Name: Nachweis der Protein-S-Acylation mit Acyl-Resin Assisted Capture (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Lernen Sie die Acyl-RAC-Methode zur zuverlässigen Detektion von Protein-S-Acylierung in verschiedenen biologischen Proben. Diese Technik ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer Proteine und überwindet die Grenzen herkömmlicher Markierungsverfahren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von den Nationalen Instituten für Gesundheit Stipendien 5R01GM115446 und 1R01GM130840 unterstützt.

Mäuse, die in diesem Protokoll verwendet wurden, wurden gemäß den NIH-Richtlinien eingeschläfert. Das Animal Welfare Committee am University of Texas Health Science Center in Houston genehmigte alle Tierarbeiten.
1. Herstellung von Zelllysaten
<ol><li>Vorbereiten des Lysepuffers wie in Tabelle 1beschrieben . Auf 10 ml PBS 0,1 g n-Dodecyl-D-Maltosid-Waschmittel (DDM) geben und drehen, um sich aufzulösen. Fügen Sie 100 l Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 2, ML211 (10 m), PMSF (10 mM) und Protease-Inhibitor-Cocktail (1x) hinzu und kühlen Sie den Puffer vor Gebrauch auf Eis.</li>
	<li>Übertragen Sie benötigte Medien, die Zellen aus dem Inkubator enthalten, in 15 ml oder 50 ml konische Röhren und Spinzellen bei 350 x g für 5 min und aspirieren Sie, um Zellablagerungen loszuwerden. HINWEIS: Wir verwendeten 1 x 107 Zellen für jede acyl-RAC-Reaktion, die durchgeführt werden sollte.</li>
	<li>Waschen Sie das Pellet, indem Sie es in 5 ml PBS wieder aufhängen und bei 350 x g für 5 min drehen. HINWEIS: Führen Sie Schritt 1.3 schnell aus, um eine Zelllyse aufgrund einer längeren Inkubation in PBS zu vermeiden.</li>
	<li>In Schritt 1.1 auf das Pellet 600 l Lysepuffer geben und durch Schütteln bei 1500 Umdrehungen pro Minute in einem Thermoshaker 30 min bei 4 °C lysieren.</li>
	<li>Klare Lysate durch Zentrifugation bei 20.000 x g bei 4 °C für 30 min zu Pelletwaschmitteln unlöslichen Materialien. Gerodetes Lysat in vorgekühlten 1,5 ml Mikrofugenrohren sammeln und auf Eis halten.</li>
	<li>Führen Sie einen Bradford/BCA-Test durch, um die Proteinkonzentration zu schätzen. Es ist wichtig, die gleiche Menge an Protein über verschiedene Proben zu gewährleisten, bevor das Experiment durchgeführt wird. Wir empfehlen die Verwendung von mindestens 500 g Protein pro Reaktion. HINWEIS: In den beschriebenen Experimenten verwendeten wir kultivierte (Jurkat) Zellen und primäre Splenozyten aus Mäusegewebe. Die oben beschriebene Lysemethode kann auch auf andere Zelltypen übernommen werden. Die durchschnittliche Proteinkonzentration für die oben genannten Zelltypen beträgt ca. 500 g pro 1 x 107 Zellen. Jurkat-Zellen wurden in RPMI-1640 mittelmodifiziert gehalten, um 2 mM L-Glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM Natriumpyruvat, 4.500 mg/L Glukose und 1.500 mg/L Natriumbicarbonat zu enthalten, ergänzt mit 10% FBS bei 37 °C mit 5%CO2. Wir verwendeten 1 x 107 Jurkat-Zellen pro Reaktion. Primäre Milzzyten wurden aus Mausmilzgewebe isoliert, wiebeschrieben 26. Kurz gesagt, Milzgewebe wurde auf Eis mazeriert, gefolgt von Lyse von Erythrozyten in hypotonischer Lösung und Trennung von den Lymphozyten durch Zentrifugation. Wir verwendeten 1 x 107 Primärzellen pro Reaktion.</li>
</ol>2. Acyl-RAC: Blockierung freier Thiolgruppen
HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte können bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt werden.
