Translaminares autonomes Systemmodell zur Modulation des intraokularen und intrakraniellen Drucks in menschlichen spenderseitigen Segmenten

Dieses neuartige translaminare autonome System des Auges nutzt das hintere Augensegment, um den intraokularen und intrakraniellen Druck unabhängig voneinander zu regulieren und einen translaminaren Druckgradienten zu erzeugen. Das TAS-Modell ermöglicht die präklinische Ex-vivo-Bewertung des intrakraniellen Drucks beim Menschen, die bisher nicht untersucht werden konnte. Dieses Modell könnte möglicherweise zur Untersuchung von Krankheiten wie Glaukom, traumatischen Hirnverletzungen, idiopathischer intrakranieller Hypertonie und raumfahrtassoziiertem neurookulärem Syndrom verwendet werden.

Um die Zulaufspritzen einzurichten, befüllen Sie die 30-Milliliter-Spritze mit 30 Millilitern der gewünschten Perfusionsflüssigkeit und befestigen Sie einen Drei-Wege-Absperrhahn an der Spritze. Befestigen Sie einen hydrophilen 0,22-Mikrometer-Filter an dem Absperrhahn und befestigen Sie einen 15-Gauge-Luer-Stub-Adapter an dem hydrophilen 0,22-Mikrometer-Filter. Nachdem Sie die Luftblasen aus der Spritze entfernt haben, befestigen Sie den Schlauch am Luer-Stub-Adapter und verschließen Sie den seitlichen Anschluss des Absperrhahns mit einer unbelüfteten Universal-Verschlusskappe.

Nachdem Sie eine zweite Zuflussspritze wie gerade gezeigt eingerichtet haben, beschriften Sie einen Spritzenkanal mit einem ICP und den anderen Spritzenkanal mit zwei IOD. Richten Sie dann die Abflussspritzen wie gerade gezeigt ein, jedoch ohne die Spritzen mit dem Infusionsmedium zu beladen. Um eine Probe des gesamten Auges des Menschen vorzubereiten, entfernen Sie die Sehnervenscheide und entfernen Sie den Glaskörper aus dem hinteren Segment.

Um einen guten Sitz auf der runden Kuppel der IOD-Kammer zu gewährleisten, schneiden Sie bei Bedarf zusätzliche Sklera aus dem hinteren Segment ab und verwenden Sie eine Pinzette, um sicherzustellen, dass die Netzhaut gleichmäßig über den menschlichen hinteren Teil des Segments verteilt ist. Platzieren Sie dann das Segment mit dem Sehnerv nach oben in der IOD-Kammer des TAS über der runden Kuppel und verwenden Sie einen Epoxidharz-O-Ring und vier Schrauben, um das hintere Segment abzudichten. Um die IOD-Kammer einzurichten, führen Sie den Schlauch in die Ein- und Ausgänge der Kammer ein und führen Sie die IOD-Zuflussspritze in den Eingangsanschluss ein.

Führen Sie die leere IOP-Ausflussspritze in die Ausgangsöffnung ein und verwenden Sie die Push/Pull-Methode, um das Perfusionsmedium langsam in die Zuflussöffnung zu infundieren, um die hintere Augenmuschel zu füllen, während Sie gleichzeitig das Perfusionsmedium langsam durch die Ausflussspritze herausziehen, um Luftblasen von den Leitungen zu entfernen. Sobald sowohl der Ein- als auch der Ausgang frei von Luftblasen sind, stoppen Sie die Infusion und verriegeln Sie die Absperrhähne in der Aus-Position. Entfernen Sie die Spritze aus der IOD-In-Port-Filterbaugruppe, füllen Sie die Spritze mit 30 zusätzlichen Millimetern Medium und setzen Sie dann die Spritzeneinrichtung wieder in die Filterbaugruppe ein.

Um die ICP-Kammer einzurichten, platzieren Sie die Kammer über der Rückseite des hinteren Segments, achten Sie darauf, dass sich der Sehnerv in der oberen Kammer befindet, und verschließen Sie die obere Kammer mit vier Schrauben, dann führen Sie den Schlauch in die Ein- und Ausgänge der ICP-Kammer ein, die ICP-Eingangsspritze in den Eingangsanschluss. und die leere ICP-Auslaufspritze in den Ausgang, um das System mit Medium zu spülen, wie gerade gezeigt. Um das Datenaufzeichnungssystem einzurichten, schalten Sie die achtkanalige Stromquelle und den Computer ein und starten Sie die Datenerfassungssoftware. Wählen Sie Datei und Neu und dann Setup und Kanaleinstellungen aus.

Wählen Sie drei Kanäle aus und benennen Sie die Kanäle wie angegeben um. Wählen Sie zwei Millivolt für den Bereich auf allen Kanälen aus, und wählen Sie in der Spalte Berechnung die Option Keine Berechnung für die Kanäle eins und zwei aus. Wählen Sie Arithmetik für Kanal drei aus. Wählen Sie im Formelfenster unter Kanäle die Option Kanal 2 aus.

