TMT-Beispielvorbereitung für proteomics Facility Submission und nachfolgende Datenanalyse

Die Hauptvorteile dieses Protokolls sind, dass es die Kosten für die Etikettierung senkt, die Proteinextraktion verbessert und qualitativ hochwertige Daten generiert. Die Hauptvorteile unseres Protokolls sind die hohe Kennzeichnungseffizienz für die verschiedenen Probentypen, seine Reproduzierbarkeit und die zuverlässige Datenerfassung. Nach der Isolierung Quadrizeps Muskelgewebe Proben von einer eingeschläferten Maus nach einem IACUC genehmigten Protokoll, wiegen 10 Milligramm Muskelgewebe und verwenden Pinzette, um die Muskelfasern zu trennen.

Um ein Lysat zu erstellen, übertragen Sie die getrennte Gewebeprobe in ein Zwei-Milliliter-Rohr mit 200 Mikrolitern eines Millimeters von einem Millimeter Zirkonia Kieselsäureperlen und 500 Mikroliter CHAPS-Lysepuffer. Platzieren Sie die Samples in einem Perlenstörer und führen Sie zwei sequenzielle 45-Sekunden-Durchläufe durch. Nach dem zweiten Zyklus, um das DNA-gebundene Protein freizugeben, beschallen Sie die Probe 10 Mal für 10 Sekunden pro Beschallung bei einer 50%amplitude mit 30-Sekunden-Intervallen auf Eis.

Nach der letzten Beschallung zentrieren Sie das Lysat und übertragen Sie den Überstand in ein neues Zentrifugenrohr. Zur Reduktion/Alkylierung reagenzbehandlung 200 Mikrogramm Protein pro Zustand in neue Zentrifugenröhrchen übertragen und mit frischem CHAPS-Lysepuffer das Endvolumen in jedem Rohr auf bis zu 100 Mikroliter bringen. Als nächstes fügen Sie fünf Mikroliter TCEP zu jeder Röhre hinzu und brüten die Proben bei 55 Grad Celsius für eine Stunde.

Am Ende der Inkubation neun Milligramm Iodoacetamid in 132 Mikrolitern von 100 Millimolar TEAB auflösen und die resultierende 375 Millimolar-Iodoacetamid-Lösung vor Licht schützen. Dann fügen Sie fünf Mikroliter Iodoacetamid zu jeder Probe und inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur vor Licht geschützt. Für Methanol/Chlorform-Fällung 400 Mikroliter Methanol zu je 100 Mikroliter Protein hinzufügen und die Proben kurz wirbeln.

Um die an den Seiten der Probenröhrchen abgelagerten Flüssigkeiten zu integrieren, zentrieren Sie die Proben kurz und fügen Sie jedem Rohr 100 Mikroliter Chloroform hinzu. Nach einem kurzen Wirbeln die Rohre schnell wieder zentrifugieren, um die Flüssigkeit an den Seiten der Rohre zu sammeln und 300 Mikroliter Wasser in die Proben zu geben. Wirbel kräftig, um homogene Lösungen zu erhalten und zentrifugieren Sie die Proben für eine Minute unter den gleichen Zentrifugenbedingungen.

Am Ende der Zentrifuge die Rohre vorsichtig in ein Rack geben, ohne die Schichten zu stören, und den Überstand vorsichtig entfernen. 300 Mikroliter Methanol in die verbleibenden Zwischen- und Unterphasen geben und die Proben wieder kräftig wirbeln. Zentrifugieren Sie die Proben für zwei Minuten und aspirieren Sie die Überstande sorgfältig.

Dann vorsichtig so viel Flüssigkeit wie möglich aus jeder Probe unter einem Luftstrom ansaugen, bis die Pellets nur ein wenig feucht sind. Bewerten Sie die Hydratation alle zwei Minuten für ca. 10 Minuten. Bei Bedarf können die Pellets bis zur Weiterverarbeitung bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.

Um das Protein zu verdauen, setzen Sie das gefällte Pellet in 100 Mikroliter TEAB-Lysepuffer wieder auf und fügen Sie 100 Mikroliter Trypsin-Speicherlösung auf den Boden einer 100-Mikrogramm-Trypsin-Glas-Flasche. Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur 2,5 Mikroliter der frisch zubereiteten Trypsinlösung pro 100 Mikrogramm Protein in jede Probe geben und die Proben über Nacht bei 37 Grad Celsius bebrüten. Für die Peptidkennzeichnung jede 0,8 Milligramm TMT-Tag-Durchstechflasche mit 41 Mikrolitern wasserfreiem Acetonitril pro Tag auflösen und die Reagenzien bei Raumtemperatur fünf Minuten lang bei gelegentlichem Wirbeln inkubieren und dabei die Etiketten vor Licht schützen.

Am Ende der Inkubation die Fläschchen kurz zentrifugieren und 41 Mikroliter TMT-Etikettenreagenz vorsichtig zu jeder 100-Mikroliter-Probe für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur hinzufügen. Am Ende der Inkubation, löschen Sie die Reaktionen mit der Zugabe von acht Mikroliter von 5%Hydroxylamin für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Dann teilen Sie die Proben in gleiche Aliquots in neuen Zentrifugenrohren für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius auf.

In dieser repräsentativen Datenerfassung wurden 39 653 Gesamtpeptide analysiert, von denen 4 457 gleich oder größer als zwei eindeutige Peptide und 3, 829 Reporterionen für alle Kanäle enthielten. Ein Faltenwechsel-Cutoff wurde verwendet, um die relative Verteilung von Proteinen von erkrankten im Vergleich zu gesunden Zellen mit 296 Proteinen mit deutlich geringerer Häufigkeit und 108 Proteinen mit signifikant höherer Häufigkeit zu bestimmen. Die PANTHER-Analyse zeigte eine kategorisierte Liste von Proteinen, die auf einer deutlich geringeren oder höheren Häufigkeit kranker Zellen basierend auf ihrer molekularen Funktion basieren.

Die String-Analyse der Proteine mit signifikant niedrigerer oder höherer Häufigkeit identifizierte weiter mehrere Wechselwirkungen und starke Assoziationen zwischen Proteinen. Zusätzliche Methoden können durchgeführt werden, um Protein-zu-Protein-Wechselwirkungen zu identifizieren, die Wechselwirkungen nach Gruppen zu klassifizieren und die Wechselwirkungen in einer Vielzahl von Pfaden zu identifizieren. Proteomics-Techniken sind leistungsstarke Werkzeuge in den biomedizinischen Forschungsbereichen, um die Mechanismen der Krankheitsentwicklung zu verstehen, indem detaillierte Proteinüberflussinformationen zur Verfügung gestellt werden.