Name: Beurteilung der altersspezifischen phagozytischen Fähigkeit von adulten Drosophila melanogaster Hämozyten mit einem In Vivo Phagozytose-Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Lernen Sie einen In-Vivo-Phagozytose-Assay zur Bewertung altersspezifischer Fähigkeiten von Drosophila melanogaster Hämozyten. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung phagozytischer Ereignisse in einzelnen Zellen und erleichtert genetische Vergleiche.

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Diese Arbeit wurde durch Stipendien der National Institutes of Health R061484-02 und des UMBC College of Natural and Mathematical Sciences Becton Dickinson Faculty Research Fund unterstützt.

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<li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemese%2C+a+hemocyte-specific+transmembrane+protein%2C+affects+the+cellular+immune+response+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2622-2627 (2003).</li>
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<li>Ghosh, S., Mandal, S., Mandal, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+proliferation+of+adult+hemocytes+in+Drosophila+by+BrdU+incorporation+and+PH3+expression+in+response+to+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Wellcome+Open+Research%22%5BJournal%5D)">Detecting proliferation of adult hemocytes in Drosophila by BrdU incorporation and PH3 expression in response to bacterial infection.</a> Wellcome Open Research. 3, (2018).</li>
<li>Hao, Y., Yu, S., Luo, F., Jin, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jumu+is+required+for+circulating+hemocyte+differentiation+and+phagocytosis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">Jumu is required for circulating hemocyte differentiation and phagocytosis in Drosophila.</a> Cell Communication and Signaling. 16 (1), 95(2018).</li>
<li>Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+blood+cell+populations+of+the+Drosophila+melanogaster+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assaying blood cell populations of the Drosophila melanogaster larva.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).</li>
<li>Gyoergy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+allowing+independent+visualization+and+genetic+manipulation+of+Drosophila+melanogaster+macrophages+and+surrounding+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tools allowing independent visualization and genetic manipulation of Drosophila melanogaster macrophages and surrounding Tissues.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (3), 845-857 (2018).</li>
<li>Bosch, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+cells+of+adult+Drosophila+do+not+expand%2C+but+control+survival+after+bacterial+infection+by+induction+of+Drosocin+around+their+reservoir+at+the+respiratory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Blood cells of adult Drosophila do not expand, but control survival after bacterial infection by induction of Drosocin around their reservoir at the respiratory epithelia.</a> BioRxiv. 578864, (2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das hier beschriebene Protokoll ist eine zuverlässige Möglichkeit, verschiedene Aspekte der Phagozytose unter kontrollierten experimentellen Bedingungen zu quantifizieren. Wir stellen fest, dass wir dieses Verfahren nur mit gramnegativen Bakterienpartikeln getestet haben und die Ergebnisse können sich unterscheiden, wenn grampositive Bakterienpartikel verwendet werden. In der Tat wäre es interessant, die phagozytischen Reaktionen auf gramnegative und grampositive Bakterien unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu vergleichen. Der Einsatz eines Nano-Injektors ermöglicht eine präzise Kontrolle der Injektionsvolumina und stellt sicher, dass jede Fliege mit dem gleichen Partikelvolumen injiziert wird. Eine Einschränkung des Protokolls liegt in Inkonsistenzen bei Partikelpräparaten. Partikel aggregieren, sobald sie gefroren sind, so dass kleine Schwankungen der Verdünnungsvolumina oder der Mangel an Wirbeln die Partikelkonzentration zwischen den Experimenten beeinflussen können. Um mögliche Schwankungen der Partikelkonzentrationen zwischen den Alterszufällen zu minimieren, ist es von Vorteil, 1- und 5-wöchige fliegen am selben Tag mit der gleichen Nadel- und Partikellösung zu injizieren. Ein weiterer möglicher Nachteil ist, dass bei Sezierungen das Rückengefäß und/oder die Nagelhaut leicht beschädigt werden können, wenn Die Stifte nicht richtig behandelt werden. Um eine Störung des Dorsalgefäßes zu vermeiden, minimieren Sie die Anzahl der pro Sezieren verwendeten Pins. Der Vorteil dieser Seziermethode ist, dass alle Fixier-, Wasch- und Färbeschritte in der Sezierplatte durchgeführt werden können. Da die Nagelhaut festgezurrt sind, verhindert dies, dass die Nagelhaut zwischen den Stufen verloren geht.
