Screening auf Phytoöstrogene mit einem Zell-basierten Östrogen-Rezeptor β Reporter Assay

Wir verwenden diesen Assay, um zu beurteilen, ob pflanzliche Lebensmittel Phytosterioden enthalten, die physiologische Prozesse bei Tieren sowie das Verhalten und den Fortpflanzungserfolg beeinflussen können. Dieser Assay bietet eine einfache und zuverlässige Methode, um festzustellen, ob Pflanzen östrogene Verbindungen mit biologischer Aktivität produzieren. Diese Methode wurde ursprünglich entwickelt, um Medikamente mit Xenoöstrogenaktivität für Anwendungen in der Medizin zu screenen.

Zum Beispiel die Hemmung der Zellproliferation. Wir nutzen sie, um Einblicke in die Ökologie und Evolution von Primaten zu geben. Es ist wichtig, dass Sie vor dem Versuch dieses Assays Übung in der Arbeit mit aseptischen Techniken in einer sauberen Umgebung haben, da sie sehr empfindlich auf Verunreinigungen reagieren.

Beginnen Sie mit der Gefriertrocknung der frischen Pflanzenteile mit dem Gefriertrockner und mahlen Sie sie dann mit einer Mahlmühle mit einem 0,85-Millimeter-Maschensieb fein. Lagern Sie die gemahlenen Proben bis zur Extraktion in Beuteln im Dunkeln. Um mögliche Phytosteroide in den Pflanzen zu extrahieren, geben Sie die getrocknete Probe in einen Kolben geeigneter Größe und dann Methanol in HPLC-Qualität.

Decken Sie die pflanzliche Methanollösung mit Alufolie ab und stellen Sie sie drei Tage lang auf einem Orbitalschüttler auf 100 U/min ein. Nach drei Tagen verwenden Sie Filterpapier, um das Supernat umzufüllen und in ein Tropffiltersystem zu dekantieren. Trocknen Sie den Pflanzenextrakt mit einem Rotationsverdampfer, bis er eingedickt ist, aber in einen 300-Milliliter-Rundkolben gießbar ist.

Gießen Sie die Probe in einen 50-Milliliter-Kolben, spülen Sie den großen Kolben mit einer kleinen Menge Methanol und trocknen Sie die Probe dann weiter in dem kleinen Kolben, bis das Methanol vollständig verdampft ist. Wenn Sie fertig sind, wiegen Sie den Probenrückstand mit einer Analysenwaage und erfassen Sie die Masse. Lösen Sie den Pflanzenextrakt in DMSO in einer Konzentration von 0,1 Gramm Extrakt auf zwei Milliliter DMSO auf und wirbeln Sie es, bis es homogenisiert ist.

DMSO ist an sich nicht giftig, aber es ist ein Vehikel, das es anderen Substanzen ermöglicht, Membranen zu durchdringen. Da wir nicht wissen, ob unsere Pflanzen giftige Chemikalien enthalten, werden alle so behandelt, als wären sie gefährlich. Lassen Sie die Lösung nicht mit der Haut in Berührung kommen, ersetzen Sie die Handschuhe, wenn sie kontaminiert sind, und tragen Sie dicke, eng anliegende Schuhe und Laborkittel.

Lagern Sie die Probe bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius in Braunglasfläschchen. Die Proben werden vortexen und dann vier Mikroliter jeder Probe zu 496 Mikrolitern Siebmedium gegeben, um eine 0,8%ige DMSO-Lösung zu erhalten. Desinfizieren Sie die Außenfläche eines vorgewärmten Zellrückgewinnungsmediums mit 70 % Ethanol und geben Sie 10 Milliliter des Mediums in ein Röhrchen mit gefrorenen Reporterzellen, um sie aufzutauen.

Schließen Sie das Röhrchen mit den Reporterzellen und legen Sie es für fünf bis 10 Minuten in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad. Nachdem Sie die Zellen aus dem Wasserbad genommen haben, drehen Sie das Röhrchen mehrmals vorsichtig um, um Zellaggregate aufzubrechen und eine homogene Suspension herzustellen, und reinigen Sie dann die Oberfläche des Röhrchens mit 70 % Ethanol. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 100 Mikroliter der Reporterzellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte zu dispensieren, und geben Sie dann 100 Mikroliter Proben in dreifacher Ausfertigung in die entsprechenden Vertiefungen ab.

Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 22 bis 24 Stunden. Kurz vor dem Ende der Platteninkubation nehmen Sie das Detektionssubstrat und den Detektionspuffer aus dem Kühlschrank und legen Sie sie an einen schwachen Lichtbereich, bis sie auf Raumtemperatur ausgeglichen sind, und drehen Sie dann jedes Röhrchen vorsichtig um, um die Lösungen zu mischen. Unmittelbar bevor die Platteninkubation abgeschlossen ist, gießen Sie den gesamten Inhalt des Detektionspuffers in das Röhrchen mit dem Detektionssubstrat, um das Luziferase-Detektionsreagenz herzustellen.

Mischen Sie die Tube vorsichtig, um keinen Schaum zu erzeugen. Entsorgen Sie den Inhalt der Probenplatte in einen ungeeigneten Abfallbehälter und klopfen Sie ihn vorsichtig auf ein sauberes, saugfähiges Papiertuch, um die letzten Tröpfchen aus den Vertiefungen zu entfernen. Geben Sie 100 Mikroliter des Luciferase-Detektionsreagenzes in jede Vertiefung und lassen Sie die Assay-Platte 15 Minuten lang bei Raumtemperatur ruhen, dann quantifizieren Sie die Lumineszenz mit einem 96-Well-Plattenablese-Luminometer.

22 Extrakte aus Obst und Gemüse, die häufig in der menschlichen Ernährung vorkommen, wurden auf das Vorhandensein östrogener Verbindungen untersucht. Die östrogene Aktivität wird in einer ordinalen qualitativen Weise von hoher, mittlerer, niedriger oder keiner Aktivität dargestellt. Ökologische/biologische und nichtökologische/nicht-biologische Sojabohnen wurden mit hoher Aktivität gescreent, während alle anderen Obst- und Gemüseartikel keine Aktivität aufwiesen.

Der Vergleich der Ergebnisse von Sojabohnen mit der Standardkurve zeigt auch, dass sie bei dieser Konzentration eine hohe östrogene Aktivität aufweisen. Sojabohnenextrakt, eine bekannte potente Quelle für die Isoflavone Daidzein und Genistein, wurde weiter verwendet, um die Verdünnung zu bestimmen, die ein Maximum von 50% Signal ergibt. Dieser Extrakt erfordert eine 422-mal höhere Verdünnung, um die Hälfte des Signals unseres Standardverdünnungsprotokolls zu erzeugen.

Proben, die mit Aktivität identifiziert wurden, könnten zur massenspektrometrischen Analyse geschickt werden, um die aktiven Chemikalien zu identifizieren. Mit Hilfe einer antagonistischen Methode konnten wir auch feststellen, ob die pflanzliche Nahrung Chemikalien enthält, die die Bindung und Aktivität von endogenen Östrogenen reduzieren. Diese Technik ermöglicht es uns, besser zu verstehen, wie weit verbreitete östrogene Lebensmittel in der Ernährung von Primaten sind und wie der Verzehr von Phytoöstrogenen die Physiologie und das Verhalten beeinflusst, wenn der Assay mit fäkalen Hormonanalysen und Felddaten kombiniert wird.