Charakterisierung von Amyloidstrukturen im Altern C. Elegans mit Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebung
27. März 2020
Fluoreszenzlebensdauer Bildgebung überwacht, quantifiziert und unterscheidet die Aggregationstendenzen von Proteinen in lebenden, Alterung, und gestressten C. elegans Krankheitsmodelle.
Die Methode ermöglicht es uns, integrierte Amyloid-Proteinstrukturen klar von den löslichen und sogar akkumulierten Gegenstücken zu unterscheiden. Die Technik wird in vivo in einer nichtinvasiven Weise mit wenig oder gar keinen toxischen Nebenwirkungen durchgeführt. Da es von den fluoreszierenden Eigenschaften des Fluorophors selbst abhängt, ist es sehr robust und im Laufe der Zeit reproduzierbar.
FLIM wurde im Bereich der Krebsdiagnose eingesetzt. Wir verwenden es jedoch, um die grundlegenden Mechanismen der Proteinaggregation zu untersuchen, die in der Tat für neurodegenerative Erkrankungen relevant sind. Die Methodik kann im Bereich der Proteinaggregation eingesetzt werden.
Solange das mit der Krankheit verbundene Protein mit einer fluoreszierenden Sonde markiert ist, kann es im Laufe der Zeit verfolgt und überwacht werden. Verbindungen und Strategien, die eine Aggregation fördern oder verhindern, können erfolgreich untersucht werden. Jedes biologische System, das eine Visualisierung durch Lichtmikroskopie ermöglicht, eignet sich für FLIM entweder in vivo oder ex vivo, z.B. in der Zellkultur, in fixierten oder permeabilisierten Proben und in jedem erforderlichen Medium.
Achten Sie darauf, die Eigenschaften Ihres ausgewählten Fluorophors innerhalb der Nematode zu testen, bevor Sie experimentelle Daten erhalten, und testen Sie, ob das Setup voll funktionsfähig ist, bevor Sie Messungen erfassen. Beginnen, wachsen und halten Nematoden bei 20 Grad Celsius auf NGM-Platten. Altern Sie die Nematoden bis zum vierten Tag des Lebens als die jungen Erwachsenen und Tag acht des Lebens als die alten Erwachsenen.
Beginnen Sie am Tag der Bildgebung mit der Vorbereitung der Bilddias. Agabarose und doppelt destilliertes Wasser mit einer Konzentration von 3% Volumen aufstellen. Übertragen Sie es in eine Mikrowelle, um zu schmelzen und lassen Sie es dann leicht abkühlen.
Schneiden Sie die Spitze einer ein Milliliter Pipette Spitze und nehmen Sie etwa 200 Mikroliter der geschmolzenen Agarose. Pipette die Agarose auf eine saubere Glasrutsche und sofort eine zweite auf die Oberseite, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Lassen Sie die Dias trocknen und entfernen Sie vorsichtig die obere Glasrutsche.
Das Ergebnis ist ein Glasschlitten mit einer gleichmäßigen Agarose-Oberfläche, auf der die Nematoden positioniert werden. Sobald das bildgebende Setup einsatzbereit ist und unter einem Stereomikroskop arbeitet, legen Sie einen 10-Mikroliter-Tropfen Anästhetika auf ein Agarose-Pad und übertragen Sie vorsichtig fünf bis zehn Nematoden hinein. Verwenden Sie eine Wimpernspitze, um die Nematoden zu trennen.
Halten Sie sie dicht beieinander, aber nicht berührend, um eine einfachere Lokalisierung der Nematoden während der Bildaufnahme zu ermöglichen. Überlagern Sie die Nematoden vorsichtig mit einem Deckelschlupf. Nehmen Sie innerhalb einer Stunde nach der Montage Messungen vor.
Stellen Sie sicher, dass die Nematoden völlig unbeweglich sind. Öffnen Sie die FLIM-Erfassungssoftware. Suchen Sie die Tab-Taste und drücken Sie die Aktivierungsausgänge.