Im Vergleich zu den bestehenden Methoden18,19,25,26,27,28,29hat das beschriebene Protokoll seine Vor- und Nachteile. Durch die Sezieren des Dorsalgefäßes sind wir in der Lage, einzelne Hämozyten an dieser Stelle zu visualisieren und zu quantifizieren. Dies ermöglicht es, subtile Variationen der phagozytischen Aktivität zwischen experimentellen Gruppen zu erkennen. Andere Methoden visualisieren fluoreszierend markierte Partikel durch das Sammeln von Hämozyten mit einem Bleed/Scrape Assay19,25,26,27, oder durch eine intakte ventrale Nagelhaut18,19,28,29; einzelne Hämozyten können jedoch nicht beurteilt werden, wenn sie durch die dorsale Nagelhaut visualisiert werden. Der Vorteil dieses Protokolls im Vergleich zur Bleed/Scrape-Methode besteht darin, dass unsere Methode es uns ermöglicht, nur die Hämozyten zu bewerten, die mit dem Dorsalgefäß verbunden sind, und dass wir zirkulierende Zellen oder solche entlang der Körperwand berücksichtigen, die funktional unterschiedlich sein können. Die Sezieren des dorsalen Gefäßes beseitigt auch die Notwendigkeit, eine zweite Runde von Injektionen mit einem Fluoreszenz-Quencher, wie Trypan blue19,26. Dies liegt daran, dass alle Partikel, die nicht an eine Zelle gebunden oder von ihr verschlungen werden, während der Waschschritte weggewaschen werden. Umgekehrt können alternative Methoden einfacher durchzuführen sein, da sie keine Sezierungen erfordern. Während die Sezieren des dorsalen Gefäßes leicht zu erlernen ist, fügt dieser Schritt eine Komplexität hinzu, die in einigen experimentellen Designs möglicherweise nicht möglich ist.
Obwohl die beschriebene Verwendung dieses in vivo phagozytose-Assays darin besteht, phagozytische Ereignisse zwischen verschiedenen Altersgruppen zu bewerten und zu quantifizieren, ist dieses Protokoll sehr anpassungsfähig und kann verwendet werden, um verschiedene Aspekte der Phagozytose zwischen Genotyp, Geschlecht oder Gewebetyp zu analysieren. Da Phagozytose für die meisten mehrzelligen Tiere von zentraler Bedeutung ist, könnte das Verständnis, wie dieser Prozess mit dem Alter abnimmt, zu besseren therapeutischen Behandlungen für die alternde Bevölkerung führen. Dieser Ansatz bietet langfristiges Potenzial zur Aufklärung von Aspekten altersbedingter Veränderungen der Immunantwort, mit besonderem Fokus auf Phagozytose.

