. Dieses Protokoll ermöglicht Forschern die Untersuchung von Nervenregeneration und Nervenerkrankungen.

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Diese Studie wurde vom National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2017YFA0104703), der National Natural Foundation of China (Grant No. 31500927) unterstützt.

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Institutional Animal Care Guidelines der Universität Nantong durchgeführt. Alle Verfahren einschließlich der tierischen Subjekte wurden vom Verwaltungsausschuss für Versuchstiere in der Provinz Jiangsu, China, ethisch genehmigt.
1. Isolation und Kultur von motorischen und sensorischen Nerven-Fibroblasten und SCs
<ol><li>Verwenden Sie sieben Tage alte Sprague-Dawley (SD) Ratten (n=4), die vom Experimental Animal Center der Nantong University of China bereitgestellt werden. Legen Sie die Ratten in einen Tank mit 5% Isofluran für 2-3 Minuten, lassen Sie die Tiere langsam atmen und haben keine unabhängige Aktivität, und dann mit 75% Ethanol vor der Enthauptung desinsieren.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Schere, um die hintere Haut für ca. 3 cm zu schneiden und die Wirbelsäule zu entfernen. Öffnen Sie den Wirbelkanal sorgfältig, um das Rückenmark freizulegen.</li>
	<li>Bewahren Sie das Rückenmark in einer 60 mm Petrischale mit 2-3 ml eiskalter D-Hanks' ausgewogener Salzlösung (HBSS) auf.</li>
	<li>Basierend auf der anatomischen Struktur, verbrauchen Sie die ventrale Wurzel (Motornerv) und dann die Rückenwurzel (Sensornerv) unter einem Sezieren des Mikroskops. Als nächstes legen Sie sie in eine eiskalte D-Hanks'-Ausgewogene Salzlösung (HBSS).</li>
	<li>Nach dem Entfernen des HBSS die Nerven mit einer Schere in 3-5 mm Stücke schneiden und mit 1 ml 0,25% (w/v) Trypsin bei 37 °C für 18-20 min verdauen. Als nächstes, Ergänzung mit 3-4 ml DMEM enthält 10% fetales Rinderserum (FBS), um die Verdauung zu stoppen.</li>
	<li>Die Mischung etwa 10 Mal vorsichtig auf und ab pipette und bei 800 x g 5 min zentrieren. Danach den Überstand entsorgen und den Niederschlag in 2-3 ml DMEM, ergänzt mit 10% FBS, aussetzen.</li>
	<li>Filtern Sie die Zellsuspension mit einem 400-Mesh-Filter, und impfen Sie dann die Zellen in 60 mm Petrischale und Kultur bei 37 °C in Gegenwart von 5%CO2. Nach 4-5 Tagen Kultivierung isolieren Sie den Durchgang 0 (p0) Fibroblasten und SCs, nachdem sie 90% Zusammenfluss erreicht haben.</li>
	<li>Isolation und Kultur von SCs (Abbildung 1)<ol>
<li>Waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS. Fügen Sie 1 ml 0,25% (w/v) Trypsin (37 °C) pro 60 mm Petrischale hinzu, um die Zellen für 8-10 s bei Raumtemperatur zu verdauen. Danach fügen Sie 3 ml DMEM mit 10% FBS ergänzt, um die Verdauung zu stoppen.</li>
		<li>Die Mischung vorsichtig blasen, um die SCs mit einer Pipette zu lösen. Dann sammeln und zentrifugieren Sie die SCs bei 800 x g für 5 min.</li>
		<li>Den Überstand entsorgen und den Niederschlag in 3 ml DMEM mit 10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 2 'M Forskolin und 10 ng/mL HRG aussetzen und dann die Zellen in unbeschichteter 60 mm Petrischale impfen. Nach der Kultivierung bei 37 °C für 30-45 min werden die Fibroblasten (einige Fibroblasten werden mit SCs verdaut) an der Unterseite der Schale befestigt.</li>
		<li>Übertragen Sie den Überstand (einschließlich der SCs) für 2 Tage auf eine andere Poly-L-Lysin (PLL)-beschichtete mittlere Schale und Kultur bei 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolation und Kultur von Fibroblasten (Abbildung 1)<ol>
<li>Nach dem Entfernen der SCs (wie in Schritt 1.8 gezeigt) die restlichen Fibroblasten in den Schüsseln mit 1x PBS waschen und dann 1 ml 0,25% (w/v) Trypsin hinzufügen, um die Fibroblasten 2 min bei 37 °C zu verdauen.</li>
		<li>Fügen Sie DMEM ergänzt mit 10% FBS, um die Verdauung zu beenden. Blasen Sie die Fibroblasten mit einer Pipette, und zentrifugieren Sie sie dann bei 800 x g für 5 min.</li>