Platzieren Sie das Dia mit den montierten C.elegans auf der Bühne und verwenden Sie eine 10-fache Vergrößerungslinse im Übertragungsmodus, lokalisieren Sie die Position der Nematoden auf dem Dia. Entfernen Sie den Schlitten, schalten Sie das Objektiv auf eine 63X Vergrößerungslinse um, und wenden Sie das erforderliche Tauchmedium an. Platzieren Sie die Folie auf der Bühne und lokalisieren Sie die Nematoden.
Starten Sie das Scannen des Beispiels. Wählen Sie eine Region aus, die von Interesse ist, und konzentrieren Sie sich auf die maximale Projektionsebene. Zeigen Sie auf der Schnittstelle der FLIM-Software eine Vorschau der Anzahl der erkannten Photonen an.
Der ADC-Wert sollte zwischen einem Mal 10 bis dem vierten und ein mal 10 bis fünf liegen. Verschieben Sie bei Bedarf den Fokus auf eine andere Ebene oder erhöhen Sie die Laserleistung, um mehr Photonen zu sammeln. Stellen Sie sicher, dass Sie Photonenhaufen vermeiden, aber eine ausreichende Menge an Photonen sammeln, um eine gute Lebensdauer Passform und Messung zu schaffen.
Wählen Sie in der Menüleiste die Registerkarte aus, um die Erfassungsparameter festzulegen. Wählen Sie Scan-Synchronisierung ein, um eine einzelne Photonenerkennung zu ermöglichen. Legen Sie die Erfassung auf eine feste Zeit oder eine feste Anzahl von Photonen fest.
Drücken Sie den Start der Erfassung. Öffnen Sie die Software und importieren Sie FLIM-Datendateien per Datei, laden Sie FLIM-Daten. Laden Sie alle Proben aus einer Bedingung, auch wenn sie in verschiedenen Sitzungen und aus verschiedenen biologischen Wiederholungen erhalten werden.
Ggf. Segment, um Nematoden für viele FLIM-Bilder über Segmentierung zu signalisieren, Segmentierungsmanager. Ziehen Sie das Zuschneidewerkzeug um den Interessenbereich, bis es hervorgehoben wird. Sobald Sie fertig sind, drücken Sie OK. Wählen Sie einen kleinen Bereich aus, in dem das intensitätsbasierte Bild eines C.elegans angezeigt wird.
Die Zerfallskurve dieses Bereichs wird im großen Zerfallsfenster auf der rechten Seite der Schnittstelle angezeigt. Um die Lebensdauer zu extrapolieren, legen Sie auf der Registerkarte Daten einen beliebigen integrierten Mindestwert zwischen 40 und 300 fest, um Pixel auszuschließen, die zu wenig sind, um eine gute Passform zu erzeugen. Wählen Sie ein Zeitminimum und eine maximale Zeitzahl aus, um das FLIM-Signal auf diese Werte zu beschränken.
Ändern Sie nicht die voreingestellten Zahlen Photon von einem. Geben Sie die Wiederholungsrate in Megahertz des Lasers ein, der während der Erfassung verwendet wird. Geben Sie einen Gate-Max-Wert ein, um alle gesättigten Pixel auszuschließen.
Wählen Sie auf der Registerkarte Lebensdauer ein globales Fitting aus, das verwendet werden soll. Ändern Sie keinen anderen Parameter außer der Anzahl der exponentiellen Selektion, wenn bekannt ist, dass der gewählte Fluoreszenzzerfall multiexponentiell ist und mehr als eine Lebensdauer aufweist. Laden Sie den IRF über das IRF-Menü hoch.
Um die IRF-Verschiebung zu schätzen, wählen Sie IRF, iRF-Verschiebung. Ein Satz von Werten wird automatisch auf der Registerkarte IRF angezeigt. Sobald dies eingerichtet ist, ändern Sie keine anderen Parameter dieser Registerkarte.
