Isolieren von Myofibrils von Skelettmuskelbiopsien und Bestimmung der Kontraktilenfunktion mit einem Nano-Newton Resolution Force Transducer

Hier wird ein Protokoll zur Bewertung der kontraktilen Eigenschaften von gestreiften Muskelmyofibrils mit Nano-Newton-Auflösung vorgestellt. Das Protokoll verwendet ein Setup mit einer Interferometrie-basierten optischen Kraftsonde. Dieses Setup erzeugt Daten mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis und ermöglicht die Beurteilung der kontraktilen Kinetik von Myofibrils.

Die Beurteilung der kontraktilen Eigenschaften von Myofibrils, die aus gestreiftem Muskel isoliert sind, kann verwendet werden, um festzustellen, ob Sarkome dysfunktion eine primäre Ursache für Muskelschwäche aufgrund von Mutationen in sarkomischen Proteinen ist. Diese Technik kann verwendet werden, um Daten mit einem sehr hohen Signal-Rausch-Verhältnis mit Nanonewton-Auflösung zu erfassen. Dieses Protokoll ist auch geeignet, kontraktilität in permeabilisierten Kardiomyozyten zu messen.

Denken Sie daran, dass der Kraftaufnehmer sehr zerbrechlich ist. Also, wenn Sie den Kleber von der Montagenadel entfernen oder beim Kleben eines Myofibrils, müssen Sie eine ruhige Hand, viel Übung und viel Geduld haben. Vor der Montage des Gewebes eine Homogenisatorstange in das Rohr legen, das das Muskelgewebe enthält.

Halten Sie die Röhre auf Eis, drehen Sie den Rotor für 15 Sekunden auf Geschwindigkeit fünf. Am Ende der Homogenisierung 50 Mikroliter der resultierenden Myofibrilsuspension und 250 Mikroliter Entspannungslösung auf einen poly-HEMA beschichteten Schlitten in einem Gewebebad übertragen. Bedecken Sie das Bad mit einem Deckel, um die Mischung vor Staub zu schützen und warten Sie 5 bis 10 Minuten, damit die Myofibrils auf den Boden des Tropfens sinken.

Während des Untergangs der Myofibrils, erhitzen Shellac einen Ethanolkleber bei 65 Grad Celsius für 30 bis 60 Sekunden, bevor Sie etwa sechs Mikroliter Kleber auf einen unbeschichteten Glasschlitten geben. Tauchen Sie die Spitze jeder Montagenadel wiederholt in den Kleber, bis eine Leimschicht sichtbar ist. Dann verwenden Sie Mikromanipulatoren, um die Sonde und Piezo vertikal zu bewegen, um Platz für das Gewebebad auf der Mikroskopbühne zu schaffen und den Glasschlitten mit dem Kleber zu entfernen.

Nach der Montage der Myofibrils, um die Sarkomelänge zu messen, bewegen Sie die Piezo- und/oder Kraftsonde, um die anfängliche Sarkome-Länge des Myofibrils auf 2,5 Mikrometer einzustellen. Messen Sie mit der Gefäßfunktion der Systemsteuerungssoftware die Myofibril-Länge und -Breite. Verwenden Sie die Mikroskopstufe, um das Myofibril in der Mitte des Videobildes zu positionieren und ein Rechteck von einer Seite des Myofibrils auf die andere zu strecken, wobei darauf geachtet wird, den dunklen Rand der Leimtröpfchen einzubeziehen.

Um mit der Aufzeichnung der Daten zu beginnen, klicken Sie auf Start. Klicken Sie nach fünf Sekunden auf Pause. Die Länge wurde aufgezeichnet.

Um die Breite zu messen, drehen Sie die Kamera um 90 Grad, um den Kontrast der Kante des Myofibrils selbst anzuzeigen. Passen Sie das Rechteck an, und klicken Sie auf Start, um mit der Aufzeichnung der Daten zu beginnen. Klicken Sie nach fünf Sekunden auf Pause.

Die Breite wurde aufgezeichnet. Um das Thetaglas zu positionieren, verwenden Sie das Okular und den Manipulator, um das Thetaglas vorsichtig in Richtung des Myofibrils zu bewegen. Richten Sie den oberen Kanal des Thetaglases mit dem Myofibril aus und führen Sie einen schnellen Schritt aus, um die Position zu überprüfen.

