Beurteilung der altersspezifischen phagozytischen Fähigkeit von adulten Drosophila melanogaster Hämozyten mit einem In Vivo Phagozytose-Assay
June 11th, 2020
Dieses Protokoll beschreibt einen In-vivo-Test der Phagozytose zur Beurteilung und Quantifizierung der Fähigkeit junger und alter Drosophila melanogaster Hämozyten an Phagozytosebakterien..
Unser Protokoll bietet einen effektiven und wiederholbaren Ansatz zur Bewertung und Quantifizierung phagozytischer Ereignisse in Hämozyten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir phagozytische Ereignisse innerhalb einzelner Hämozyten quantifizieren können, was es uns ermöglicht, Variationen in phagozytischen Prozessen zwischen Genotypen in einzelnen Fliegen zu erkennen. Das Durchführen von Sezierungen kann eine Herausforderung sein, daher üben Sie bei der erstmaligen Durchführung dieser Technik so viel wie möglich, bevor Sie den vollständigen Vorgang durchführen.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Glasnadeln für die Injektion. Füllen Sie eine ein Millimeter Spritze mit Mineralöl und befestigen Sie die 30 Gauge hypodermische Nadel, die mit dem Nano-Injektor versehen ist. Setzen Sie die 30-Spur-Nadel in das stumpfe Ende einer gezogenen Kapillarnadel ein und füllen Sie sie mit Mineralöl.
Entfernen Sie langsam die 30-Spur-Nadel, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen gebildet werden. Entfernen Sie die Spannzange und legen Sie den versiegelten O-Ring mit dem Einzug nach oben. Legen Sie den größeren O-Ring auf den Metallkolben, und befestigen Sie die Spannzange dann wieder ohne Anziehen.
Setzen Sie den Metallkolben in das stumpfe Ende der ölgefüllten Glasnadel ein und drücken Sie ihn vorsichtig nach unten, indem Sie ihn in den größeren O-Ring einsetzen. Dann ziehen Sie die Spannzange fest. Nach dem Füllen der Nadel mit Fluor- oder pH-empfindlichen Partikeln, injizieren Sie die Fliegen in die sternopleturische Platte des Thorax.
Die Injektion ist erfolgreich, wenn der grüne Farbstoff in die Fliege geht. Legen Sie die injizierten Fliegen in eine neue Lebensmittel-Durchstechflasche, die die Zeit angibt, in der die erste und letzte Fliege injiziert wurden. Legen Sie die Durchstechflasche auf ihre Seite, bis sich alle Fliegen erholt haben, um zu verhindern, dass sie in der Nahrung stecken bleiben.
Richten Sie die fliegende ventrale Seite unter einem sezierenden Stereomikroskop nach oben aus. Dann legen Sie einen Insektenstift in den Thorax und eine andere durch das hintere Ende des Bauches in der Nähe der Genitalien. Sobald alle Fliegen angeheftet sind, verwenden Sie eine Transferpipette, um genügend Seziermedien hinzuzufügen, um die Fliegen abzudecken.
Entfernen Sie den Kopf mit der Nagelhautschere, und machen Sie einen horizontalen Schnitt direkt über der hinteren Stecknadel im Bauch, dann einen weiteren am vorderen Ende des Bauches. Machen Sie einen vertikalen Schnitt, der die beiden horizontalen Schnitte verbindet, die die Bauchhöhle öffnen. Verwenden Sie Zangen, um die inneren Organe und Gewebe zu entfernen, stellen Sie sicher, dass das dorsale Gefäß zu vermeiden.
Verwenden Sie bei Bedarf zusätzliche Stifte, um die geschnittenen Enden der Nagelhaut zu sichern. Dann den Thorax mit der Nagelschere entfernen. Entsorgen Sie die Seziermedien und ersetzen Sie sie durch einen Milliliter 4%PFA, um die Sezierungen so weit wie möglich vor Licht zu schützen.
Fixieren Sie die Abschnitte für 15 Minuten bei Raumtemperatur, während Sie bei 20 Umdrehungen pro Minute schaukeln. Entfernen Sie dann das Fixativ und fügen Sie einen Milliliter 1X PBST hinzu. Wenn gewünscht, färben Sie die Abschnitte mit Antikörpern.
Nach der Montage der Nagelhaut auf einem Mikroskopschlitten, verwenden Sie Zangen, um sie ventrale Seite nach oben zu orientieren, und stellen Sie sicher, dass das Dorsalgefäß sichtbar ist. Junge und gealterte Fliegen wurden auf altersspezifische Fähigkeit zur Phagozytose durch fluoreszierende Bildgebung von Hämozyten entlang des Dorsalgefäßes untersucht. Ein Antikörper gegen Perikardin wurde verwendet, um sicherzustellen, dass nur Zellen entlang des Dorsalgefäßes gezählt wurden.