<ol><li>Lysat in ein frisches 1,5 ml Mikrofugenrohr übertragen und Chloroform-Methanol (CM)-Fällung wie unten beschrieben durchführen.<ol>
<li>Methanol (MeOH) und Chloroform (CHCl3) in ein Endverhältnis von Lysat in das Lysat geben: MeOH: CHCl3 von 2:2:1 und kräftig schütteln, um eine homogene Suspension zu erzeugen.</li>
		<li>Drehen Sie bei 10.000 x g für 5 min, um ein Pellet ("Pancake") in der Interphase zwischen wässrigen und organischen Phasen zu bilden.</li>
		<li>Neigen Sie das Rohr und aspirieren Sie so viel Lösungsmittel wie möglich mit einer Nadel oder einer Gel-Ladespitze.</li>
		<li>Trocknen Sie das Proteinpellet für ein paar Minuten und waschen Sie es vorsichtig, indem Sie 600 l MeOH hinzufügen und sanft mischen, um ein Aufbrechen des Pellets zu vermeiden.</li>
		<li>Entfernen Sie den restlichen MeOH vorsichtig und trocknen Sie das Proteinpellet ca. 5 min auf einer Tischplatte.</li>
		<li>(Optional) Führen Sie einen zusätzlichen Zentrifugationsschritt durch, um ein gebrochenes Pellet nach dem MeOH-Waschgang herunterzudrehen, um den Verlust der Probe zu vermeiden. HINWEIS: Das Experiment kann nach dem CM-Fällungsschritt beendet werden. Sobald das Pellet erhalten ist, kann es in 500 l MeOH in -20 °C bis zu einer Woche gelagert werden.<ol>
<li>Lösen Sie das Proteinpellet in 200 l 2SHB-Puffer, indem Sie bei 42 °C/1500 Rpm in einem thermischen Shaker wirbeln, bis sich das Pellet auflöst.</li>
		</ol>
</li>
		<li>(Optional) Inkubieren Sie für weitere 5–10 min in einem beschallenden Wasserbad, um das Pellet aufzulösen. HINWEIS: Die Länge der Beschallung variiert je nach Löslichkeit des Materials. Eine längere Beschallung kann jedoch zu proteinem Abbau führen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie 0,2 % Methylmethansthiosulfonat (MMTS) (v/v) in 2SHB vor, indem Sie 2 L MMTS zu 998 L 2SHB-Puffer hinzufügen. HINWEIS: Verwenden Sie für jedes Experiment frisch zubereitete 0,2% MMTS.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Rohr 200 l 0,2% MMTS in 2SHB zu einer Endkonzentration von 0,1% MMTS hinzu. 15 min bei 42 °C mit Schütteln bei 1500 Umdrehungen pro Minute in einem Thermoshaker inkubieren.</li>
</ol>3. Acyl-RAC: Hydroxylamin (HAM) Spaltung und Erfassung von S-acyatierten Proteinen
<ol><li>Wiederholen Sie 3-4x CM-Ausfällungen wie oben beschrieben, um MMTS zu entfernen. Die Entfernung von MMTS kann durch den Mangel an ausgeprägtem Geruch von MMTS geschätzt werden. Nach jeder Ausfällung das Pellet in 100 L 2SHB-Puffer auflösen, indem man bei 42 °C/1500 Umdrehungen in einem thermischen Shaker wirbelt, bis sich das Pellet auflöst, und dann mit 300 l Puffer A verdünnen.</li>
	<li>Nach der endgültigen Fällung Proben in 200 L 2SHB-Puffer wie oben beschrieben auflösen und mit 240 l Puffer A verdünnen.</li>
	<li>Im Falle des Vergleichs von Veränderungen der S-Acylation als Reaktion auf mehrere Behandlungsbedingungen, messen Sie die Proteinkonzentration erneut und gehen Sie mit der gleichen Menge an Protein für jede Bedingung vor.</li>
	<li>Bewahren Sie 40 l von jeder Probe als Eingabesteuerung auf.</li>
	<li>Teilen Sie die Proben in zwei gleiche Teile von 200 l auf und markieren Sie Rohre als "+ HAM" und "- HAM". Fügen Sie 50 l frisch zubereitete neutrale 2 M HAM (pH 7.0-7.5) zu einer Endkonzentration von 400 mM in eines der Rohre (+ HAM) und 50 l neutrale 2 M NaCl in das zweite Rohr (- HAM) ein, das als Negativkontrolle verwendet wird. Fahren Sie mit der Zugabe von Thiopropyl-Sepharose (TS) Perlen fort. HINWEIS: Das Experiment kann nach einem der CM-Fällschritte beendet werden. Sobald das Pellet erhalten ist, kann es in 500 l MeOH in -20 °C bis zu einer Woche gelagert werden. Neutraler pH-Wert von 2 M HAM gewährleistet seine Selektivität für die Acyl-Cystein-Thioester-Bindung und sollte sorgfältig eingestellt werden. Bei der Handhabung von Proben im 2SHB-Puffer ist Vorsicht geboten, um probenverlust durch übermäßiges Schäumen zu vermeiden. Alle folgenden Schritte sind identisch für - HAM und + HAM Proben.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Rohr 30 L TS-Perlenschlämme hinzu und drehen Sie die Rohre bei RT um 1-2 h.</li>
	<li>Waschen Sie die TS-Perlen 4x mit 1% SDS in Puffer A, um Rest-HAM zu entfernen.<ol>
<li>Drehen Sie alle Perlenproben vorsichtig mit einer Mikrofuge für 1 min und saugen Sie vorsichtig den Überstand an.</li>