		<li>Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie den Niederschlag mit 2 ml DMEM mit 10% FBS aus und impfen Sie dann die Zellen in einer unbeschichteten 60 mm Petrischale. Die Fibroblasten nach der Kultivierung für 30-45 min bei 37 °C an der Unterseite der Schale befestigen. Entsorgen Sie den Überstand (einschließlich einiger SCs). Dann fügen Sie 3 ml DMEM mit 10% FBS in die Fibroblasten Schale und Kultur bei 37 °C für 2 Tage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Durchfahrt der p1-Zellen, bis sie 90% Zusammenfluss erreichten. Reinigen Sie sie dann wieder durch Differentialverdauung und Differentialhaftung, wie in den Abschnitten 1.8 und 1.9 beschrieben.</li>
	<li>Verdauen Sie die p2-Fibroblasten und SCs nach der Kultivierung für 2 Tage, und sammeln Sie dann die Zellen, zählen und impfen in 1 x 105 Zahlen/gut auf PLL-beschichteten Dias für die Immunzytochemie (ICC).</li>
</ol>2. ICC zur Identifizierung der Zellreinheit
<ol><li>Kultur die Zellen für 24 h bei 37 °C und ICC Färbung nach Differentialverdauung und Differentialhaftung von motorischen und sensorischen Fibroblasten und SCs durchführen.</li>
	<li>Waschen Sie die motorischen und sensorischen Fibroblasten und SCs mit 1x PBS und fixieren Sie sie in 200 l/Well von 4% Paraformaldehyd (pH 7.4) für 18 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Blockieren Sie die Proben-SCs mit Sperrpuffer (0,1% Triton X-100 in 0,01 M PBS mit 5% Ziegenserum) und blockieren Sie die Proben-Fibroblasten mit Sperrpuffer (0,01 M PBS mit 5% Ziegenserum) für 45 min bei 37 °C nach dem Waschen mit PBS dreimal.</li>
	<li>Entfernen Sie den Sperrpuffer und inkubieren Sie ihn mit den folgenden primären Antikörpern: Maus monoklonaler Anti-CD90-Antikörper (ein spezifischer Marker für Fibroblasten) (1:1000) für Fibroblasten und Maus-Anti-S100-Antikörper (ein spezifischer Marker für SCs) (1:400) für SCs bei 4 °C über Nacht.</li>
	<li>Entsorgen Sie die primären Antikörper, waschen Sie sie dreimal mit PBS und inkubieren Sie sie mit den folgenden sekundären Antikörpern: Alexa Fluor 594 Ziege Anti-Maus-IgG (1:400) für Fibroblasten und 488-konjugiertes Ziegenanti-Maus-IgG (1:400) für SCs bei Raumtemperatur für 1,5 h.</li>
	<li>Waschen Sie die Proben dreimal mit PBS, und färben Sie die Kerne mit 5 'g/mL Hoechst 33342 Farbstoff für 10 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Probe dreimal mit 1x PBS und montieren Sie sie mit dem Montagemedium (20 l/Rutsche) auf dem Glasschlitten.</li>
	<li>Nehmen Sie die Zellfotos mit dem konfokalen Laserscanning-Mikroskop in drei zufälligen Feldern für jeden Brunnen auf. Bewerten Sie die Gesamtzahl der Kerne und CD90-positiven Zellen, S100-positive Zellen, und berechnen Sie dann den Prozentsatz der CD90-positiven Zellen bzw. S100-positiven Zellen. Führen Sie die Färbung in dreifacher Ausführung durch.</li>
</ol>3. Durchflusszytometrie-Analyse (FCA) zur Identifizierung der Zellreinheit
<ol><li>Bewerten Sie die Reinheit von motorischen und sensorischen Fibroblasten und SCs, wie zuvor von FCA16beschrieben. Kurz gesagt, verdauen Sie die p2-Motor und sensorische Fibroblasten und SCs mit 0,25% (w/v) Trypsin, setzen Sie die Zellpellets wieder auf und inkubieren Sie sie in Fixationsmedium bei Raumtemperatur für 15 min.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mit Permeabilisationsmedium und Sonde mit Mausmonoklonen-Anti-CD90-Antikörper (0,1 g/106 Zellen, 200 l) für Fibroblasten und Maus-Anti-S100-Antikörper (1:400, 200 l) für SCs bei Raumtemperatur für 30 min.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mit 488-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG für 30 min. Verwenden Sie das KALIBER FACS, um die Durchflusszytometrie durchzuführen und die Daten mit der Cell Quest-Software zu analysieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen nur mit 488-konjugierter Ziege Anti-Maus-IgG (Fibroblasten-Gruppe) und Maus IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Isotype-Steuerung (SCs-Gruppe), die als Negativkontrolle dient.</li>
</ol>4. Statistische Analyse
<ol><li>Präsentieren Sie alle Daten als Mittel - SEM. Bewerten Sie statistische Unterschiede in den Daten durch ungepaarten t-Testmit GraphPad Prism 6.0. Legen Sie die statistische Signifikanz auf p<0.05 fest. Führen Sie alle Assays in dreifacher Ausführung durch.</li>
</ol>

