Vollautomatische beinverfolgung in frei beweglichen Insekten mit Feature Learning Leg Segmentation and Tracking (FLLIT)

FLLIT ist ein Algorithmus, der die Körper- und Beinzusammensetzungen eines verfolgten Tieres berechnet. Und dies ist nützlich für die Charakterisierung der Schaltung, die sowohl normale und Krankheit Gehen Verhalten zugrunde liegt. Das Einzigartige an FLLIT ist, dass es keine vom Benutzer mit Anmerkungen benoteten Datensätze für schulungen erfordert und somit voll automatisiert ist.

Aber analysiert auch automatisch die Track-Daten, die eine Reihe von Gangmessungen, Gangdiagramme für die Visualisierung und ein Track-Video erzeugen. Demonstriert wird das Verfahren von Animesh Banerjee, einer Postdoktorandin aus meinem Labor. Bevor Sie mit einem Experiment beginnen, bestätigen Sie, dass die Aufnahmestation über eine Hochgeschwindigkeitskamera mit einer Bühne verfügt, um die Arenakammer zu halten.

Platzieren Sie Infrarot-LED-Leuchten an der Spitze der Bühne mit einem Diffusor zwischen der Kamera und der Probe. Etwa 40 Minuten vor Beginn der Aufnahme, übertragen Sie die Fliegen in eine leere abscheuliche auf dem Eis für fünf bis sieben Minuten. Während die Fliegen sediert werden, verwenden Sie Wasser und ein Tuch, um die Arena und Glasrutschen der Kammer zu löschen und eine der Glasgleiteten unter der Kammer zu banden.

Mit einer sauberen Bürste eine anästhesierte Fliege in die Kammer übertragen und die Kammer mit einem zweiten Dia und Klebeband sichern. Dann lassen Sie die kammergekammerte Fliege bei Raumtemperatur für 15 bis 20 Minuten zu akklimatisieren. Um Videos für die FLLIT-Analyse zu generieren, schalten Sie zunächst die Stromquelle ein, und öffnen Sie die Viewer-Anwendung auf dem angeschlossenen Computersystem.

Ändern Sie die Aufnahmebildrate auf 1.000 Bilder pro Sekunde, und stellen Sie die Verschlusszeit auf eine Millisekunde ein. Platzieren Sie die Kammer mit der Fliege auf der Aufnahmearena und klicken Sie auf die LIVE-Taste. Bestätigt, dass die Kamera auf die Beinspitzen fokussiert ist, wenn die Fliege aufrecht auf dem Boden der Kammer läuft und auf Aufzeichnung klickt.

Während der Aufnahme, stellen Sie sicher, dass die Fliege in einer relativ geraden Flugbahn geht, ohne den Rand der Arena zu berühren, geht mindestens drei Schritte pro Bein, hält nicht während des Spaziergangs, und dass die zurückgelegte Strecke ist das Äquivalent von mindestens eineinhalb Körperlängen. Klicken Sie am Ende der Analyse auf Fertig aufnehmen, um die Aufzeichnung zu beenden und die Dateien im Mraw- oder Tiff-Format in den entsprechenden Ordnern zu speichern. Um FLLIT zu installieren, laden Sie das Programm zuerst auf ein beliebiges Betriebssystem herunter.

Extrahieren Sie den Inhalt der ZIP-Datei und laden Sie Beispieldatensätze herunter. Um FLLIT in Ubuntu zu installieren, navigieren Sie zum VERZEICHNIS FLLIT/Compiled und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um Im Terminal öffnen auszuwählen. Laden Sie einen Beispieldatensatz herunter und erstellen Sie unter FLLIT-master/Compiled eine Ordnerdaten, in die die Datensatzordner abgelegt werden.

Installieren Sie die MATLAB-Laufzeitbibliotheken in HOME/MCR. Wenn die Installation der MATLAB-Laufzeitbibliothek abgeschlossen ist, geben Sie den Befehl aus, um sicherzustellen, dass die ausführbaren Rechte in FLLIT aufgezeichnet werden. Geben Sie dann den Befehl ein, um FLLIT auszuführen.

