Name: Charakterisierung von Amyloidstrukturen im Altern C. Elegans mit Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Lernen Sie Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebung zur Charakterisierung von Amyloidstrukturen im Altern von C. elegans. Diese nichtinvasive Methode ermöglicht die Unterscheidung aggregierter und löslicher Proteine in vivo.

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Der Muskel-Q40-mRFP-Stamm des CGC, der vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird. Das neuronale-Q40-CFP war ein freundliches Geschenk des Morimoto Lab. Wir würdigen die DFG (KI-1988/5-1 bis JK, NeuroCure PhD Fellowship des NeuroCure Cluster of Excellence to MLP), EMBO (Kurzzeitstipendium an MLP) und das Unternehmen der Biologen (Reisestipendien an CG und MLP) für die Förderung. Wir würdigen auch die Advanced Light Microscopy Imaging Facility am Max Delbrück Centre for Molecular Medicine, Berlin, für die Bereitstellung der Einrichtung, um die YFP-Konstrukte abzubilden.

1. Synchronisation von C. elegans
<ol><li>Synchronisieren Sie C. elegans entweder über alkalische Hypochloritlösung oder über einfache Eiablage für 4 h bei 20 °C8.</li>
	<li>Nematoden bei 20 °C anbauen und pflegen auf Nematoden-Wachstumsmediumplatten (NGM), die mit OP50 E. coli nach Standardverfahrengesätsind 9 . Altern Sie die Nematoden bis zum gewünschten Entwicklungsstadium oder Tag. HINWEIS: In diesem Protokoll werden junge Erwachsene am 4. Tag und alte Nematoden am 8. Tag des Lebens abgebildet.</li>
</ol>2. RNAi-vermittelter Knockdown von Chaperon-Maschinen über Fütterung
HINWEIS: Führen Sie den Knockdown des Hitzeschockproteins 1 (hsp-1) Chaperon durch Zuführen des entsprechenden RNAi-Vektors an die Nematoden10durch. Das hsp-1 RNAi Plasmid wurde aus der Ahringer Bibliothek (Klon-ID: F26D10.3) bezogen.
<ol><li>Wachsen Sie das HT115 (DE3) E. coli, das das hsp-1 RNAi-Plasmid für 6 h exzessiumdrückt, bis über Nacht in Luria Bertani (LB) Medium, das 50 g/ml Ampicillin enthält.</li>
	<li>Bereiten Sie frische NGM-Agarplatten vor, die Isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; 1 mM) und Ampicillin (25 g/ml) und Samen mit den hsp-1 RNAi-Bakterien enthalten. Lassen Sie die Teller trocknen und bei Raumtemperatur für 1-3 Tage induzieren.</li>
	<li>Setzen Sie synchronisierte Eier auf eine siRNA-Platte und lassen Sie es schlüpfen, oder legen Sie gravid Nematoden und lassen Sie Eier für 4 h bei 20 °C vor dem Entfernen legen. Wachsen Sie die Nematoden bis zum gewünschten Alter oder Stadium. HINWEIS: Die zweite Generation von Nematoden könnte einen stärkeren Phänotyp des Knockdowns darstellen. Das siRNA-Protokoll und die hier beschriebenen Bedingungen sind allgemein und an hsp1angepasst. RNA-Interferenzen über siRNA eines bestimmten Klons/Gens müssen vom Endbenutzer aufgebaut und optimiert werden. Es ist wichtig zu beachten, dass nicht alle siRNA die gleiche Effizienz haben, und es wird daher empfohlen, die Wirksamkeit des Knockdowns durch Quantifizierung entweder durch quantitative Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) oder Western Blot zu testen.</li>
</ol>3. Herstellung von Mikroskopie-Dias
<ol><li>Beginnen Sie am Tag der Bildgebung mit der Vorbereitung der Bilddias. Agarose in ddH2O mit einer Konzentration von 3% (w/v) schmelzen und leicht abkühlen lassen.</li>
	<li>Schneiden Sie die Spitze einer 1 ml Pipettenspitze und nehmen Sie etwa 200 l geschmolzene Agarose. Pipette die Agarose auf eine saubere Glasrutsche und sofort eine zweite auf die Oberseite legen, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Trocknen lassen und die obere Glasrutsche vorsichtig entfernen. Das Ergebnis ist ein Glasschlitten mit einer gleichmäßigen Agarose-Oberfläche, auf der die Nematoden positioniert werden. HINWEIS: Jede Folie wird verwendet, um zwischen 5-10 Nematoden abzubilden. Dias können vorbereitet und für einige Stunden in einer humifizierten Box gelagert werden, um das Austrocknen der Agrose zu verhindern.</li>
</ol>4. Montage von Nematoden auf Mikroskopie-Dias
HINWEIS: FLIM erfordert, dass die Nematoden immobilisiert werden. Führen Sie diesen Schritt aus, sobald die Bildgebung (z. B. Mikroskope, Laser, Detektoren) einsatzbereit ist.
<ol><li>Mit einem Platindrahtpicker nematodes des gewünschten Alters auf eine frische, ungesaittete Platte legen und kriechen lassen, um die überschüssigen OP50-Bakterien aus ihrem Körper zu entfernen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Anästhesie (Natriumazid oder Levamisol) vor, um das Nematode zu immobilisieren. 500 mM NaN3 bei 4 °C im Dunkeln halten und in frischem ddH2O auf eine Endkonzentration von 250 mM verdünnen. Bei Verwendung von Levamisol eine 20 mM Lagermenge auf 2 mM Arbeitslösung in ddH2O verdünnen. VORSICHT: Natriumazid (NaN3) ist hochgiftig. Verwenden Sie Handschuhe und Schutzbrillen und arbeiten Sie unter einer belüfteten Kapuze.</li>
	<li>Unter einem Stereomikroskop einen 10 L Tropfen Anästhetika auf ein Agarose-Pad legen und 5-10 Nematoden sanft hineintragen. Verwenden Sie eine Wimpernspitze, um die Nematoden zu trennen. Halten Sie sie dicht beieinander, aber nicht berührend, um eine einfachere Lokalisierung der Nematoden während der Bildaufnahme zu ermöglichen.</li>
	<li>Überlagern Sie die Nematoden vorsichtig mit einem Deckelschlupf. Nehmen Sie Messungen innerhalb von 1 h nach der Montage vor. HINWEIS: Beide Anästhetika werden schließlich C. eleganstöten. Die Nematoden müssen während der Bildgebung völlig unbeweglich sein, da die Karte der Lebensdauer von jedem Pixel aufgezeichnet wird. Jede Bewegung der xy-Parameter verhindert das Ablesen der Lebensdauer im gleichen angeregten Pixel.</li>
</ol>5. Erfassung von FLIM-Daten