Schalten Sie den Hintergrund entspannenden Fluss ein, um die Thetaglasausrichtung zu überprüfen, und verwenden Sie einen Luer-Ventilhebel, um den Zufluss der Durchflusskammer einzuschalten. Um dann mit dem Entleeren der Durchflusskammer zu beginnen und ein Überlaufen der Durchflusskammer zu verhindern, stellen Sie das Abflusspumpenventil auf Badventil zwei, den Mikroschrittmodus auf Mikro, das Kolbenziel auf 48 000 und die Kolbendrehzahl auf 38 bis 40. Um die Geschwindigkeit der Spannungssanierung zu messen, berechnen Sie die Piezobewegung, die notwendig ist, um das Myofibril um 15% zu lockern, und geben Sie diesen Wert in den Signalgenerator ein.

Klicken Sie auf "Fortsetzen", um die Aufzeichnung der Daten fortzusetzen, und öffnen Sie die Ventile eins und sechs, um die Ströme der Entspannungslösung und die verschiedenen Kalziumkonzentrationen durch das Thetaglas zu starten. Wählen Sie den Reset-Bereich auf dem Interferometer aus, um den Bereich des Interferometers so zurückzusetzen, dass die Ausgangskraft Null Volt beträgt. Wenn die Kraftspur stabil ist, führen Sie das Thetaglas mit einer Schrittgröße von 100 Mikrometern schnell aus.

Wenn das Kraftplateau erreicht ist, führen Sie die Verkürzung re-Stretch mit dem Piezo. Eine Aktivierungsentspannungsspur wird aufgezeichnet. Klicken Sie auf Pause.

Um eine schrittweise Dehnung durchzuführen, klicken Sie auf Starten und Setzen Sie den Bereich des Interferometers zurück, sodass die Grundkraft Null Volt beträgt. Führen Sie eine schrittweise Dehnung mit dem Signalgenerator durch. Wenn die Strecke fertig ist, verwenden Sie den Piezo, um das Myofibril auf die Lockerlänge zu verkürzen.

Drücken Sie dann pause und stoppen und speichern Sie die Daten. Hier werden Kraftspuren eines aktiven Kraftexperiments mit einem Myofibril gezeigt, das aus einem gesunden menschlichen Quadrizepsmuskel isoliert ist. Das Myofibril wurde fünfmal mit Lösungen mit unterschiedlichen Calciumkonzentrationen aktiviert, mit einer durchschnittlichen maximalen Kraft aller Myofibrils von etwa 123 Millinewton pro Quadratmillimeter.

Die Konstruktion einer Kraftkalziumkonzentrationskurve aus den Plateaukräften, die bei jeder Aktivierung in jeder der fünf Calciumkurven erreicht werden, ermöglicht die Berechnung der Calciumkonzentration bei 50% der maximalen Kraftproduktion. Wie in dieser repräsentativen Analyse dargestellt, können die Myofibrillen in einem einzigen Experiment mit mehreren Verbindungen behandelt werden, um zusätzliche Fragen zum Myofibril-Typ zu beantworten. Die aktive Kraft und Sarcomere-Länge kann auch gemessen werden, um die Berechnung der Raten der Sanierung, Aktivierung und Entspannung zu ermöglichen.

Der steile Anstieg, der in der gepunkteten roten Box dargestellt wird, wird sowohl durch Viskosität als auch durch Elastizität verursacht. Das Plateau ähnelt nur der elastischen Komponente. Da die Viskosität der Dehnung linear widersteht, fiel die Kraft ab, nachdem die Dehnung entfernt wurde.

Achten Sie bei der Positionierung des Thetaglases darauf, dass Sie es richtig mit dem Myofibril ausrichten. Andernfalls kann die aktivierende Lösung zwischen der Glasfaser und dem Ausleger der Kraftsonde liegen, und dies bewirkt, dass Artefakte in Ihren Daten auftreten. Auch kann das Myofibril nicht richtig aktivieren.

Diese Methode der Perfusion ist auch geeignet, um den Muskelfasertyp des Myofibrils zu bestimmen. Zum Beispiel können Sie zuerst das Myofibril mit einer normalen Kalziumlösung gefolgt von perfusion der gleichen Lösung durchdringen, dann aber eine Muskelfaser-spezifische kraftsteigernde Verbindung hinzufügen.