<ol><li>Stierli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+the+homeostasis+and+regeneration+of+peripheral+nerve+is+distinct+from+the+CNS+and+independent+of+a+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28The+Company+of+Biologists%29%22%5BJournal%5D)">The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population.</a> Development (The Company of Biologists). , (2018).</li>
<li>Schubert, T., Friede, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endoneurial+fibroblasts+in+myelin+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">The role of endoneurial fibroblasts in myelin degradation.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 40 (2), 134-154 (1981).</li>
<li>Dreesmann, L., Mittnacht, U., Lietz, M., Schlosshauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+fibroblast+impact+on+Schwann+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nerve fibroblast impact on Schwann cell behavior.</a> European Journal of Cell Biology. 88 (5), 285-300 (2009).</li>
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<li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphB+signaling+directs+peripheral+nerve+regeneration+through+Sox2-dependent+Schwann+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting.</a> Cell. 143 (1), 145-155 (2010).</li>
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<li>Brushart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+phenotype+is+regulated+by+axon+modality+and+central-peripheral+location%2C+and+persists+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experiment+Neurology%22%5BJournal%5D)">Schwann cell phenotype is regulated by axon modality and central-peripheral location, and persists in vitro.</a> Experiment Neurology. 247, 272-281 (2013).</li>
<li>He, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Gene+Expression+in+Primary+Cultured+Sensory+and+Motor+Nerve+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential Gene Expression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 1016(2018).</li>
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<li>Palomo Irigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Purification+of+Primary+Rodent+Schwann+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Purification of Primary Rodent Schwann Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1791, 81-93 (2018).</li>
<li>Cheng, L., Khan, M., Mudge, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+gene-related+peptide+promotes+Schwann+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcitonin gene-related peptide promotes Schwann cell proliferation.</a> Journal of Cell Biology. 129 (3), 789-796 (1995).</li>
<li>Pannunzio, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+of+selecting+Schwann+cells+from+adult+mouse+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve.</a> Journal of Neuroscience Methods. 149 (1), 74-81 (2005).</li>
<li>Shen, M., Tang, W., Cao, Z., Cao, X., Ding, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rat+Schwann+cells+based+on+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of rat Schwann cells based on cell sorting.</a> Molecular Medicine Reports. 16 (2), 1747-1752 (2017).</li>
<li>He, Q., Man, L., Ji, Y., Ding, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+in+the+biological+characteristics+between+primary+cultured+sensory+and+motor+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Comparison in the biological characteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells.</a> Neuroscience Letters. 521 (1), 57-61 (2012).</li>
<li>Weiss, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+and+transcriptomics+of+peripheral+nerve+tissue+and+cells+unravel+new+aspects+of+the+human+Schwann+cell+repair+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Proteomics and transcriptomics of peripheral nerve tissue and cells unravel new aspects of the human Schwann cell repair phenotype.</a> Glia. 64 (12), 2133-2153 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Zu den beiden Hauptzellpopulationen peripherer Nerven gehörten SCs und Fibroblasten. Die hauptsächlich kultivierten Fibroblasten und SCs können bei der Modellierung der Physiologie von Fibroblasten und SCs während der peripheren Nervenentwicklung und -regeneration genau helfen. Die Studie zeigte, dass P7-Ratten-Schitik-Nervenzellen etwa 85% der S100-positiven SCs, 13% der OX7-positiven Fibroblasten und nur 1,5% der OX42-positiven Makrophagen13enthielten. Obwohl die Anzahl der Fibroblasten kleiner ...