HINWEIS: In diesem Protokoll wird die Lebensdauer des Fluorophors über die Time-Domain-TCSPC-Methode erfasst. FLIM erfordert, dass ein Lichtimpuls vom Laser mit einer eingestellten und konstanten Wiederholungsrate erzeugt wird. Die Wiederholungsrate variiert je nach Lasertyp und muss dem Benutzer bekannt sein. Lebensdauermessungen werden durch Detektoren und elektronische Geräte erreicht, die neben einem herkömmlichen Mikroskop installiert werden. In diesem Protokoll werden Messungen an drei verschiedenen laserscannenden Konfokalmikroskopen mit Detektoren und Software durchgeführt, die von zwei verschiedenen Unternehmen (Tabelle der Materialien) zur Erfassung von mRFP-, CFP- und YFP-Lebensdauern bereitgestellt werden. Überprüfen Sie, ob die richtigen Emissions-/Erregungsfilter vorhanden sind, und minimieren Sie vor dem Start Hintergrund- oder Monitor-Hintergrundbeleuchtung. Bevor Sie mit einem Experiment beginnen, stellen Sie die Photostabilität des gewählten Fluorophors fest. Wenn das Fluorophor innerhalb kurzer Zeit innerhalb des Nematodengewebes bleicht, ist es nicht für FLIM-Messungen in C. elegansgeeignet.
<ol><li>Öffnen Sie die FLIM-Erfassungssoftware. Die FLIM-Software ermöglicht auch die Steuerung des konfokalen Mikroskops. Suchen Sie die Registerkarte/Taste, damit die Ausgänge des Detektors aktiviert werden können, und drücken Sie Outputs aktivieren.</li>
	<li>Erwerben Sie die Instrument Response Function (IRF), die die Timing-Präzision des Instrumental-Setups beschreibt. HINWEIS: Dieser Schritt sollte vorzugsweise vor der Montage der Nematoden durchgeführt werden.<ol>
<li>Entfernen Sie, falls verfügbar, die Anregungs-/Emissionsfilter.</li>
		<li>Legen Sie einen leeren Deckelüberstrich über das Objektiv und finden Sie seine Oberfläche. Zeichnen Sie das Streusignal auf, das vom Deckschein für mindestens 30 s erhalten wurde. HINWEIS: Bei Lebensdauern von mehreren Nanosekunden kann die Erfassungssoftware die IRF-Verschiebung automatisch abschätzen. Der Erwerb eines IRF wird immer empfohlen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Platzieren Sie die Rutsche mit den montierten C. elegans auf der Bühne. Verwenden Sie eine 10-fache Vergrößerungslinse im Übertragungsmodus und lokalisieren Sie die Position der Nematoden auf dem Dia.</li>
	<li>Entfernen Sie den Schlitten, schalten Sie das Objektiv auf eine 63-fache Vergrößerungslinse um und wenden Sie das erforderliche Tauchmedium (z. B. Öl) an. Ersetzen Sie die Folie auf der Bühne, und lokalisieren Sie die Nematoden.</li>
	<li>Suchen Sie den Pinhole Manager in der Erfassungssoftware und öffnen Sie ihn zum Maximum. Beginnen Sie mit dem Scannen der Probe, wählen Sie einen Bereich aus, der von Interesse ist (z. B. Kopf, Oberkörper), und konzentrieren Sie sich auf die maximale Projektionsebene.</li>
	<li>Überwachen Sie die Laserpulsrate und die drei anderen Werte, die auf der Schnittstelle der Software vorhanden sind: Der Constant Fraction Discriminator (CFD), die Time-to-Amplitude (TAC) und der Analogue-to-Digital Converter (ADC). HINWEIS: Der Laser sollte ein maximales Tor von 1 x 108 einzelphotonenanzahl haben. Diese Zahl stellt die maximale Anzahl von Photonen dar, die vom Laser geliefert werden. Der CFD liefert Informationen über den Empfang des einzelnen Photonenpulses in Bezug auf den Laserpuls durch den Detektor. Dieser Wert sollte ungefähr 1 x 105betragen. Die TAC unterscheidet zwischen dem Zeitpunkt, zu dem ein Photon erkannt wurde, und dem nächsten Laserpuls. Schließlich wandelt der ADC die TAC-Spannung in ein speicherfähiges Speichersignal11um. CFD, TAC und ADC sollten alle ähnliche Werte aufweisen, um sicherzustellen, dass die vom Fluorophor emittierten Photonen nicht verloren gehen. Die korrekte Auswertung dieser Parameter stellt sicher, dass genügend Photonen gesammelt werden, um eine genaue Lebensdauerkarte zu erstellen.</li>
	<li>Zeigen Sie auf der Schnittstelle der FLIM-Software eine Vorschau der Anzahl der erkannten Photonen an: Der ADC-Wert sollte zwischen 1 x 104 und 1 x 105liegen. Verschieben Sie bei Bedarf den Fokus auf eine andere Ebene oder erhöhen Sie die Laserleistung, um mehr Photonen zu sammeln. HINWEIS: Im Allgemeinen sollte die Anzahl der aufgezeichneten Photonen pro Sekunde 1 % der Wiederholungsrate des Lasers nicht überschreiten.</li>
	<li>Wählen Sie in der Menüleiste die Registerkarte aus, um die Erfassungsparameter festzulegen. Wählen Sie Scan-Synchronisierung ein, um eine einzelne Photonenerkennung zu ermöglichen.</li>
	<li>Legen Sie die Erfassung auf eine feste Zeit oder eine feste Anzahl von Photonen fest. Erwerben Sie z. B. eine lebenslange Zerfallskurve für 2 min oder bis ein einzelnes Pixel eine Photonenanzahl von 2.000 Einzelereignissen erreicht. Drücken Sie Start, um mit der Erfassung zu beginnen. HINWEIS: Verschiedene Fluorophore erfordern unterschiedliche Anregungs- und Emissionslaser und Filter. Je nach Helligkeit der Probe kann auch die Laserleistung eingestellt werden, was die Lebensdauer nicht beeinträchtigt. Diese Protokolle verwenden die folgenden Anregungs-/Emissionseinstellungen: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. Für CFP-Messungen mit ex800/em440 nm wurde ein gepulster zweiphotonen Laser eingesetzt. Die Zeit und die Anzahl der Photonen, die für die Erfassung einer FLIM-Karte erforderlich sind, müssen für jedes Setup und jeden experimentellen Zweck empirisch festgelegt werden.</li>
</ol>6. Analyse von FLIM-Daten mit FLIMfit-Software
HINWEIS: Führen Sie datenanalysen mit dem fliMfit-Softwaretool durch, das am Imperial College London12 entwickelt wurde (siehe Abbildung 1).
<ol><li>Öffnen Sie die Software und importieren Sie FLIM-Datendateien über Datei | FLIM-Daten laden. Laden Sie alle Proben aus einer Bedingung, auch wenn sie in verschiedenen Sitzungen und aus verschiedenen biologischen Wiederholungen erhalten werden.</li>
	<li>Segmentieren Sie bei Bedarf eine einzelne Nematode aus jedem FLIM-Bild über Segmentierung | Segmentierungs-Manager. Ziehen Sie das Zuschneidewerkzeug um den Interessenbereich, bis es hervorgehoben wird. Sobald Sie fertig sind, drücken Sie OK. HINWEIS: Die Segmentierung muss für alle Bilder erfolgen.</li>