Das angeborene Immunsystem, das aus physikalischen und chemischen Infektionsbarrieren sowie zellulären Komponenten besteht, ist evolutionär konserviert über mehrzellige Organismen1,2. Als erste Verteidigungslinie spielt das angeborene Immunsystem eine entscheidende Rolle bei der Bekämpfung eindringender Krankheitserreger bei allen Tieren1,2,3. Die Komponenten der angeborenen Immunantwort umfassen eine breite Palette von Zelltypen, die auf der Grundlage klassifiziert werden, dass sie Spezifität und immunologisches Gedächtnisfehlen 2,3,4. Beim Menschen, Diese Zelltypen gehören phagozytische Monozyten und Makrophagen, Neutrophile, und zytotoxische natürliche Killerzellen4,5. Während ein funktionelles Immunsystem für das Überleben des Wirts unerlässlich ist, ist es klar, dass die Funktion von Immunzellen mit dem Alter abnimmt, ein Phänomen, das als Immunoseneszenz5,6bekannt ist. Die Möglichkeit, altersbedingte Veränderungen der Immunantwort zu bewerten, einschließlich verschiedener Aspekte des Phagozytoseprozesses, könnte unser Verständnis der Immunseneszenz unterstützen. Das Verfahren, das wir hier beschreiben, bietet einen effektiven und wiederholbaren Ansatz zur Bewertung und Quantifizierung phagozytischer Ereignisse durch Hämozyten in Drosophila melanogaster.
Drosophila ist ein ideales Modell, um die Immunantwort aus vielen Gründen zu studieren. Zum einen gibt es eine umfangreiche Reihe genetischer Werkzeuge, die es ermöglichen, die Genexpression auf gewebeabhängige Weise leicht zu manipulieren7. Diese Werkzeuge umfassen eine Sammlung von Mutanten, RNA-Interferenzbeständen, GAL4/UAS-Beständen und dem Drosophila Genetic Reference Panel, das 205 verschiedene Inzuchtlinien enthält, für die die gesamten Genomsequenzen katalogisiert sind8. Der kurze Lebenszyklus von Drosophila und die große Anzahl von Individuen produziert ermöglichen es Forschern, mehrere Personen in einer kontrollierten Umgebung zu testen, in kurzer Zeit. Dies verbessert erheblich die Fähigkeit, subtile Unterschiede in der Immunantwort auf Infektionen bei Genotypen, zwischen Dengeschlechtern oder über das Alter hinweg zu identifizieren. Wichtig ist, dass viele genetische Komponenten und Funktionen der angeborenen Immunantwort, einschließlich Phagozytose, evolutionär zwischen Drosophila und Säugetieren1,2konserviert werden.
In Drosophila wird der Prozess der Phagozytose, der auf eine Infektion folgt, von phagozytischen Hämozyten, sogenannten Plasmatozyten, durchgeführt, die denMakrophagenvon Säugetieren 9 entsprechen. Hämozyten sind wichtig, um eine breite Palette von Partikeln zu erkennen und mikrobielle Krankheitserregerzulöschen 9,10,11,12,13. Diese Zellen drücken eine Vielzahl von Rezeptoren aus, die sich selbst von Nicht-Selbst unterscheiden müssen, und initiieren Signalereignisse, die erforderlich sind, um den phagozytischen Prozess durchzuführen10,11,12,13,14,15., Sobald ein Teilchen gebunden ist, beginnt es durch Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts und Remodellierung der Plasmamembran verinnerlicht zu werden, um das Teilchen zu erweitern, und bildet einen phagozytischen Becher11,12,13,14. Während dieses Prozesses weist ein weiterer Satz von Signalen die Zelle an, das Teilchen weiter zu verinnerlichen, indem sie den phagozytischen Becher schließt und ein membrangebundenes Phagosom11,12,,13,14,15bildet. Das Phagosom durchläuft dann einen Reifungsprozess, der mit verschiedenen Proteinen assoziiert und mit Lysosomen verschwoben wird, wodurch ein saures Phagolysom11,12,13,14,15gebildet wird. An dieser Stelle können Partikel effizient abgebaut und eliminiert werden11,12,13,14,15. Drosophila-Studien haben gezeigt, dass ältere Fliegen (4 Wochen alt) haben eine verminderte Fähigkeit, eine Infektion im Vergleich zu jüngeren Fliegen zu löschen (1 Woche alt), wahrscheinlich aufgrund, zumindest teilweise, auf einen Rückgang in einigen Aspekten der Phagozytose16,17.