Im peripheren Nervensystem bestehen die Nervenfasern hauptsächlich aus Axonen, Schwann-Zellen (SCs) und Fibroblasten und enthält auch eine kleine Anzahl von Makrophagen, mikrovaskulären Endothelzellen und Immunzellen1. SCs wickeln die Axone in einem Verhältnis von 1:1 und werden von einer Bindegewebsschicht namens Endoneurium umschlossen. Die Axone werden dann zu Gruppen gebündelt, die Faszikel genannt werden, und jedes Faszikel wird in eine Bindegewebsschicht eingewickelt, die als Perineurium bekannt ist. Schließlich wird die gesamte Nervenfaser in eine Schicht aus Bindegewebe eingewickelt, die als Epineurium bezeichnet wird. Im Endoneurium besteht die gesamte Zellpopulation aus 48% SCs, und ein erheblicher Teil der verbleibenden Zellen umfasst Fibroblasten2. Darüber hinaus sind Fibroblasten wichtige Bestandteile aller Nervenkompartimente, einschließlich des Epineuriums, des Perineuriums und des Endoneuriums3. Viele Studien haben gezeigt, dass SCs und Fibroblasten eine entscheidende Rolle im Regenerationsprozess nach peripheren Nervenverletzungen4,5,6spielen. Nach der Transektion des peripheren Nervs regulieren die perineurialen Fibroblasten die Zellsortierung über den Ephrin-B/EphB2-Signalweg zwischen SCs und Fibroblasten und leiten das axonale Nachwachsen durch Wunden5. Periphere Nervenfibroblasten sezernieren Tenascin-C-Protein und verbessern die Migration von SCs während der Nervenregeneration durch den Signalweg7. Die in den oben genannten Studien verwendeten SCs und Fibroblasten wurden jedoch vom Ischiasnerv abgeleitet, der sowohl sensorische als auch motorische Nerven umfasst.
Im peripheren Nervensystem leiten die Sinnesnerven (afferent nerven) sensorische Signale von den Rezeptoren an das zentralnervousische System (ZNS), während die motorischen Nerven (effeente Nerven) Signale vom ZNS an die Muskeln leiten. Frühere Studien haben gezeigt, dass SCs unterschiedliche motorische und sensorische Phänotypen exprimieren und neurotrophe Faktoren absondern, um die periphere Nervenregeneration zu unterstützen8,9. Laut einer aktuellen Studie exprimieren Fibroblasten auch verschiedene motorische und sensorische Phänotypen und beeinflussen die Migration von SCs10. So ermöglicht uns die Erforschung von Unterschieden zwischen motorischen und sensorischen Nervenfibroblasten/SCs, die komplizierten zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der peripheren nervenspezifischen Regeneration zu untersuchen.
Derzeit gibt es viele Möglichkeiten, SCs und Fibroblasten zu reinigen, einschließlich der Anwendung von Antimitatika, Antikörper-vermittelte Zytolyse11,12, sequentielle Immunpanning13 und Laminin substratum14. Alle oben genannten Methoden entfernen jedoch Fibroblasten und bewahren nur die SCs. Hochgereinigte SCs und Fibroblasten können durch Durchflusszytometrie-Sortiertechnologie15erhalten werden, aber es ist eine zeitaufwändige und kostspielige Technik. Daher wurde in dieser Studie eine einfache Differentialverdauungs- und Differentialhaftungsmethode zur Reinigung und Isolierung von sensorischen und motorischen Nervenfibroblasten und SCs entwickelt, um eine große Anzahl von Fibroblasten und SCs schneller zu erhalten.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 594 Ziege Anti-Maus IgG(H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11005</td><td>Verdünnung: 1:400</td></tr><tr><td>CoraLite488-konjugiertes Affinipure Ziege Anti-Maus IgG(H+L)</td><td>Proteintech</td><td>SA00013-1</td><td>Verdünnung: 1:400</td></tr><tr><td>Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Cell Quest Software</td><td>Becton Dickinson Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Hank's ausgewogene Salzlösung</td><td>Gibco</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Corning</td><td></td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZ2-ILST</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099-141C</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield Eindeckmedium</td><td>Abcam</td><td>ab104135</td><td></td></tr><tr><td>Fixiermedium/Permeabilisierungsmedium</td><td>Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD</td><td>GAS005</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometrie</td><td>Becton Dickinson Biosciences</td><td>FACS Calibur</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Isotypkontrolle</td><td>Abcam</td><td>ab106163</td><td>Verdünnung: 1:400</td></tr><tr><td>Maus monoklonaler Anti-CD90 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab225</td><td>Verdünnung: 1:1000 für ICC, 0,1 & Mikro; g für 106 Zellen für Flow Cyt</td></tr><tr><td>Maus anti-S100 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab212816</td><td>Verdünnung: 1:400</td></tr><tr><td>Polylysin (PLL)</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>rekombinant humane NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domäne Protein</td><td>R& D Systems</td><td>396-HB-050</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % (w/v) Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr></tbody></table>