	<li>Wählen Sie einen kleinen Bereich aus, in dem das intensitätsbasierte Bild eines C. elegans angezeigt wird(Abbildung 1, Pfeile 1). Die Zerfallskurve dieses Bereichs wird im großen Zerfallsfenster auf der rechten Seite der Schnittstelle angezeigt(Abbildung 1, Pfeil 2). HINWEIS: Der Zerfall kann linear oder logarithmisch angezeigt werden.</li>
	<li>Legen Sie die richtigen Parameter fest, um die Lebensdauer über den Algorithmus der Software zu extrapolieren, wie in den Schritten 6.5-6.8 beschrieben.</li>
	<li>Auf der Registerkarte Daten (Abbildung 1, Pfeil 3):<ol>
<li>Legen Sie einen beliebigen integrierten Mindestwert fest, um alle Pixel auszuschließen, die zu dim sind, um eine gute Passform zu erzeugen. Je nach C. elegans Probe variiert dieser Wert zwischen 40-300. Geben Sie verschiedene Werte ein, bis eine zufriedenstellende Vorschau erreicht ist.</li>
		<li>Wählen Sie eine Zeit-Min- und eine Zeitmax-Zahl aus, um das FLIM-Signal auf diese Werte zu beschränken. Alle Ereignisse, die vor und nach diesem Schwellenwert angezeigt werden, werden ausgeschlossen. HINWEIS: Für die Analyse von mRFP wurden beispielsweise die Ereignisse vor 800 ps und nach 4.000 ps ausgeschlossen. Diese Werte hängen von der Lebensdauer des Fluorophors ab und müssen vom Endbenutzer bestimmt werden.</li>
		<li>Ändern Sie nicht die voreingestellten Counts/Photon von 1.</li>
		<li>Geben Sie die Wiederholungsratein MHz des Lasers ein, der während der Erfassung verwendet wird. HINWEIS: Für das aktuelle Protokoll wurden verschiedene Laser mit unterschiedlichen Wiederholungsraten eingesetzt. Die beiden Photonenlaser, die für die Erfassung von CFP-Lebensdauern verwendet werden, besitzen eine Wiederholungsrate von 80 MHz, für YFP wiederholt sich der Laser bei 40 MHz, und für mRFP beträgt der Wert 78,01 MHz. Diese Werte wurden gemäß der analysierten Stichprobe in FLIMfit eingegeben.</li>
		<li>Geben Sie einen Gate Max-Wert ein, um alle gesättigten Pixel auszuschließen. HINWEIS: Für Lebensdauermessungen in C. eleganswird dieser Wert auf eine beliebige große Zahl (z. B. 1 x 108) festgelegt.</li>
	</ol></li>
	<li>Wählen Sie auf der Registerkarte Lebensdauer ein globales Fitting aus, das verwendet werden soll (z. B. eine pixelweise Anpassung). Siehe Abbildung 1, Pfeil 4. HINWEIS: Ein Pixel-weises Fitting erzeugt einen Zerfall, der auf jedes einzelne Pixel abgestimmt ist. Eine bildweise Anpassung erzeugt eine globale Anpassung jedes einzelnen Bildes und zeigt einen einzelnen Lebensdauerwert pro Bild an. Ein globales Fitting erzeugt eine einzige Anpassung über den gesamten Datensatz. Für alle Bilder wird ein einziger Lebensdauerwert bereitgestellt.</li>
	<li>Ändern Sie keinen anderen Parameter außer der Nr. Exp-Auswahl, wenn bekannt ist, dass der gewählte Fluoreszenzzerfall multiexponentiell ist und mehr als eine Lebensdauer aufweist. HINWEIS: Im vorliegenden Protokoll wurde diese Funktion verwendet, um die Lebensdauer des biexponentiellen CFP-Fluorophors zu berechnen.</li>
	<li>Hochladen des IRF über das IRF-Menü: IRF | IRF laden. Um die IRF-Verschiebung zu schätzen, wählen Sie IRF | Schätzen Sie IRF Shift. Ein Satz von Werten wird automatisch auf der Registerkarte IRF angezeigt. Sobald dies eingerichtet ist, ändern Sie keine anderen Parameter dieser Registerkarte.</li>
	<li>Sobald alle Parameter festgelegt sind, drücken Sie Datensatz anpassen (Abbildung 1, Pfeil 5). Der Algorithmus erzeugt eine Anpassung für die Zerfallskurve und legt einen Lebensdauerwert für jedes Bild fest. HINWEIS: Die resultierende Anpassung, die in einer blauen Linie hervorgehoben ist, sollte sich mit allen Ereignissen überlappen. Eine gute Passform wird erhalten, wenn alle Ereignisse entlang der Passform ausgerichtet sind.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Registerkarte Parameter (Abbildung 1, Pfeil 6), die sich in den oberen rechten Menüs der Softwareoberfläche befindet, und wählen Sie Statistik: w_mean (gewichteter Mittelwert) und überprüfen Sie, ob der chi2-Wert so nah wie möglich an 1 liegt. HINWEIS: Ein Chi2 in der Nähe von einem gewährleistet die Genauigkeit der Passung. Der Lebensdauerwert des ausgewählten Bildes wird somit als tau_1offenbart.</li>
	<li>Exportieren von Informationen von Interesse: Datei | Export Intensitätsbilder/Ergebnistabelle/Bilder/Histogrammeexportieren. Speichern Sie die Dateneinstellungen, die zum Berechnen der Lebensdauer verwendet werden: Datei | Dateneinstellungen speichern. HINWEIS: Die verwendeten Parameter werden für die zukünftige Analyse der ausgewählten Stichproben gespeichert.</li>
</ol>7. Grafische Darstellungen von FLIM-Daten
HINWEIS: Die aus verschiedenen Proben gesammelten Lebensdauern können auf verschiedene Weise visuell dargestellt werden. Wählen Sie diese Option aus, um die Lebensdauerwerte entweder in Nanosekunden oder Inskopikosekunden anzuzeigen.
<ol><li>Zeigen Sie die Qualität der Passung und die Genauigkeit der Kurve an, indem Sie die Zerfallskurve direkt aus FLIMfit exportieren.</li>
	<li>Stellen Sie die Verteilung der Photonen dar, indem Sie die Häufigkeit der Photonenanzahl im Vergleich zum Lebensdauerwert in einem Histogramm darstellen.</li>
	<li>Zum statistischen Vergleich schließlich platzieren Sie beim Vergleich von zwei oder mehr Stichproben Lebensdauerwerte plus Standardabweichung des Mittelwerts in einem Streudiagrammstrichdiagramm. Führen Sie alle gewünschten statistischen Analysen durch.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine mikroskopiebasierte Technik zur Identifizierung aggregierter Arten im C. elegans-Modellsystem. FLIM kann das Vorhandensein sowohl aggregierter als auch löslicher Arten, die zu einem Fluorophor verschmolzen sind, durch Messung ihrer Fluoreszenz-Lebensdauer-Zerfalle genau charakterisieren. Wenn ein Fusionsprotein beginnt, seine aufgezeichnete durchschnittliche Lebensdauer zu aggregieren, verschiebt sich es von einem höheren auf einen niedrigeren Wert<sup class="xref"...

