Identifizierung von Enhancer-Promoter-Kontakten in embryoiden Körpern durch quantitative Chromosomenkonformationserfassung (4C)

Die präzise räumlich-zeitliche Regulierung von Genen wird durch verschiedene cis-regulatorische Elemente gesteuert, die zwischen ihnen interagieren. Unser Protokoll ermöglicht es, Chromatinkontakte ausgewählter Loci wie Promoter quantitativ abzuhören. Diese Technik ermöglicht es uns, die Wechselwirkungsfrequenzen zwischen verschiedenen regulatorischen Elementen gleichzeitig zu identifizieren und zu quantifizieren.

Um embryoiden Körper zu erzeugen, beginnen Sie mit der Kultivierung von embryonalen Stammzellen der Maus zu 60 %iger Konfluenz. Dann entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie zweimal mit zwei Milliliter sterilisierte PBS. Entfernen Sie die PBS vollständig, und fügen Sie zwei Milliliter Zellablösungsmedium hinzu.

Bebrüten Sie das Kulturgericht bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation für fünf Minuten, fügen Sie acht Milliliter EB Differenzierung Medium auf die Schale. Um die mESC-Kolonien zu distanzieren, um eine einzellige Suspension zu erhalten, pipette das Medium 15 bis 20 Mal nach oben und unten und überträgt die Suspension in ein 10-Milliliter-Rohr.

Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300-facher g bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand. Nach dem Zählen der Zellen, setzen Sie das Zellpellet mit EB-Differenzierungsmedium wieder auf.

Umkehren Sie den Deckel eines 15-Zentimeter-Kulturgerichtes. Mit einer 200-Mikroliter-Mehrkanalpipette 20-Mikroliter-Tropfen resuspendierter Zellen auf den Deckel legen. Invertieren Sie den Deckel sorgfältig, und legen Sie ihn auf den unteren Teil des Kulturgerichtes.

Die Schale mit den hängenden Tropfen drei Tage lang bebrüten. Um die Zellen nach der Inkubation zu sammeln, waschen Sie den Deckel vorsichtig mit 10 Milliliter PBS. Übertragen Sie die PBS, die die EBs enthalten wird, auf ein 50-Milliliter-Kunststoffrohr.

Nachdem Sie die Röhre 30 Minuten bei Raumtemperaturen sitzen lassen, entfernen Sie den Überstand vorsichtig. Die EBs werden am unteren Rand des Rohres belassen. Die EBs in 10 Milliliter frischem EB-Differenzierungsmedium vorsichtig wieder aussetzen.

Übertragen Sie die Suspension auf eine 10-Zentimeter-Bakteriologische Petrischale. Drei bis sechs Tage später verwenden Sie ein invertiertes Mikroskop, um die EB-Bildung zu überprüfen. Die EBs sollten rund und homogen sein.

Sammeln Sie die EBs aus zwei oder drei 10-Zentimeter-Geschirr in einem 50-Milliliter-Kunststoffrohr. Zentrifugieren Sie die EBs bei 300 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, und setzen Sie die EBs in 10 Milliliter PBS wieder aus.

Zentrifugieren Sie die EBs bei 300-facher g bei Raumtemperatur wieder, diesmal für drei Minuten. Entfernen Sie den Überstand, und fügen Sie zwei Milliliter Trypsin-EDTA in das Pellet. Inkubieren Sie die Röhre bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten.

Während der Inkubation, Pipette auf und ab alle drei Minuten, um eine einzellige Suspension zu erhalten. Um die Trypsin-Reaktion zu stoppen, fügen Sie acht Milliliter EB-Differenzierungsmedium hinzu. Nach der Wiederaussetzung der Zellen in frischem EB-Medium Paraformaldehyd zu einer Endkonzentration von 1%Inkubieren Sie die Zellen für 10 Minuten bei Raumtemperatur unter Rotation.

Das Formaldehyd durch Zugabe von Glycin zu einer Endkonzentration von 0,125 Mol ablöschen. Schließen Sie den Fixierungsprozess wie im Manuskript beschrieben ab, und fangen Sie dann die Zellpellets in flüssigem Stickstoff ein. Das Zellpellet in einem frisch zubereiteten eiskalten Lysepuffer vorsichtig wieder aufhängen und die Röhre auf Eis legen.

Nach 15 Minuten zentrieren Sie die Zellen bei 1 000 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit 500 Mikroliterkaltlysepuffer. Setzen Sie das Pellet in einem 1,5-Milliliter-Rohr mit 50 Mikrolitern 0,5%SDS in 1x Puffer zwei wieder auf und legen Sie das Rohr in einen Heizblock bei 62 Grad Celsius.