Wählen Sie unter Funktion die Option Mathematik und Minus aus, und wählen Sie unter Kanäle die Option Kanal 1 aus. Um die hydrostatischen Druckmessumformer einzurichten und zu kalibrieren, schließen Sie die hydrostatischen Druckmessumformer an die Messumformleitungen an, die an den Mehrkanal-Brückenverstärker angeschlossen sind, und schließen Sie eine leere 30-Milliliter-Spritze an den seitlichen Anschluss des ICP-Druckmessumformers an. Befestigen Sie einen ICP-Druckmessumformer an der Unterseite des Kanals und klicken Sie auf den Pfeil neben der Probenahmezeit, um die Probenahmegeschwindigkeit auf 100 einzustellen.

Wählen Sie Bridge Amp, Netzfilter und Null und warten Sie, bis das System den Nullpunkt erreicht hat, und achten Sie darauf, den Druckmessumformer nicht zu bewegen. Kneifen Sie dann die weißen Laschen des Druckmessumformers zusammen und drücken Sie Luft durch den Messumformer, bis 40 Millimeter Quecksilber auf dem Blutdruckmessgerät erreicht werden, lassen Sie dann die weißen Laschen los und entfernen Sie die Spritze und das Blutdruckmessgerät. Wählen Sie auf der Seite Einheitenumrechnung die Option Minus aus, und markieren Sie das höchste Plateau, um 40 Millimeter Quecksilbersäule anzugeben.

Klicken Sie auf den Pfeil für 0,1, geben Sie 100 ein, und markieren Sie das niedrigste Plateau, um null Millimeter Quecksilbersäule anzuzeigen. Klicken Sie auf den Pfeil für 0,2, geben Sie Null ein, wählen Sie Millimeter Quecksilbersäule als Einheiten aus und klicken Sie auf OK. Klicken Sie im Fenster Bridge Amp auf OK, und kalibrieren Sie die hydrostatischen Druckmessumformer für den IOD von Kanal zwei, wie gerade gezeigt, wobei Sie 100 Millimeter Quecksilbersäule für das höchste Plateau und Null für das niedrigste Plateau verwenden.

Um die TAS-Einheit für das hintere Segment an das Datenerfassungssystem anzuschließen, platzieren Sie die TAS-Einheit für das hintere Segment in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und befestigen Sie den ICP-Schlauch am Ausgang des ICP-Druckwandlers des Kanals. Befestigen Sie den IOP-Schlauch vom Ausgang an den IOD-Druckmessumformer des zweiten Kanals. Wählen Sie auf der Seite Diagrammansicht die Option Stichprobenentnahme starten aus, und legen Sie die Sampling-Geschwindigkeit auf Langsam und eine Minute fest.

Stellen Sie dann die Spritzen am Ringständer nach oben oder unten ein, um den ICP- und IOD-Druck gemäß den Protokollanforderungen zu regulieren, oder platzieren Sie sie auf Perfusionspumpen, um den Druck zu regulieren. In dieser repräsentativen Analyse wurde die Aufrechterhaltung der durchschnittlichen Normaldruckdifferenzen in beiden Kammern anhand verschiedener Parameter von IOD- und ICP-Bedingungen getestet. Um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu gewährleisten, wurde das Medium im Gewebe alle 48 Stunden gewechselt.

Minimale Druckerhöhungen traten zum Zeitpunkt des Mediumaustauschs auf und hatten keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit oder Morphologie des Sehnervenkopfes, wie durch immunhistochemische Analyse und Kollagen-IV-Expression an den Tagen 14 und 30 des Experiments beobachtet wurde. Die Erhöhung oder Verringerung des IOP über verschiedene Zeitpunkte ermöglicht die Aufrechterhaltung eines Bereichs mit erhöhtem translaminarem Druckgradienten für sieben Tage. Nach sieben Tagen mit erhöhtem translaminarem Druckgradienten wurden Schröpfen und Verdickungen in den hinteren Segmenten beobachtet, und die Kollagen-IV-Expression zeigt verdickte Strahlen mit einer erhöhten Signalexpression über den Versuchszeitraum.

Die Phasenbildgebung zeigt gesunde retinale Ganglienzellen innerhalb der Ganglienzellschicht ohne Schröpfen in den Kontrollsegmenten, während Bilder aus Kulturen mit erhöhtem translaminarem Druckgradienten ein ausgedehntes Schröpfen zeigen, bei dem keine retinalen Ganglienzellen in der retinalen Nervenfaserschicht verbleiben, und ein verstärkter Umbau der extrazellulären Matrix. Diese Technik wird es Forschern ermöglichen, biomechanische Krankheitsparadigmen effektiv zu untersuchen und den translaminaren Druck im menschlichen Auge zu entdecken, der auf die molekulare Pathogenese abzielt.