Proteinaggregation tritt sowohl im Alter als auch bei Krankheiten auf. Die Wege, die zur Bildung und Ablagerung von großen Amyloiden oder amorphen Einschlüssen führen, sind schwer zu folgen und ihre Kinetik ist ähnlich schwierig zu entwirren. Proteine können sich aufgrund intrinsischer Mutationen in ihren Codierungssequenzen falsch falten, wie im Falle genetischer Krankheiten. Proteine verrenken sich auch, weil das Proteostase-Netzwerk (PN), das sie löslich und richtig gefaltet hält, beeinträchtigt wird, wie es während des Alterns geschieht. Das PN umfasst molekulare Chaperones und Abbaumaschinen und ist verantwortlich für die Biogenese, Faltung, den Handel und den Abbau von Proteinen1.
C. elegans hat sich als Modell zur Untersuchung von Alterung und Krankheit aufgrund seiner kurzen Lebensdauer, isogenen Natur und Leichtigkeit der genetischen Manipulation herauskristallisiert. Mehrere transgene C. elegans-Stämme, die menschliche krankheitserregende Proteine in empfindlichen Geweben ausdrücken, wurden geschaffen. Wichtig ist, dass viele der Stämme, die aggregationsanfällige Proteine enthalten, das Kennzeichen von Amyloid-Störungen, der Bildung großer Einschlüsse, rekapitulieren. Dank des transparenten Körpers von C. elegans können diese Aggregate in vivo, nicht-invasiv und zerstörungsfrei visualisiert werden2. Die Erzeugung von Proteinen von Interesse (POI) in der Fusion mit einem Fluorophor ermöglicht es, seine Standorte, den Menschenhandel, das Interaktionsnetzwerk und das allgemeine Schicksal zu untersuchen.
Wir präsentieren ein Protokoll zur Überwachung der Aggregation von krankheitserregenden Proteinen im lebenden und alternden C. elegans mittels Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM). FLIM ist eine leistungsstarke Technik, die auf der Lebensdauer eines Fluorophors und nicht auf seinen Emissionsspektren basiert. Die Lebensdauer (tau, b) ist definiert als die durchschnittliche Zeit, die ein Photon benötigt, um von seinem angeregten Zustand zurück in seinen Bodenzustand zu zerfallen. Die Lebensdauer eines bestimmten Moleküls wird mit der Zeit-Domänen-Technik der zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung (TCSPC) berechnet. In TCSPC-FLIM wird die fluoreszierende Zerfallsfunktion durch Das Aufregen des Fluorophors mit kurzen, hochfrequenten Laserpulsen und die Messung der Ankunftszeiten des emittierten Photons an einen Detektor in Bezug auf die Impulse erreicht. Beim Scannen eines Samples wird für jedes Pixel ein dreidimensionales Datenarray erstellt: Das Array x,y enthält Informationen über die Verteilung der Photonen in ihren xy-Raumkoordinaten und ihre zeitliche Zerfallskurve. Eine bestimmte Probe wird daher zu einer Karte der Lebensdauer, die Informationen über die Struktur, Bindung und Umgebung des Proteins3,4enthält. Jedes fluoreszierende Protein besitzt eine intrinsische und genau definierte Lebensdauer, in der Regel von wenigen Nanosekunden (ns), abhängig von seinen physiochemischen Eigenschaften. Wichtig ist, dass die Lebensdauer eines Fluorophors unabhängig von seiner Konzentration, fluoreszierenden Intensität und der bildgebenden Methodik ist. Innerhalb eines biologischen Systems kann es jedoch durch Umweltfaktoren wie pH, Temperatur, Ionenkonzentrationen, Sauerstoffsättigung und seine Interaktionspartner beeinflusst werden. Lebenszeiten reagieren auch empfindlich auf interne strukturelle Veränderungen und Orientierung. Die Verschmelzung eines Fluorophors mit einem POI führt zu einer Änderung seiner Lebensdauer und folglich zu Informationen über das Verhalten des geschmolzenen Proteins. Wenn ein Fluorophor in einer eng gebundenen Umgebung umgeben oder gekapselt ist, wie z. B. die antiparallelen Beta-Platten einer Amyloidstruktur, verliert es Energie nicht-strahlungend, ein Prozess, der als Abschrecken5bekannt ist. Das Abschrecken des Fluorophors führt zu einer Verkürzung seiner scheinbaren Lebensdauer. Wenn es löslich ist, bleibt die Lebensdauer eines Proteins näher an seinem ursprünglichen, höheren Wert. Im Gegensatz dazu, wenn ein Protein beginnt zu aggregieren, wird seine Lebensdauer unweigerlich auf einen niedrigeren Wert6,7verschieben. Daher wird es möglich, die Aggregationsneigung jedes Amyloid-bildenden Proteins in verschiedenen Altersstufen in lebenden C. eleganszu überwachen.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Analyse der Aggregation eines Fusionsproteins, das verschiedene Polyglutamin (CAG, Q) Dehnungen (Q40, Q44 und Q85) umfasst. Wir veranschaulichen, wie die Technik gleichermaßen auf verschiedene Fluorophore angewendet werden kann, wie Z. B. Cyan-Fluoreszenzprotein (CFP), gelbes fluoreszierendes Protein (YFP) und monomeres rotes Fluoreszenzprotein (mRFP); und in allen Geweben von C. elegans, einschließlich der Neuronen, Muskeln, und der Darm. Darüber hinaus ist FLIM im Zusammenhang mit der Proteostase ein sehr nützliches Werkzeug, um Veränderungen bei der Erschöpfung molekularer Chaperonen zu beobachten. Das Abklopfen eines der wichtigsten molekularen Chaperone, das Hitzeschockprotein 1 (hsp-1), über RNA-Interferenz erzeugt eine vorzeitige Fehlfaltung von Proteinen. Die Erhöhung der Aggregationslast als Folge von Alterung, Krankheit oder mangelhaften Chaperonen wird dann als Abnahme der Fluoreszenzlebensdauer gemessen.