Das hier beschriebene Verfahren verwendet zwei separate fluoreszierend markierte wärmeabgetötete E. coli-Partikel, von denen eines ein Standardfluorophor und eines mit pH-Empfindlichkeit trägt, um zwei verschiedene Aspekte der Phagozytose zu bewerten: die anfängliche Verschlingtheit von Partikeln und den Abbau von Partikeln im Phagolysosom. In diesem Test ist die Fluor-Partikel-Fluoreszenz beobachtbar, wenn die Teilchen durch Hämozyten gebunden und verschlungen werden, während pH-empfindliche Partikel nur unter den niedrigen pH-Bedingungen des Phagosomfluores fluoreszieren. Fluoreszierende Ereignisse können dann in Hämozyten beobachtet werden, die entlang des Dorsalgefäßes lokalisieren. Wir konzentrieren uns auf Hämozyten, die auf das Dorsalgefäß lokalisiert sind, die ein anatomisches Wahrzeichen darstellen, um Hämozyten zu lokalisieren, von denen bekannt ist, dass sie zur bakteriellen Clearance beitragen, und sie konsequent zu isolieren. Aber auch Hämozyten in anderen Teilen des Körpers und der Hämolymphe sind wichtig für die Clearance. Obwohl wir diese Zellpopulation nicht untersucht haben, könnte unser allgemeines Verfahren auch für phagozytische Assays dieser Zellen anwendbar sein. Ein Vorteil unseres Ansatzes ist, dass wir phagozytische Ereignisse innerhalb einzelner Hämozyten quantifizieren können, was es uns ermöglicht, subtile Variationen in phagozytischen Prozessen zu erkennen. Andere Studien, die fluoreszierende Ereignisse durch die Nagelhaut18,19 visualisieren, berücksichtigen keine Unterschiede in der Anzahl der vorhandenen Hämozyten, was in unserem Fall besonders wichtig ist, da sich die Gesamtzahl der Hämozyten mit17Jahren ändern dürfte.

<table><tbody><tr><td>0,10 mm Insektenstifte</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Hier: Stifte werden in zwei Hälften geschnitten und das scharfe Ende wird verwendet</td></tr><tr><td>1 mL sterile Spritzen</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td>Mit Mineralöl gefüllt zum Laden der Nadel</td></tr><tr><td>15% Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>für Seziermedien</td></tr><tr><td>16 % Paraformaldehyd</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15710</td><td>EM-Qualität, 4% arbeitend, verdünnt in 1X PBS</td></tr><tr><td>1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Trasnfer Pipette</td><td>Falcon</td><td>357524</td><td></td></tr><tr><td>3,5" Glaskapillaren</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td>1,14 mm AD x 3,5" Länge x 0,53" ID</td></tr><tr><td>35x10 mm Petrischalen</td><td>Becton Dickinson</td><td>351008</td><td>Wird als Sezierplatte verwendet, zur Hälfte gefüllt mit Sylgard</td></tr><tr><td>6x Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>für Dissektionsmedien</td></tr><tr><td>70% Glycerin</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Analoger Vortex-Mischer</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Biologische Punktzange, Dumont Nr. 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole</td><td>)Life Technologies</td><td>D1306</td><td>Verdünnt 1:1000 in 1x PBST</td></tr><tr><td>Drosophila Stamm</td><td></td><td></td><td>w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8</td></tr><tr><td>E. coli (K-12 Stamm) BioParticles&trade;, Alexa Fluor&trade; 594 Konjugat</td><td>Life Technologies</td><td>E23370</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Objektträger</td><td>Premiere</td><td>D17026102</td><td></td></tr><tr><td>Lebendzell-Imaging-Lösung</td><td>Life Technologies</td><td>A14291DJ</td><td>bevorzugter Puffer für die Partikelvorbereitung und -verdünnung</td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Mpbio</td><td></td><td></td>194836</tr><tr><td>Nanoject