		<li>Setzen Sie die Perlen in 500 l von 1% SDS in Puffer A wieder aus.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 3.7.1–3.7.2 dreimal. HINWEIS: Aktivierte Thiopropyl-Sepharose (TS) wird gefriergetrocknet in Gegenwart von Additiven geliefert, die vor der Kopplung bei neutralem pH-Wert weggewaschen werden müssen. Destilliertes Wasser wird zum Anschwellen und Waschen empfohlen. 0,1 g Perlen wiegen und in 1 ml destilliertem Wasser wieder aufhängen und beim Drehen von 30 min-1 h bei RT anschwellen lassen. Perlen 1x mit Puffer A waschen und eine Gülle mit Puffer A im Verhältnis von 50% mittel- zu 50% Puffer vorbereiten. Geschwollene TS können bis zu einer Woche bei neutralem pH-Wert in Gegenwart von 20% Ethanol bei 4 °C gelagert werden. Verwenden Sie Natriumazid nicht als bakteriostatisches Mittel, da Azidionen mit den 2-Pyridyldisulfidgruppen reagieren. Für eine höhere Effizienz, bereiten Sie frische Perlen. Beim Umgang mit den Perlen kann die Spitze einer P200 Pipettenspitze leicht geschnitten werden, um Schäden zu vermeiden. HINWEIS: Das Experiment kann in jeder Phase nach CM-Fällung gestoppt werden. Das Pellet kann in 500 l MeOH in -20 °C bis zu einer Woche gelagert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Elution und Nachweis von S-acyatierten Proteinen
<ol><li>Nach der letzten Wäsche die Perlen wie oben beschrieben sanft herunterdrehen und so viel Überstand wie möglich ansaugen, ohne die Perlen zu stören.</li>
	<li>Stellen Sie die Proteine aus Perlen mit 4x SDS-Probenpuffer mit DTT zurück.<ol>
<li>Fügen Sie den Perlen 50 L 4x SDS-Probenpuffer hinzu und brüten bei 80 °C, 1500 Umdrehungen pro Minute für 15 min in einem Thermoshaker. Lassen Sie die Rohre abkühlen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Perlen bei 5.000 x g für 3 min, um die Perlen vollständig zu pellet und die eluierten Proteine mit einer Gel-Ladespitze in ein frisches 1,5 ml-Rohr zu übertragen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie SDS-PAGE aus und analysieren Sie die S-Acylierung der Proteine, die von Interesse sind, durch Western Blotting.</li>
</ol>

<ol><li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).</li>
<li>Magee, A. I., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+classes+of+fatty+acid+acylated+proteins+exist+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells.</a> EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).</li>
<li>Fujimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-selectin+is+acylated+with+palmitic+acid+and+stearic+acid+at+cysteine+766+through+a+thioester+linkage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).</li>
<li>DeMar, J. C., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantitation+of+the+fatty+acids+composing+the+CoA+ester+pool+of+bovine+retina%2C+heart%2C+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).</li>
<li>Montigny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S+-Palmitoylation+and+S+-Oleoylation+of+Rabbit+and+Pig+Sarcolipin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).</li>
<li>Muszbek, L., Laposata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+modification+of+proteins+by+arachidonate+and+eicosapentaenoate+in+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).</li>
<li>Hallak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+binding+of+arachidonate+to+G+protein+alpha+subunits+of+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).</li>
<li>Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+protein-palmitoylating+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archive%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Discovery of protein-palmitoylating enzymes.</a> Pflügers Archive: European Journal of Physiology. , 1206(2008).</li>
<li>Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+palmitoylation%2C+raft+localization%2C+and+T+cell+signaling+by+2-bromopalmitate+and+polyunsaturated+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).</li>
<li>Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+palmitoylation+of+the+protein-tyrosine+kinase+p56lck%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).</li>
<li>Blanc, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SwissPalm%3A+Protein+Palmitoylation+database%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">SwissPalm: Protein Palmitoylation database.</a> F1000Research. 4 (0), 1-23 (2015).</li>
<li>O'Brien, P. J., Zatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acylation+of+bovine+rhodopsin+by+%5B3H%5Dpalmitic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid.</a> Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).</li>
<li>Drahansky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((We+are+IntechOpen+%2C+the+world%27s+leading+publisher+of+Open+Access+books+Built+by+scientists%5BTitle%5D)+AND+%22Intech%22%5BJournal%5D)">We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists.</a> Intech. 13, (2016).</li>
<li>Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+analogs+and+inhibitors+to+study+the+functional+significance+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation.</a> Methods. 40 (2), 191-197 (2006).</li>
<li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).</li>
<li>Martin, B. R., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+profiling+of+protein+palmitoylation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells.</a> Nature Methods. 6, 135-138 (2009).</li>