Für die Segmentierung des Videos konvertieren Sie die Datei in einzelne TIFF-Dateien und speichern Sie die konvertierten Dateien im FLLIT-Datenordner. Wenn alle Dateien übertragen wurden, führen Sie FLLIT aus. Wählen Sie im Popup-Fenster 0 für die Durchführung der Beinsegmentierung oder 1 aus, um die Beinverfolgung mit der Beinsegmentierung einzuschließen.

Wählen Sie den Ordner aus, der die Frame-by-Frame-TIFF-Bilder des zu verfolgenden Videos und die interessierte Datei enthält, und klicken Sie auf Hinzufügen. Klicken Sie dann auf Fertig, um die Segmentierung und Nachverfolgung des ausgewählten Videos zu initiieren. Um die Genauigkeit der Nachverfolgung zu überprüfen und Fehlerkorrekturen durchzuführen, klicken Sie auf Datenordner auswählen, und wählen Sie dann den zu verfolgenden Ordner aus.

Klicken Sie auf Nachverfolgung anzeigen, und überprüfen Sie die Beschriftung für alle Beine im ersten Frame. Wenn ein Bein falsch beschriftet ist und eine Korrektur erforderlich ist, klicken Sie auf Anzeige anhalten und Vorhersage anpassen. Wählen Sie im Bedienfeld Bein zum Anpassen das Bein aus, das korrigiert werden muss, und doppelklicken Sie auf die richtige Position dieses Beins im Bildfenster.

Klicken Sie dann auf Speichern und Beenden. Um die segmentierten und nachverfolgten Daten zu verarbeiten, klicken Sie auf Datenprozess. Berechnen Sie zunächst das tatsächliche Sichtfeld des aufgenommenen Videos, damit die Gate-Parameter gemessen werden können.

Geben Sie im Popup-Fenster die Anzahl der Bilder pro Sekunde ein, bei denen das Video aufgezeichnet wird, und geben Sie das berechnete Sichtfeld in Millimetern ein. Um auf die Tracking-Ergebnisse zuzugreifen, öffnen Sie die Ergebnisse und Überwachungsordner. Um ein Video der verfolgten Fliege zu generieren, wählen Sie Video erstellen aus.

Nach der Beinsegmentierung, Verfolgung und Datenverarbeitung generiert FLLIT automatisch Rohdaten für die Positionen des Körpers und jede Beinkralle, 20 Gangparameter und begleitende Plots sowie nachverfolgte Videos. SCA3 ist durch einen ataxic Gang mit Körperveering, unregelmäßiger Fußplatzierung und kurzen lurching Schritten typisiert. Um den Gang mutierter SCA3-Fliegen zu charakterisieren und zu untersuchen, ob sie einen ähnlichen Gang wie menschliche Patienten aufweisen, können die relevanten Gangparameter analysiert werden, die von FLLIT erzeugt werden.

SCA3-Q84 Fliegen zeigen mehr Drehungen, unregelmäßige Fußplatzierung, wie durch eine geringe Platzordnung Regelmäßigkeit gezeigt, und erhöhte Bein-Domänenüberlappung, vergrößerte Beindomänen in Länge und Fläche, und verringerte Schrittlänge. FLLIT kann auch ein Video generieren, das die verfolgte Fliege und die Beine in den arenazentrierten und körperzentrierten Ansichten, die Körperbahn, die Richtung sowie die vertikalen und seitlichen Verschiebungen jedes Beins zeigt. Im Vergleich zu SCA3-Q27 Fliegen weisen SCA3-Q84 Fliegen unregelmäßige sich schneidende Beindomänen unterschiedlicher Größe auf, was auf einen lauernden, ataxic Gang hindeutet.

Die Rohdaten für die Körper- und Beinkrallenpositionen können weiter auf spezifische Interessenbewegungen analysiert werden. Zum Beispiel ermöglichte die Verwendung von FLLIT unserer Gruppe zu bestimmen, dass die starren Phänotypen, die von Drosophila-Modellen der Parkinson-Krankheit angezeigt werden, durch dopaminerge Neuronenfunktionsstörungen verursacht werden.