Nach 10 Minuten das Rohr aus dem Heizblock entfernen und Denkpuffer hinzufügen. Mischen Sie gut durch Pipettieren, Vermeidung von übermäßigem Schaum, und bebrüten sie das Rohr bei 37 Grad Celsius. Um eine effiziente Einschränkung der Enzymverdauung zu gewährleisten, haben wir in dieses Protokoll einen sich wiederholenden Verdauungsschritt aufgenommen.

Deshalb ist es auch wichtig, die Kerne im Verdauungspuffer gut auszusetzen. Fügen Sie weitere 25 Mikroliter Verdauungspuffer hinzu, mischen Sie durch Invertieren, und nehmen Sie acht Mikroliter als unverdaute Kontrolle. Bewahren Sie die unverdaute Kontrollprobe bei negativen 20 Grad Celsius auf.

Als nächstes fügen Sie mehrere Aliquots des Restriktionsenzyms Mbol hinzu, das bei 37 Grad Celsius unter Rotation nach jedem Aliquot inkubiert wird. Nehmen Sie acht Mikroliter als verdaute Kontrollprobe. Um beide Kontrollproben zu entkoppeln, fügen Sie 80 Mikroliter TE-Puffer in 10 Mikroliter Proteinase K.Incubate bei 65 Grad Celsius für eine Stunde hinzu.

Um die Verdauungseffizienz zu überprüfen, führen Sie 20-Mikroliter-Aliquots auf einem 0,6%Gel aus. Erfolgreiche Verdauungen zeigen Fragmente meist im Bereich von 3,0 bis 5,0 Kilobase-Paaren. Bereiten Sie DNA für das Scheren vor, wie im Manuskript beschrieben.

Verwenden Sie einen Beschallungsgerät, um die DNA auf eine Größe von 150 bis 700 Basenpaaren zu scheren. Übertragen Sie die geerschte DNA in ein normales neues Safe-Lock-Rohr, das mehrere Beschallungen aus derselben Probe bündelt. Fügen Sie erwärmte DNA-Reinigungsperlen in einer Menge hinzu, die dem 1,8-fachen des vorhandenen Volumens entspricht, und mischen Sie sie durch Resuspendieren.

Nach fünf Minuten Inkubation die Perlen mit einem magnetischen Rack sammeln. Halten Sie die Schläuche im magnetischen Rack, waschen Sie die Perlen zwei Mal mit einem Milliliter frisch zubereitetem 80%Ethanol. Nach dem Lufttrocknen der Perlen bei Raumtemperatur für zwei bis drei Minuten, elute die DNA durch Wiederaufhängen der Perlen in 1x Tris Puffer.

Mit der Hang-Drop-Methode wurde sechs Tage nach der Einführung der ESC-Differenzierung eine homogene Population von EBs gewonnen. Die Gelelektrophorese wurde während des gesamten Protokolls zur Qualitätskontrolle durchgeführt. Effiziente Verdauung durch Mbol führt zu Fragmenten von weniger als drei Kilobase-Paaren.

Die Elektrophorese nach der Ligation zeigte, dass die meisten Fragmente größer als drei Kilobase-Paare waren. Fragmentgrößen von 400 bis 500 Basenpaaren werden nach der Beschallung erwartet. Nach Dephosphorylierung und Single-End-Adapterligation wurden zwei Runden PCR durchgeführt, um die Ziele des Interesses zu verstärken.

Jedes Ziel wurde separat mit zwei verschiedenen Primerpaaren, A und B für den Pou5f1-Lokus und C und D für den T-Lokus, verstärkt. Dies führte zu einem DNA-Abstrich um 400 Basenpaare. Alternativ wurde Multiplex-PCR durchgeführt, um die Ziele A und C gleichzeitig zu verstärken, was nach der Reinigung zu einer ähnlichen Fragmentgröße führte.

In diesen 4C-Profilen zeigen die hellblauen Boxen die Position von Enhancern mit dynamischen Änderungen während der Differenzierung an. Chromatin-Regionen kontaktieren während der EB-Differenzierung mit Promotoren der Pou5f1- und T-Gene. Pou5f1 wurde während der EB-Differenzierung downreguliert.

Umgekehrt wurde T während der EB-Differenzierung hochreguliert. Effiziente Restriktionsenzymverdauung und dann die Nähe der kreuzenden genomischen DNA sind Schlüsselfaktoren für den Erfolg dieses Protokolls. Eine andere Sache ist das Primer-Design, um die Kontaktkarte jedes Locus abzuhören.

Dieses Verfahren ist ideal geeignet, um den Chromatinkontakt an gezielten Loci abzuhören. Wenn globale Veränderungen erforderlich sind, könnten genomweite Ansätze wie Hi-C, Promoter Capture Hi-C oder HiChIP durchgeführt werden.