Sobald alle Parameter festgelegt sind, drücken Sie den Anpassungsdatensatz. Die resultierende Anpassung, die in einer blauen Linie hervorgehoben wird, sollte sich mit allen Ereignissen überlappen. Eine gute Passform wird erhalten, wenn alle Ereignisse entlang der Passform ausgerichtet sind.
Klicken Sie auf die Registerkarte Parameter in den oberen rechten Menüs der Software-Schnittstelle, und wählen Sie die Statistik, den gewichteten Mittelwert, und überprüfen Sie, ob der Chi-Quadratwert so nah wie möglich an einem ist. Der Lebensdauerwert des ausgewählten Bildes wird somit als Tau 1 offenbart. Exportieren Sie alle Informationen von Interesse durch Datei, ExportIntensität Bilder, passen Ergebnistabelle, Bilder, Histogramme.
Repräsentative Karten von C.elegans, die muskulöse Q40 RFP am vierten oder achten Tag des Lebens ausdrücken, werden hier gezeigt. Die längere Q-Strecke des IQ85 war anfälliger für Aggregation und zeigte bereits am vierten Tag des Lebens eine Fluoreszenz-Lebensdauerverschiebung im Histogramm. Tatsächlich wurde am vierten Tag die Foci-Bildung für IQ85 beobachtet, während es in IQ44 noch fehlte.
Nach dem Altern zeigte IQ44 aber auch eine Foci-Bildung und damit eine reduzierte Fluoreszenzlebensdauer. Schließlich wurde die Foci-Bildung weder nachgewiesen noch die Fluoreszenzlebensdauer im NQ40CFP-Stamm verringert. Für diese Sorte gab es nur subtile nicht signifikante Veränderungen der mittleren Fluoreszenzlebensdauer nach alterung.
Sobald das Nematodenmodell etabliert ist, ist die Menge des gesammelten Photons von größter Bedeutung, um eine gute Lebenslange Passform zu erhalten. Das Verfahren kann weiter mit verschiedenen Techniken wie Forster-Resonanzenergieübertragung, FRET, Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleichmittel, FRAP oder Messung verbunden werden. Alle diese Anpassungen liefern zusätzliche Informationen über die Eigenschaften der Proteinstudien und ihre aggregierte Form.
Im Bereich der Proteinaggregation und Proteinhomöostase erlaubte die Technik die Untersuchung jeglicher Störungen, die dem System auferlegt wurden, die Verteilung verschiedener Proteinarten und den Handel und im Allgemeinen die Unterschiede und Bedeutung von löslichen und unlöslichen Proteinfraktionen innerhalb des lebenden Organismus. Das Anästhetikum Natriumazid ist giftig und sollte mit Handschuhen und Schutzbrille niert und unter einer Dunstabzugshaube verdünnt werden. Da die Technik auf Mikroskopie basiert, ist es wichtig, alle Warnungen im Zusammenhang mit der Arbeit mit Lasern zu befolgen.
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Übersicht
Diese Studie verwendet Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebung (FLIM), um Proteinaggregation in lebenden C. elegans-Modellen zu überwachen und zu quantifizieren. Die Technik ermöglicht eine nichtinvasive Beobachtung von Proteinstrukturen, die für neurodegenerative Erkrankungen relevant sind.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Biophysik
- Zellbiologie
Hintergrund
- Proteinaggregation ist ein Schlüsselmerkmal bei neurodegenerativen Erkrankungen.
- FLIM bietet eine Methode, um zwischen verschiedenen Proteinzuständen zu unterscheiden.
- Die Technik wird in vivo mit minimaler Toxizität durchgeführt.
- FLIM hat Anwendungen über die Neurowissenschaften hinaus, einschließlich der Krebsdiagnose.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Mechanismen der Proteinaggregation.