II automatischer Nanoliter-Injektor</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Schmales Polystyrol Super Bulk Drosophila Fläschchen</td><td>Genesee</td><td>32-116SB</td><td>Größe: 25 x 95 mm</td></tr><tr><td>Benussmischer</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-043</td><td>Verwendete Drehzahl: 20 U/min</td></tr><tr><td>pHrodo & Handel; Rote E. coli BioPartikel&Handel; Konjugat für Phagozytose</td><td>Life Technologies</td><td>P35361</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's Drosophila Zellkulturmedien (1x)</td><td>Gibco</td><td>21720-024</td><td>Dissektionsmedien, kombinieren: Schneiders, FBS und Pen/Streptokokken; Filter sterilisieren</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>2mM (oder 20%) arbeiten</td></tr><tr><td>Federschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikonelastomer</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>24236-10</td><td>Bereiten Sie gemäß dem bereitgestellten Protokoll</td></tr><tr><td>vor Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>Für PBS + 0,1% Tween</td></tr><tr><td>Vertikaler Pipettenabzieher Modell 700C</td><td>David Kopf Instruments</td><td>812368</td><td>Heizung: 55? Magnet: 45</td></tr><tr><td>Zeiss AxioImager.Z1 Fluoreszenzmikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Hier: Apotome Strukturinterferenzsystem mit Zeiss Zen Imaging Software</td></tr></tbody></table>

beurteilung der altersspezifischen phagozytischen fähigkeit von adulten drosophila melanogaster hämozyten mit einem in vivo phagozytose-assay

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagozytose ist eine wesentliche Funktion der angeborenen Immunantwort. Dieser Prozess wird von phagozytischen Hämozyten durchgeführt, deren primäre Funktion darin besteht, eine Vielzahl von Partikeln zu erkennen und mikrobielle Krankheitserreger zu zerstören. Wenn Organismen altern, beginnt dieser Prozess zu sinken, aber wenig ist über die zugrunde liegenden Mechanismen oder die genetische Grundlage der Immunseneszenz bekannt. Hier wird eine In-vivo-Phagozytose-Assay verwendet, um altersbedingte Veränderungen in verschiedenen Aspekten der Phagozytose, wie Bindung, Verschleierung und Abbau von internalisierten Partikeln, zu bewerten, indem phagozytische Ereignisse in Hämozyten bei erwachsenen Drosophila quantifiziert werden. Drosophila melanogaster ist aus vielen Gründen zu einem idealen Modell geworden, um altersbedingte Veränderungen in der angeborenen Immunfunktion zu untersuchen. Zum einen sind viele genetische Komponenten und Funktionen der angeborenen Immunantwort, einschließlich Phagozytose, evolutionär zwischen Drosophila und Säugetieren konserviert. Aus diesem Grund, Ergebnisse aus der Verwendung dieses Protokolls erhalten sind wahrscheinlich weithin relevant für das Verständnis der altersbedingten Veränderungen in der Immunfunktion in einer Vielzahl von Organismen. Darüber hinaus stellen wir fest, dass diese Methode quantitative Schätzungen der hämozytischen phagozytischen Fähigkeit bietet, die für eine Vielzahl von Forschungsthemen nützlich sein könnte und sich nicht auf Studien über das Altern beschränken muss.

Zur Veranschaulichung der beschriebenen Injektionsmethoden zeigt Abbildung 1A die Injektionsstelle auf Drosophila melanogaster, sowie wie Lebensmittelfarbstoff eine visuelle Bestätigung ermöglicht, dass die Fliege injiziert wurde (Abbildung 1B). Die Zugabe von Lebensmittelfarbstoffen hilft auch bei der Erkennung einer verstopften Nadel. Injektionen können im Bauch durchgeführt werden, aber halten Sie die Injektionsstelle konsistent über Experimente. Dies wird dazu beitragen, mögliche Variationen zwischen den einzelnen Experimenten zu minimieren.