reinigung von fibroblasten und schwannzellen von sensorischen und motorischen nerven in vitro

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

Die Hauptzellen im peripheren Nervensystem sind die Schwann-Zellen (SCs) und die Fibroblasten. Beide Zellen drücken deutlich die sensorischen und motorischen Phänotypen aus, die an verschiedenen Mustern der neurotrophen Faktorgenexpression und anderen biologischen Prozessen beteiligt sind, was die Nervenregeneration beeinflusst. Die vorliegende Studie hat ein Protokoll erstellt, um hochgereinigte Ratinsensorische und motorische Cs und Fibroblasten schneller zu erhalten. Die ventrale Wurzel (Motornerv) und die Rückenwurzel (Sensornerv) von neonatalen Ratten (7 Tage alt) wurden dissoziiert und die Zellen wurden für 4-5 Tage kultiviert, gefolgt von isolierungs- und motorischen Fibroblasten und SCs durch die Kombination von Differentialverdauung und Differentialhaftungsmethoden nacheinander. Die Ergebnisse der Immunzytochemie und der Durchflusszytometrie-Analysen zeigten, dass die Reinheit der sensorischen und motorischen SCs und Fibroblasten >90% betrug. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine große Anzahl von sensorischen und motorischen Fibroblasten/SCs schneller zu erhalten und so zur Erforschung der sensorischen und motorischen Nervenregeneration beizutragen.