- Unterscheidung zwischen integrierten Amyloidstrukturen und löslichen Proteinen.
- Anwendung von FLIM im Kontext von Altern und Stress in C. elegans-Modellen.
Verwendete Methoden
- Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebung (FLIM)
- In-vivo-Bildgebung von C. elegans
- Nichtinvasive Beobachtungstechniken
- Analyse der Proteinaggregationsdynamik
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Unterscheidung von Amyloid-Proteinstrukturen von löslichen Gegenstücken.
- Nachgewiesene Robustheit und Reproduzierbarkeit von FLIM über Zeit.
- Hervorhebung der Relevanz von Proteinaggregation für neurodegenerative Erkrankungen.
- Minimale toxische Nebenwirkungen der Bildgebungstechnik gezeigt.
Schlussfolgerungen
- FLIM ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung von Proteinaggregation in lebenden Organismen.
- Die Methode kann das Verständnis der Mechanismen neurodegenerativer Erkrankungen verbessern.
- Zukünftige Anwendungen können sich auf andere Bereiche erstrecken, einschließlich der Krebsforschung.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Fluorescence lifetime imaging (FLIM) enables noninvasive, quantitative monitoring of amyloid fibrilization in living models, supporting target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease programs. By distinguishing integrated amyloid structures from soluble species without staining, FLIM provides predictive confidence in early discovery workflows. The method’s robustness and reproducibility facilitate cross-functional collaboration and scalable assay development for protein homeostasis research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by distinguishing amyloid fibrils from soluble and accumulated protein species in vivo.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative, fluorescence-lifetime-based readouts that correlate directly with aggregation levels.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by allowing comparison of fibrilization across genetic backgrounds, environmental stimuli, or amyloid variants.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by enabling label-free, longitudinal tracking of protein aggregation in specific cells such as neurons.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through FLIM’s independence from fluorophore expression levels and resistance to photobleaching.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation by detecting aggregation-promoting or -preventing strategies in any light-microscopy-compatible biological system.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery through preclinical validation by monitoring aggregation dynamics across aging and proteostasis network perturbations in disease-relevant models.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports advancement decisions by quantifying soluble versus insoluble protein fractions in living organisms over time.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value when studying protein homeostasis, enabling comparison of trafficking and distribution of protein species without further staining.
Pipeline & Workflow Integration
FLIM integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical studies by providing quantitative, noninvasive readouts of protein aggregation in living systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling visualization of amyloid structures in specific cells such as neurons during aging.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through photon collection and lifetime fitting that exclude dim pixels and saturated signals for robust measurements.
- Analytics: Provides statistical outputs such as chi-square values near one and weighted mean lifetime (tau one) to compare conditions and assess fit quality.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling observation of aggregation in aging models and upon proteostasis network perturbation, relevant to neurodegenerative disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for comparing fibrilization across different amyloid proteins, genetic backgrounds, or environmental stimuli in vivo.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in protein aggregation studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of amyloid detection in vivo without staining or bleaching.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early detection of aggregation propensity.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative, longitudinal aggregation data in disease-relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence lifetime imaging and laser safety protocols.
- Needs FLIM-capable microscopy setup with appropriate objectives (e.g., 63X immersion) and photon detection capabilities.
- Demands cross-team standardization of acquisition parameters such as scan sync, repetition rate, gate max, and photon collection thresholds (10⁴–10⁵ ADC).
- Involves adaptation considerations across model systems, including agarose pad preparation, anesthetic use (e.g., sodium azide), and immobilization protocols.
- Includes practical limitations such as the need to pre-test fluorophore properties in the nematode model and avoid photon pileup during acquisition.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:25
Synchronization of C. elegans and Mounting Nematodes onto Microscopy Slides
2:58
Acquisition of FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) Data
4:32
Analysis of FLIM Data Using FLIMfit Software
7:15
Results: Fluorescence Lifetimes
8:15
Conclusion