Um die fluoreszierend markierten Partikel in den ansässigen Hämozyten entlang des Dorsalgefäßes zu visualisieren, sezierten wir das Rückengefäß und befestigten Bauchhaut. Abbildung 2A-F zeigt die Seziermethoden.
Um die altersspezifische Fähigkeit von jungen und gealterten Fliegen zur Phagozytose zu beurteilen, werden Hämozyten entlang des Rückengefäßes mit einem Fluoreszenzmikroskop visualisiert. Um sicherzustellen, dass nur Zellen entlang des Rückengefäßes gezählt werden, können Antikörper oder GFP-markierte Gene für bestimmte Blutzellmarker oder herzspezifisches Kollagen, wie Hemese und Hemolectin oder Pericardin (Abbildung 3), verwendet werden22,23,24. Fluoreszierend beschriftete E. coli-Partikel sind 1 mm lang, Hämozyten 10 mm im Durchmesser17. Es werden nur die fluoreszierenden Ereignisse mit einem Durchmesser von 10 mm gezählt, die auf einem DAPI-positiven Kern zentriert sind (Abbildung 4). Zur Quantifizierung fluoreszierender Ereignisse wird ImageJ-Software verwendet (Abbildung 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig1.jpg"> Abbildung 1: Injektionsstelle und visuelle Überprüfung. (A) Die Seitenseite des Thorax wird mit einer gezogenen Kapillarnadel durchbohrt. (B) Injektionen werden visuell überprüft, indem der Partikellösung grüner Lebensmittelfarbstoff hinzugefügt wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig2.jpg"> Abbildung 2: Dorsale Gefäßsektion. (A) Pins werden in den Thorax und den hinteren Bauch (schwarze Pfeile) gelegt. (B-C) Zwei horizontale Einschnitte (grüne Pfeile) werden am hinteren Ende des Bauches (B) und am vorderen Ende (C) gemacht. (D) Ein vertikaler Schnitt (grüner Pfeil) wird in der Mitte des Bauches gemacht, der die beiden horizontalen Schnitte verbindet. (E) Optionale Stifte (*) werden verwendet, um die Bauchhöhle zu öffnen und das innere Gewebe freizulegen. (F) Innengewebe (Pflanze, Darm, Gebärmutter, Eierstöcke, Fettkörper) wird entfernt und setzt das Rückengefäß frei. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig3.jpg"> Abbildung 3: Ventralansicht eines sezierten Dorsalgefäßes eines 5 Wochen alten Weibchens, das mit pH-empfindlichen Partikeln injiziert wurde, mit Antikörpern gegen Pericardin ( A)gefärbt. Gepunktete weiße Linie umreißt die seitliche Seite des Rückengefäßes, wobei der Pfeil auf den vorderen Bereich zeigt. (B) Vergrößertes Bild von (A): Hämozytenhaufen (blauer Pfeil), die aktiv Bakterien abbauen, innerhalb der ersten Aortenkammer des Rückengefäßes. (C) Vergrößertes Bild von (A) umreißt das kollagenartige Protein Pericardin (grüner Pfeil), das das dorsale Gefäß an Platz24hält. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig4.jpg"> Abbildung 4: Seziertes Rückengefäß und zugehörige Hämozyten einer weiblichen Fliege, die mit pH-empfindlichen Partikeln oder Fluorpartikeln injiziert wird. (A) Das Dorsalgefäß und die zugehörigen Hämozyten mit verschlungenen pH-empfindlich enkoehrenden E. coli-Partikeln (rot) oder (E) fluormarkierten E. coli-Partikeln (rot), isoliert von einer 1-wöchigen Fliege, nach 60 min. (B,F) Vergrößerter Einset von (A) bzw. (E) (weißes Feld), das zwei einzelne Hämozyten zeigt. (C) Das Dorsalgefäß und die zugehörigen Hämozyten mit verschlungenen pH-empfindlich enkoehrenden E. coli-Partikeln(rot) oder ( G ) fluormarkierten E. coli-Partikeln (rot), isoliert von einer 5 Wochen alten Fliege, nach 60 min. (D,H) Vergrößerter Einset von (C) bzw. ( G) (weißes