Da fluoreszierend markierte E.coli-Partikel einen Mikrometer lang sind und Hämozyten einen Durchmesser von 10 Mikrometern haben, wurden nur fluoreszierende Ereignisse innerhalb eines Durchmessers von 10 Mikrometern gezählt, die auf einem DAPI-positiven Kern zentriert sind. ImageJ-Software wurde dann verwendet, um die Ereignisse zu quantifizieren. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich vorzustellen, dass die Fliege tatsächlich injiziert wurde, und sich daran zu erinnern, dass Timing entscheidend ist.
Das rechtzeitige Abschließen von Injektionen und Sezierungen wird dazu beitragen, experimentelle Fehler und mögliche Schwankungen der phagozytischen Rate zu minimieren. Diese Technik wird es Forschern ermöglichen, eine Vielzahl von Forschungsthemen zu erforschen, einschließlich Fragen über zelluläre Immunität, verschiedene Populationen von Blutzellen oder die Unterscheidung von Phagozytose von der AMP-Produktion während einer erfolgreichen Immunantwort.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt einen in vivo Assay der Phagozytose, um die Fähigkeit junger und alter Drosophila melanogaster Hämozyten zu untersuchen, Bakterien zu phagozytieren. Die Methode ermöglicht die Quantifizierung phagozytischer Ereignisse in einzelnen Hämozyten und zeigt Variationen zwischen Genotypen auf.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Immunologie
Hintergrund
- Phagozytose ist eine kritische Immunantwort in Organismen.
- Drosophila melanogaster dient als Modellorganismus für die Untersuchung von Immunprozessen.
- Das Verständnis altersbedingter Unterschiede in der Phagozytose kann Einblicke in die Immunität liefern.
- Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Bewertung der phagozytischen Aktivität in Hämozyten zu standardisieren.
Zweck der Studie
- Um die phagozytische Fähigkeit in Hämozyten unterschiedlichen Alters zu bewerten.
- Um phagozytische Ereignisse in einzelnen Zellen zu quantifizieren.
- Um Variationen in der Immunantwort zwischen Genotypen zu untersuchen.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Glasnadeln für die Injektion.
- Injektion von fluoreszenzmarkierten Partikeln in Drosophila.
- Dissektion von Fliegen, um Zugang zu Hämozyten zu erhalten.
- Fluoreszente Bildgebung und Quantifizierung unter Verwendung der ImageJ-Software.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Injektions- und Dissektionstechniken wurden etabliert.
- Altersspezifische Unterschiede in der Phagozytose wurden beobachtet.
- Die quantitative Analyse zeigte Variationen in der Immunantwort.
- Die Methode hat sich als zuverlässig für zukünftige Studien erwiesen.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll bietet eine wiederholbare Methode zur Bewertung der Phagozytose.
- Es ermöglicht Forschern die Untersuchung der zellulären Immunität bei Drosophila.
- Zukünftige Studien können auf diesen Erkenntnissen aufbauen, um Immunmechanismen zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Quantitative in vivo phagocytosis assays in adult Drosophila melanogaster hemocytes enable precise evaluation of innate immune function across age groups and genotypes. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for immunosenescence and cellular immunity pathways. The approach provides a standardized, scalable platform for comparative immune function studies relevant to early discovery and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of innate immune pathway function and genetic modifiers in a conserved model system.
- Supports biological de-risking by quantifying phagocytic capacity at the single-cell level across genotypes and ages.
- Facilitates predictive confidence in target selection for immune modulation strategies.
Screening & Assay Development
- Provides validated, quantitative readouts of hemocyte phagocytosis for downstream screening workflows.
- Standardizes assay conditions and measurement criteria for reproducibility across experiments and teams.
- Enables reliable evaluation of compound or genetic perturbation effects on cellular immune function.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms of immunosenescence and innate immune decline.
- Supports continuity from discovery-stage findings to preclinical model validation of immune interventions.
- Offers a platform for biomarker development and mechanistic studies of immune cell function.
Pipeline & Workflow Integration
This in vivo phagocytosis assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis testing, target validation, and translational research on immune function.
- Discovery Biology: Quantifies phagocytic events to clarify pathway activity and genetic contributions to immune decline.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for evaluating interventions or genetic variants.
- Analytics: Employs standardized imaging and software-based quantification for robust statistical comparisons.
- Translational Research: Bridges findings from model systems to mammalian immune aging and biomarker exploration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable assay platform for diverse immune function studies beyond aging.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune pathway studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of immune function assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early biological risk assessment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immune targets and interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, microinjection, and dissection techniques.
- Needs access to fluorescence imaging and quantitative analysis software (e.g., ImageJ).
- Demands cross-team standardization of injection, dissection, and imaging protocols.
- Adaptation to other model systems may require protocol optimization for cell size and marker selection.
- Timing and technical proficiency are critical to minimize experimental error and variability.