<table><tbody><tr><td>Agar-Agar Kobe I</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>5210.2</td><td>NGM-Komponente</td></tr><tr><td>Ahringer Library hsp-1 siRNA</td><td>Source BioScience UK Limited</td><td>F26D10.3</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>K029.3</td><td>Antibiotikum</td></tr><tr><td>B& H DCS-120 SPC-150</td><td>Becker & Hickl GmbH</td><td></td><td>FLIM Akquisitionssoftware</td></tr><tr><td>B& H SPC830-SPC Bild</td><td>Becker & Hickl GmbH</td><td></td><td>FLIM Akquisitionssoftware</td></tr><tr><td>BD Bacto Peptone</td><td>BD-Bionsciences</td><td>211677</td><td>NGM component</td></tr><tr><td>C. elegans iQ44-YFP</td><td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td><td>OG412</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans iQ85-YFP</td><td></td><td></td><td>Freundliches Geschenk von Morimoto Lab</td></tr><tr><td>C. elegans mQ40-RFP</td><td></td><td></td><td>Freundliches Geschenk von Morimoto Lab</td></tr><tr><td>C. elegans nQ40-CFP</td><td></td><td></td><td>Freundliches Geschenk von Morimoto Lab</td></tr><tr><td>Deckgl&auml; ser-18x18mm</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0657.2</td><td>Deckgläser</td></tr><tr><td>Isopropyl-&beta;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>2316.4</td><td></td></tr><tr><td>Leica M165 FC</td><td>Leica Camera AG</td><td></td><td>Montierung Stereomikroskop</td></tr><tr><td>Leica TCS SP5</td><td>Leica Camera AG</td><td></td><td>Konfokalmikroskop</td></tr><tr><td>Levamisolhydrochlorid</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4341</td><td>Anästhetikum</td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli</td><td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td><td>50</td><td></td></tr><tr><td>PicoQuant PicoHarp300</td><td>PicoQuant GmbH</td><td></td><td>FLIM Akquisitionssoftware</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>K305.1</td><td>Anästhetikum</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3957.2</td><td>NGM-Komponente</td></tr><tr><td>Standard-Objekttr&auml; ger</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0656.1</td><td>Objektträger</td></tr><tr><td>Universal Agarose</td><td>Bio & Sell GmbH</td><td>BS20.46.500</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioObserver.Z1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Konfokales Mikroskop</td></tr><tr><td>Zeiss LSM510-Meta NLO</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Konfokales Mikroskop</td></tr></tbody></table>