Feld), das zwei einzelne Hämozyten zeigt.G Gepunktete weiße Linie umreißt die seitliche Seite des Rückengefäßes, wobei der Pfeil auf den vorderen Bereich zeigt. Mit DAPI (blau) gebeizte Kerne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60983/60983fig5.jpg"> Abbildung 5: Quantifizierung phagozytischer Ereignisse innerhalb von 10 mm Hämozyten mithilfe des Zellzählers in ImageJ. (A) Nach dem Öffnen von Bildern in ImageJ kann das Werkzeug Zellzählerbenachrichtigung verwendet werden, um phagozytische Ereignisse pro Zelle nachzuverfolgen. (B) Dieses Werkzeug weist jeder Zelle, die ausgewählt wurde, eine andere Farbe zu, wobei jeder Punkt einem fluoreszierenden Ereignis innerhalb dieser Zelleentspricht. Wenn Sie 'alt+y' drücken, wird eine Tabelle mit der Anzahl der pro Zelle gezählten Ereignisse angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60983/60983fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt einen In-vivo-Test der Phagozytose zur Beurteilung und Quantifizierung der Fähigkeit junger und alter Drosophila melanogaster Hämozyten an Phagozytosebakterien..

Beurteilung der altersspezifischen phagozytischen Fähigkeit von adulten Drosophila melanogaster Hämozyten mit einem In Vivo Phagozytose-Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Unser Protokoll bietet einen effektiven und wiederholbaren Ansatz zur Bewertung und Quantifizierung phagozytischer Ereignisse in Hämozyten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir phagozytische Ereignisse innerhalb einzelner Hämozyten quantifizieren können, was es uns ermöglicht, Variationen in phagozytischen Prozessen zwischen Genotypen in einzelnen Fliegen zu erkennen. Das Durchführen von Sezierungen kann eine Herausforderung sein, daher üben Sie bei der erstmaligen Durchführung dieser Technik so viel wie möglich, bevor Sie den vollständigen Vorgang durchführen.Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Glasnadeln für die Injektion. Füllen Sie eine ein Millimeter Spritze mit Mineralöl und befestigen Sie die 30 Gauge hypodermische Nadel, die mit dem Nano-Injektor versehen ist. Setzen Sie die 30-Spur-Nadel in das stumpfe Ende einer gezogenen Kapillarnadel ein und füllen Sie sie mit Mineralöl.Entfernen Sie langsam die 30-Spur-Nadel, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen gebildet werden. Entfernen Sie die Spannzange und legen Sie den versiegelten O-Ring mit dem Einzug nach oben. Legen Sie den größeren O-Ring auf den Metallkolben, und befestigen Sie die Spannzange dann wieder ohne Anziehen.Setzen Sie den Metallkolben in das stumpfe Ende der ölgefüllten Glasnadel ein und drücken Sie ihn vorsichtig nach unten, indem Sie ihn in den größeren O-Ring einsetzen. Dann ziehen Sie die Spannzange fest. Nach dem Füllen der Nadel mit Fluor- oder pH-empfindlichen Partikeln, injizieren Sie die Fliegen in die sternopleturische Platte des Thorax.Die Injektion ist erfolgreich, wenn der grüne Farbstoff in die Fliege geht. Legen Sie die injizierten Fliegen in eine neue Lebensmittel-Durchstechflasche, die die Zeit angibt, in der die erste und letzte Fliege injiziert wurden. Legen Sie die Durchstechflasche auf ihre Seite, bis sich alle Fliegen erholt haben, um zu verhindern, dass sie in der Nahrung stecken bleiben.Richten Sie die fliegende ventrale Seite unter einem sezierenden Stereomikroskop nach oben aus. Dann legen Sie einen Insektenstift in den Thorax und eine