Leichte mikroskopische Beobachtung Die SCs und Fibroblasten sind die beiden Hauptzellpopulationen, die in der primären Zellkultur aus Nervengeweben gewonnen werden. Nach der Impfung für 1 h, die meisten der Zellen an der Unterseite der Schale haften, und die Zellmorphologie änderte sich von rund zu oval. Nach der Kultivierung für 24 h zeigten die SCs eine bipolare oder tripolare Morphologie, deren Länge zwischen 100 und 200 m lag. Nach 48 h kam es zu Aggregation und Ze...

Hier präsentieren wir eine Methode zur Reinigung von Fibroblasten und Schwannzellen von sensorischen und motorischen Nerven in vitro.

Reinigung von Fibroblasten und Schwannzellen von sensorischen und motorischen Nerven in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine große Anzahl von Sensor- und Motor-Fibroblasten und Schwann-Zellen schnell zu erhalten. Die durch diese Botschaft erhaltenen Zellen können bei der Untersuchung der Nervenregeneration und Erkrankungen des Nervensystems verwendet werden. Wir zeigen, dass Demonstration das Experimentelle darstellen kann, um die Zeit des differenziellen Verdauungsschritts besser zu kontrollieren und die experimentellen Schritte leichter zu verstehen.Zum Bersten verwenden Sie eine Schere, um einen drei Zentimeter großen Schnitt in der Haut des Rückens zu machen. Entfernen Sie die Wirbelsäule. Öffnen Sie den Wirbelkanal vorsichtig, um das Rückenmark freizulegen.Schnüren Sie das Rückenmark in einer 60-Millimeter-Petrischale, mit drei bis vier Millilitere eiskalte D Hanks ausgewogene Salzlösung unter einem Sezieren Mikroskop, Verbrauch der ventralen Wurzel und der rückenden Wurzel. Legen Sie sie in eiskalte D Hanks ausgewogene Salzlösung. Nach dem Entfernen der HBSS die Nerven mit einer Schere in drei bis fünf Millimeter schneiden.Fügen Sie einen Milliliter 0,25%Trypsin hinzu und übertragen Sie die Nervenstücke in fünf Milliliter Zentrifugenröhren. Bei 37 Gra

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Isolierung von Neuronen des dorsalen Wurzelganglion (DRG) aus Rattenembryonen und deren Co-Kultivierung mit Schwann-Zell-Vorläufern, um reife Schwann-Zellen zu erzeugen. Die isolierten DRGs werden verarbeitet, um Neuronen und Gliazellen zu isolieren. Die isolierten Zellen werden kultiviert, um die Neuronen zu reinigen, die dann mit Schwann-Zell-ähnlichen Zellen (SCLCs) in einem Co-Kulturmedium co-kultiviert werden. Die Interaktion mit den DRG-Neuronen führt...

Isolierung von DRG-Neuronen und Kokultur mit Schwann-Zell-Vorläufern zur Erzeugung von Schwann-Zellen

Dieses Video zeigt ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von Schwann-Zellen aus menschlichem Dermisgewebe. Die menschliche Dermis enthält verschiedene Zelltypen, darunter Fibroblasten und Schwann-Zellen. Nach der Isolierung werden die Zellen mit einem Antimitotikum behandelt, um proliferierende Fibroblasten zu eliminieren, was zu einer Reinkultur von Schwann-Zellen führt.

Isolierung und Kultivierung von primären Schwann-Zellen aus einer humanen Dermis

Dieses Video zeigt die Isolierung und Kultivierung von Schwann-Zellen aus den Spinalwurzeln der Maus. Isolierte Zellen werden dann in speziellen Medien kultiviert. Schwann-Zellen werden über differentiellen Verdau und Adhärenz isoliert. Anschließend werden sie zur Befestigung und Proliferation auf mit extrazellulärer Matrix beschichtete Deckgläser übertragen.

Isolierung von Schwann-Zellen aus spinalen Wurzeln der Maus

Dieses Video zeigt das Coculturing-Modell eines Explantats aus dem Spinalwurzelganglion und Schwann-Zellen. Unter Kokulturbedingungen fördert Ascorbinsäure die Differenzierung von Schwann-Zellen in myelinisierende Formen. Myelinisierende Schwann-Zellen umhüllen die Axone mehrmals, um eine Myelinscheide zu bilden, die für die Nervenfunktion unerlässlich ist.