charakterisierung von amyloidstrukturen im altern c. elegans mit fluoreszenz-lebensdauer-bildgebung

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Amyloidfibrillen sind mit einer Reihe von neurodegenerativen Erkrankungen wie Huntington, Parkinson oder Alzheimer verbunden. Diese Amyloidfibrillen können endogene metastabile Proteine sowie Komponenten des Proteostase-Netzwerks (PN) sequestrieren und dadurch die Proteinfehlfaltung in der Zelle verschlimmern. Es gibt eine begrenzte Anzahl von Werkzeugen zur Verfügung, um den Aggregationsprozess von Amyloidproteinen innerhalb eines Tieres zu bewerten. Wir präsentieren ein Protokoll für die Fluoreszenz-Lebensdauermikroskopie (FLIM), das die Überwachung und Quantifizierung der Amyloidfibrille in bestimmten Zellen, wie Neuronen, auf nichtinvasive Weise und mit dem Fortschreiten des Alterns und bei PN. FLIM ist unabhängig von den Expressionsniveaus des Fluorophors und ermöglicht eine Analyse des Aggregationsprozesses ohne weitere Färbung oder Bleichen. Fluorophore werden abgeschreckt, wenn sie sich in unmittelbarer Nähe von Amyloidstrukturen befinden, was zu einer Abnahme der Fluoreszenzlebensdauer führt. Die Abschreckung korreliert direkt mit der Aggregation des Amyloidproteins. FLIM ist eine vielseitige Technik, die angewendet werden kann, um den Fibrillenprozess verschiedener Amyloidproteine, Umweltreize oder genetische Hintergründe in vivo auf nicht-invasive Weise zu vergleichen.

Das Protokoll zeigt, wie die Bildung von aggregierten Arten in lebenden C. elegansgenau überwacht werden kann, sowohl während seiner natürlichen Alterung als auch bei Stress. Wir wählten vier verschiedene Stämme von transgenen Nematoden aus, die Polyglutaminproteine von 40Q, 44Q oder 85Q Wiederholungen exdrücken. Diese Proteine werden in verschiedenen Geweben synthetisiert und zu verschiedenen Fluorophoren verschmolzen. Die C. elegans-Stämme exprimieren entweder Q40-mRFP...

Fluoreszenzlebensdauer Bildgebung überwacht, quantifiziert und unterscheidet die Aggregationstendenzen von Proteinen in lebenden, Alterung, und gestressten C. elegans Krankheitsmodelle.

Charakterisierung von Amyloidstrukturen im Altern C. Elegans mit Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebung

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

Die Methode ermöglicht es uns, integrierte Amyloid-Proteinstrukturen klar von den löslichen und sogar akkumulierten Gegenstücken zu unterscheiden. Die Technik wird in vivo in einer nichtinvasiven Weise mit wenig oder gar keinen toxischen Nebenwirkungen durchgeführt. Da es von den fluoreszierenden Eigenschaften des Fluorophors selbst abhängt, ist es sehr robust und im Laufe der Zeit reproduzierbar.FLIM wurde im Bereich der Krebsdiagnose eingesetzt. Wir verwenden es jedoch, um die grundlegenden Mechanismen der Proteinaggregation zu untersuchen, die in der Tat für neurodegenerative Erkrankungen relevant sind. Die Methodik kann im Bereich der Proteinaggregation eingesetzt werden.Solange das mit der Krankheit verbundene Protein mit einer fluoreszierenden Sonde markiert ist, kann es im Laufe der Zeit verfolgt und überwacht werden. Verbindungen und Strategien, die eine Aggregation fördern oder verhindern, können erfolgreich untersucht werden. Jedes biologische System, das eine Visualisierung durch Lichtmikroskopie ermöglicht, eignet sich für FLIM entweder in vivo oder ex vivo, z.B. in der Zellkultur, in fixierten oder permeabilisierten Proben und in jedem erforderlichen Medium.Achten Sie darauf, die Eigenschaften Ihres ausgewählten Fluorophors innerhalb der Nematode zu testen, bevor Sie experimentelle Daten erhalten, und testen Sie, ob das Setup voll funktionsfähig ist, bevor Sie Messungen erfassen. Beginnen, wachsen und halten Nematoden bei 20 Grad Celsius auf NGM-Platten. Altern Sie die Nematoden bis zum vierten Tag des Lebens als die jungen Erwachsenen und Tag acht des Lebens als die alten Erwachsenen.Beginnen Sie am Tag der Bildgebung mit der Vorbereitung der Bilddias. Agabarose und doppelt destilliertes Wasser mit einer Konzentration von 3% Volumen aufstellen. Übertragen Sie es in eine Mikrowelle, um zu schmelzen und lassen Sie es dann leicht abkühlen.Schneiden Sie die Spitze einer ein Milliliter Pipette Spitze und nehmen Sie etwa 200 Mikroliter der geschmolzenen Agarose. Pipette die Agarose auf eine saubere Glasrutsche und sofort eine zweite auf die Oberseite, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Lassen Sie die Dias trocknen und entfernen Sie vorsichtig die obere Glasrutsche.Das Ergebnis ist ein Glasschlitten mit einer gleichmäßigen Agarose-Oberfläche, auf der die Nematoden positioniert werden. Sobald das bildgebende Setup einsatzbereit ist und unter einem Stereomikroskop arbeitet, legen Sie einen 10-Mikroliter-Tropfen Anästhetika auf ein Agarose-Pad und übertragen Sie vorsichtig fünf bis zehn Nematoden hinein. Verwenden Sie eine Wimpernspitze, um die Nematoden zu trennen.Halten Sie sie dicht beieinander, aber nicht berührend, um eine einfachere Lokalisierung der Nematoden während der Bildaufnahme zu ermöglichen. Überlagern Sie die Nematoden vorsichtig mit einem Deckelschlupf. Nehmen Sie innerhalb einer Stunde nach der Montage Messungen vor.Stellen Sie sicher, dass die Nematoden völlig unbeweglich sind. Öffnen Sie die FLIM-Erfassungssoftware. Suchen Sie die Tab-Taste und drücken Sie die Aktivierungsausgänge.Platzieren Sie das Dia mit den montierten C.elegans auf der Bühne und verwenden Sie eine 10-fache Vergrößerungslinse im Übertragungsmodus, lokalisieren Sie die Position der Nematoden auf dem Dia. Entfernen Sie den Schlitten, schalten Sie das Objektiv auf eine 63X Vergrößerungslinse um, und wenden Sie das erforderliche Tauchmedium an. Platzieren Sie die Folie auf der Bühne und lokalisieren Sie die Nematoden.Starten Sie das Scannen des Beispiels. Wählen Sie eine Region aus, die von Interesse ist, und konzentrieren Sie sich auf die maximale Projektionsebene. Zeigen Sie auf der Schnittstelle der FLIM-Software eine Vorschau der Anzahl der erkannten Photonen an.Der ADC-Wert sollte zwischen einem Mal 10 bis dem vierten und ein mal 10 bis fünf liegen. Verschieben Sie bei Bedarf den Fokus auf eine andere Ebene oder erhöhen Sie die Laserleistung, um mehr Photonen zu sammeln. Stellen Sie sicher, dass Sie Photonenhaufen vermeiden, aber eine ausreichende Menge an Photonen sammeln, um eine gute Lebensdauer Passform und Messung zu schaffen.Wählen Sie in der Menüleiste die Registerkarte aus, um die Erfassungsparameter festzulegen. Wählen Sie Scan-Synchronisierung ein, um eine einzelne Photonenerkennung zu ermöglichen. Legen Sie die Erfassung auf eine feste Zeit oder eine feste Anzahl von Photonen fest.Drücken Sie den Start der Erfassung. Öffnen Sie die Software und importieren Sie FLIM-Datendateien per Datei, laden Sie FLIM-Daten. Laden Sie alle Proben aus einer Bedingung, auch wenn sie in verschiedenen Sitzungen und aus verschiedenen biologischen Wiederholungen erhalten werden.Ggf. Segment, um Nematoden für viele FLIM-Bilder über Segmentierung zu signalisieren, Segmentierungsmanager. Ziehen Sie das Zuschneidewerkzeug um den Interessenbereich, bis es hervorgehoben wird. Sobald Sie fertig sind, drücken Sie OK. Wählen Sie einen kleinen Bereich aus, in dem das intensitätsbasierte Bild eines C.elegans angezeigt wird.Die Zerfallskurve dieses Bereichs wird im großen Zerfallsfenster auf der rechten Seite der Schnittstelle angezeigt. Um die Lebensdauer zu extrapolieren, legen Sie auf der Registerkarte Daten einen beliebigen integrierten Mindestwert zwischen 40 und 300 fest, um Pixel auszuschließen, die zu wenig sind, um eine gute Passform zu erzeugen. Wählen Sie ein Zeitminimum und eine maximale Zeitzahl aus, um das FLIM-Signal auf diese Werte zu beschränken.Ändern Sie nicht die voreingestellten Zahlen Photon von einem. Geben Sie die Wiederholungsrate in Megahertz des Lasers ein, der während der Erfassung verwendet wird. Geben Sie einen Gate-Max-Wert ein, um alle gesättigten Pixel auszuschließen.Wählen Sie auf der Registerkarte Lebensdauer ein globales Fitting aus, das verwendet werden soll. Ändern Sie keinen anderen Parameter außer der Anzahl der exponentiellen Selektion, wenn bekannt ist, dass der gewählte Fluoreszenzzerfall multiexponentiell ist und mehr als eine Lebensdauer aufweist. Laden Sie den IRF über das IRF-Menü hoch.Um die IRF-Verschiebung zu schätzen, wählen Sie IRF, iRF-Verschiebung. Ein Satz von Werten wird automatisch auf der Registerkarte IRF angezeigt. Sobald dies eingerichtet ist, ändern Sie keine anderen Parameter dieser Registerkarte.Sobald alle Parameter festgelegt sind, drücken Sie den Anpassungsdatensatz. Die resultierende Anpassung, die in einer blauen Linie hervorgehoben wird, sollte sich mit allen Ereignissen überlappen. Eine gute Passform wird erhalten, wenn alle Ereignisse entlang der Passform ausgerichtet sind.Klicken Sie auf die Registerkarte Parameter in den oberen rechten Menüs der Software-Schnittstelle, und wählen Sie die Statistik, den gewichteten Mittelwert, und überprüfen Sie, ob der Chi-Quadratwert so nah wie möglich an einem ist. Der Lebensdauerwert des ausgewählten Bildes wird somit als Tau 1 offenbart. Exportieren Sie alle Informationen von Interesse durch Datei, ExportIntensität Bilder, passen Ergebnistabelle, Bilder, Histogramme.Repräsentative Karten von C.elegans, die muskulöse Q40 RFP am vierten oder achten Tag des Lebens ausdrücken, werden hier gezeigt. Die längere Q-Strecke des IQ85 war anfälliger für Aggregation und zeigte bereits am vierten Tag des Lebens eine Fluoreszenz-Lebensdauerverschiebung im Histogramm. Tatsächlich wurde am vierten Tag die Foci-Bildung für IQ85 beobachtet, während es in IQ44 noch fehlte.Nach dem Altern zeigte IQ44 aber auch eine Foci-Bildung und damit eine reduzierte Fluoreszenzlebensdauer. Schließlich wurde die Foci-Bildung weder nachgewiesen noch die Fluoreszenzlebensdauer im NQ40CFP-Stamm verringert. Für diese Sorte gab es nur subtile nicht signifikante Veränderungen der mittleren Fluoreszenzlebensdauer nach alterung.Sobald das Nematodenmodell etabliert ist, ist die Menge des gesammelten Photons von größter Bedeutung, um eine gute Lebenslange Passform zu erhalten. Das Verfahren kann weiter mit verschiedenen Techniken wie Forster-Resonanzenergieübertragung, FRET, Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleichmittel, FRAP oder Messung verbunden werden. Alle diese Anpassungen liefern zusätzliche Informationen über die Eigenschaften der Proteinstudien und ihre aggregierte Form.Im Bereich der Proteinaggregation und Proteinhomöostase erlaubte die Technik die Untersuchung jeglicher Störungen, die dem System auferlegt wurden, die Verteilung verschiedener Proteinarten und den Handel und im Allgemeinen die Unterschiede und Bedeutung von löslichen und unlöslichen Proteinfraktionen innerhalb des lebenden Organismus. Das Anästhetikum Natriumazid ist giftig und sollte mit Handschuhen und Schutzbrille niert und unter einer Dunstabzugshaube verdünnt werden. Da die Technik auf Mikroskopie basiert, ist es wichtig, alle Warnungen im Zusammenhang mit der Arbeit mit Lasern zu befolgen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Video zeigt einen auf Bildgebung basierenden In-vivo-Assay zur Bestimmung des altersbedingten Rückgangs der Proteostase. Der Assay verwendet Caenorhabditis elegans, das Polyglutamin-YFP-Fusionsprotein in der Körperwandmuskulatur exprimiert, um die altersassoziierte Aggregation von Polyglutamin und die Induktion von Proteotoxizität zu messen, die zu Lähmungen führt.