andere durch das hintere Ende des Bauches in der Nähe der Genitalien. Sobald alle Fliegen angeheftet sind, verwenden Sie eine Transferpipette, um genügend Seziermedien hinzuzufügen, um die Fliegen abzudecken.Entfernen Sie den Kopf mit der Nagelhautschere, und machen Sie einen horizontalen Schnitt direkt über der hinteren Stecknadel im Bauch, dann einen weiteren am vorderen Ende des Bauches. Machen Sie einen vertikalen Schnitt, der die beiden horizontalen Schnitte verbindet, die die Bauchhöhle öffnen. Verwenden Sie Zangen, um die inneren Organe und Gewebe zu entfernen, stellen Sie sicher, dass das dorsale Gefäß zu vermeiden.Verwenden Sie bei Bedarf zusätzliche Stifte, um die geschnittenen Enden der Nagelhaut zu sichern. Dann den Thorax mit der Nagelschere entfernen. Entsorgen Sie die Seziermedien und ersetzen Sie sie durch einen Milliliter 4%PFA, um die Sezierungen so weit wie möglich vor Licht zu schützen.Fixieren Sie die Abschnitte für 15 Minuten bei Raumtemperatur, während Sie bei 20 Umdrehungen pro Minute schaukeln. Entfernen Sie dann das Fixativ und fügen Sie einen Milliliter 1X PBST hinzu. Wenn gewünscht, färben Sie die Abschnitte mit Antikörpern.Nach der Montage der Nagelhaut auf einem Mikroskopschlitten, verwenden Sie Zangen, um sie ventrale Seite nach oben zu orientieren, und stellen Sie sicher, dass das Dorsalgefäß sichtbar ist. Junge und gealterte Fliegen wurden auf altersspezifische Fähigkeit zur Phagozytose durch fluoreszierende Bildgebung von Hämozyten entlang des Dorsalgefäßes untersucht. Ein Antikörper gegen Perikardin wurde verwendet, um sicherzustellen, dass nur Zellen entlang des Dorsalgefäßes gezählt wurden.Da fluoreszierend markierte E.coli-Partikel einen Mikrometer lang sind und Hämozyten einen Durchmesser von 10 Mikrometern haben, wurden nur fluoreszierende Ereignisse innerhalb eines Durchmessers von 10 Mikrometern gezählt, die auf einem DAPI-positiven Kern zentriert sind. ImageJ-Software wurde dann verwendet, um die Ereignisse zu quantifizieren. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich vorzustellen, dass die Fliege tatsächlich injiziert wurde, und sich daran zu erinnern, dass Timing entscheidend ist.Das rechtzeitige Abschließen von Injektionen und Sezierungen wird dazu beitragen, experimentelle Fehler und mögliche Schwankungen der phagozytischen Rate zu minimieren. Diese Technik wird es Forschern ermöglichen, eine Vielzahl von Forschungsthemen zu erforschen, einschließlich Fragen über zelluläre Immunität, verschiedene Populationen von Blutzellen oder die Unterscheidung von Phagozytose von der AMP-Produktion während einer erfolgreichen Immunantwort.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Wir beschreiben hier einen Phagozytose-Assay unter Verwendung der dispergierten embryonalen Zellen von Drosophila . Es ermöglicht uns, in vivo Phagozytose Ebenen einfach und präzise zu quantifizieren und neue Moleküle zu identifizieren, die für die Phagozytose von apoptotischen Zellen erforderlich sind.

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Beurteilung der altersspezifischen phagozytischen Fähigkeit von adulten Drosophila melanogaster Hämozyten mit einem In Vivo Phagozytose-Assay (Video) | JoVE Journal

Beurteilung der altersspezifischen phagozytischen Fähigkeit von adulten Drosophila melanogaster Hämozyten mit einem In Vivo Phagozytose-Assay

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