Co-Kultivierung eines Explantats eines Spinalganglien-Explantats mit Schwann-Zellen für die Myelinisierung von Neuronen

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung von Schwann-Zellen aus Ischias-Nervenfasern von Mäusen.

Magnetische Trennung von Schwann-Zellen von Ischiasnerven der Maus

Quelle: Han, J., et.al. Regulierung des Wachstums von Schwann-Zellen durch gepulstes elektrisches Feld im Nanosekundenbereich für die Regeneration peripherer Nerven in vitro. J. Vis. Exp. (2024)Dieses Video zeigt die Anwendung der Nanosekunden-Technik des gepulsten elektrischen Feldes (nsPEF) zur Modulation des Wachstums von Schwann-Zellen (SC). Die schnellen elektrischen Pulse induzieren transiente Nanoporen in SC-Membranen und erleichtern den Kalziumeinstrom, der Signalwege aktiviert, die die...

Regulierung des Wachstums von Schwann-Zellen in vitro mit der Nanosekunden-Technik des gepulsten elektrischen Feldes

Dieser Artikel beschreibt ein neuronales Kultursystem, das verwendet werden kann, um große Mengen reiner axonaler Proben für biochemische und immunzytochemische Analysen zu erhalten. Diese Technik wird ein besseres Verständnis der normalen axonalen Physiologie und der Signalwege ermöglichen, die zur Neurodegeneration führen.

Produktion und Isolierung der Axone von Sinneszellen für Biochemische Analyse mit Porous Filter

Marrow Stromazellen (MSCs) mit neuronalen Potenzial gibt es im Knochenmark. Unser Protokoll bereichert diese Population von Zellen durch hypoxische Vorkonditionierung und leitet sie dann zu reifen Schwann-Zellen.

Hypoxische Vorkonditionierung von Marrow-abgeleiteten Progenitor-Zellen als Quelle für die Erzeugung von reifen Schwann-Zellen

Die Untersuchung der Wundheilung im Zusammenhang mit Muskel-Skelett-Verletzungen erfordert oft die Beurteilung von In-vitro-Interaktionen zwischen Schwann-Zellen (SCs), Keratinozyten und Fibroblasten. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung dieser Primärzellen aus der menschlichen Vorhaut.

Isolierung, Kultur und Charakterisierung von primären Schwann-Zellen, Keratinozyten und Fibroblasten aus der menschlichen Vorhaut

Im Kokultursystem von dorsalen Wurzelganglien und Schwann-Zellen kann die Myelinisierung des peripheren Nervensystems untersucht werden. Dieses Modell bietet experimentelle Möglichkeiten zur Beobachtung und Quantifizierung der peripheren Myelinisierung und zur Untersuchung der Auswirkungen von Wirkstoffen auf die Myelinscheide.

In vitro Myelinisierung peripherer Axone in einer Kokultur von Dorsalwurzelganglienexplantaten der Ratte und Schwann-Zellen

Hier stellen wir ein Protokoll für die Anwendung eines elektrischen Nanosekunden-Pulsfeldes (nsPEF) zur Stimulation von Schwann-Zellen in vitro vor. Die Synthese- und Sekretionsfähigkeit relevanter Faktoren und Veränderungen des Zellverhaltens bestätigten die erfolgreiche Stimulation mit nsPEF. Die Studie gibt ein positives Bild von der Methode der peripheren Nervenregeneration.

Regulierung des Schwann-Zellwachstums durch ein gepulstes elektrisches Feld im Nanosekundenbereich für die periphere Nervenregeneration in vitro

Erfahren Sie eine effiziente Methode zur Reinigung von Fibroblasten und Schwann-Zellen aus sensorischen und motorischen Nerven in vitro. Dieses Protokoll ermöglicht Forschern die Untersuchung von Nervenregeneration und Nervenerkrankungen.

Reinigung von Fibroblasten und Schwannzellen von sensorischen und motorischen Nerven in Vitro

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