Fluoreszierender Reporter-basierter Lähmungsassay: Eine Technik zur Beurteilung der altersassoziierten progressiven Bildung von Polyglutamin-Fluoreszenz-Reportern und der damit verbundenen Lähmung bei Caenorhabditis elegans

Quelle: Nyström, S., et al., Bildgebung von Amyloidgeweben, die mit lumineszierenden konjugierten Oligothiophenen gefärbt sind, durch hyperspektrale konfokale Mikroskopie und Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebung. J. Vis. Exp. (2017). Dieses Video zeigt die Analyse von Amyloidstrukturen mit Hilfe der Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie oder FLIM, wobei der hFTAA-Farbstoff verwendet wird, um kompakte Kerne als blau/grün und instabile Peripherien als rot/gelb in farbcodierten Bildern zu...

Analyse von Amyloid-Strukturen in einem Gewebeschnitt mit Hilfe der Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie

Quelle: Pigazzini, M. L., et. al. Charakterisierung von Amyloidstrukturen im Alter C. Elegans mittels Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebung. J. Vis. Exp. (2020). Dieses Video zeigt die Verwendung der Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) zur Beurteilung der PolyQ-Proteinaggregation in C. elegans Neuronen und vergleicht Kontroll- und Chaperonprotein-defiziente Würmer. Eine erhöhte Aggregation bei Chaperon-defizienten Würmern fördert den Energietransfer zwischen geclusterten...

Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebung der PolyQ-Proteinaggregation in Caenorhabditis elegans-Neuronen

Wir beschreiben Methoden, um Aspekte der amylopathies in der Schnecke zu...

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Modell-System für Amylopathy Study

Amyloid-Ablagerungen ist ein Markenzeichen von verschiedenen Krankheiten und viele andere Organe befällt. Dieses Papier beschreibt die Anwendung der leuchtenden konjugierte Oligothiophene Fluoreszenz Färbung in Kombination mit Fluoreszenz-Mikroskopie-Techniken. Diese Färbung Methode darstellt, ein leistungsstarkes Tool für die Erkennung und Erforschung von Proteinaggregaten in klinischen und wissenschaftlichen Einrichtungen.

Imaging-Amyloid Gewebe gebeizt mit lumineszierenden konjugierte Oligothiophenes von hyperspektralen konfokalen Mikroskopie und Fluoreszenz Lifetime Imaging

Eine schrittweise Anleitung zum Verlust der lysosomalen Säure im Darm von C. Elegans mit der pH-Sensitive vital Farbstoff 6 - Carboxy - 2', 7'-dichlorofluoresceins Diacetat (cDCFDA)...

Beurteilung der lysosomalen Alkalisierung in den Darm von Leben Caenorhabditis elegans

Der proteostatische Rückgang ist ein Kennzeichen des Alterns und erleichtert das Auftreten neurodegenerativer Erkrankungen. Wir skizzieren ein Protokoll zur quantifizierbaren Messung der Proteostase in zwei verschiedenen Caenorhabditis elegans-Geweben durch heterologe Expression von Polyglutamin-Wiederholungen, die mit einem fluoreszierenden Reporter verschmolzen sind. Dieses Modell ermöglicht eine schnelle genetische In-vivo-Analyse der Proteostase.

Quantifizierung des gewebespezifischen proteostatischen Rückgangs bei Caenorhabditis elegans

Hier führen wir weithin zugängliche Methoden mit einigen vielseitigen Nematodenmodellen ein, einschließlich hyperaktivierter Ionenkanal-induzierter Nekrose und Protein-Aggregat-induzierter Neurotoxizität, um die zellulären und molekularen Grundlagen altersassoziierter neurodegenerativer Erkrankungen zu überwachen und zu sezieren.

Modellierung altersassoziierter neurodegenerativer Erkrankungen bei Caenorhabditis elegans

Der Unterricht in den Biowissenschaften kann für die Studierenden durch Experimente anregender gestaltet werden. Dieses Manuskript stellt zwei verschiedene, aber sich ergänzende Protokolle vor, die im Unterricht verwendet werden können, um die Schüler zu ermutigen, Hypothesen in Bezug auf kalorienreiche Ernährung, Hunger und Altern zu formulieren und zu testen.

Verwendung kostengünstiger Farbstoffe zur Visualisierung der Glykogenakkumulation und der Darmintegrität bei Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll bietet einen standardisierten Ansatz für die Abbildung der mitochondrialen Morphologie in mehreren Geweben von C. elegans während des Alterns.

Bildgebung und Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie bei C. elegans während des Alterns

Lernen Sie Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebung zur Charakterisierung von Amyloidstrukturen im Altern von C. elegans. Diese nichtinvasive Methode ermöglicht die Unterscheidung aggregierter und löslicher Proteine in vivo.

Charakterisierung von Amyloidstrukturen im Altern C. Elegans mit Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebung

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