<li>Rami, N., Hannoush, N. A. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+lipidome%3A+omega-alkynyl+fatty+acids+for+detection+and+cellular+visualization+of+lipid-modified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).</li>
<li>Kostiuk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+palmitoylated+mitochondrial+proteins+using+a+bio-orthogonal+azido-palmitate+analogue%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue.</a> FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).</li>
<li>Charron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Fluorescent+Detection+of+Protein+Fatty-Acylation+with+Chemical+Reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).</li>
<li>Roth, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+palmitoylation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein palmitoylation in yeast.</a> Cell. 125, 1003-1013 (2006).</li>
<li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).</li>
<li>Forrester, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+analysis+of+protein+S+-acylation+by+resin-assisted+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture.</a> Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Profiling+of+Cysteine-Based+Reversible+Modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications.</a> Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).</li>
<li>Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+era+of+protein+S-acylation%3A+spotlight+on+structure%2C+mechanisms%2C+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).</li>
<li>Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+brain+palmitoyl-proteome+using+both+acyl-biotin+exchange+and+acyl-resin-assisted+capture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li>
<li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+activation+of+murine+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and activation of murine lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).</li>
<li>Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+EBV-genome+negative+%22null%22+and+%22T%22+cell+lines+derived+from+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+and+leukemic+transformed+non-Hodgkin+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma.</a> International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).</li>
<li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).</li>
<li>Hundt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation-Dependent+Plasma+Membrane+Transport+but+Lipid+Raft-Independent+Signaling+by+Linker+for+Activation+of+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells.</a> Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).</li>
<li>Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+detergents+to+purify+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">The use of detergents to purify membrane proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).</li>
<li>Brdicka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoprotein+associated+with+glycosphingolipid-enriched+microdomains+%28PAG%29%2C+a+novel+ubiquitously+expressed+transmembrane+adaptor+protein%2C+binds+the+protein+tyrosine+kinase+csk+and+is+involved+in+regulation+of+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).</li>
<li>Akimzhanov, A. M., Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+transient+palmitoylation+of+the+tyrosine+kinase+Lck+mediates+Fas+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).</li>
<li>Stetsenko, A., Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+top+ten+detergents+used+for+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Crystals%22%5BJournal%5D)">An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization.</a> Crystals. 7 (7), (2017).</li>
<li>Adibekian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+characterization+of+a+triazole+urea+dual+inhibitor+for+lysophospholipase+1+%28LYPLA1%29+and+lysophospholipase+2+%28LYPLA2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Probe+Reports+from+the+NIH+Molecular+Libraries+Program%22%5BJournal%5D)">Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2).</a> Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).</li>
<li>Dekker, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibition+of+APT1+affects+Ras+localization+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling.</a> Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-background+acyl-biotinyl+exchange+largely+eliminates+the+coisolation+of+non-+s-acylated+proteins+and+enables+deep+s-acylproteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).</li>
<li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).</li>
<li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).</li>
</ol>

Es wurden keine Interessenkonflikte angemeldet.

Hier haben wir den Acyl-RAC-Assay erfolgreich genutzt, um die S-Acylierung ausgewählter Proteine sowohl in kultivierten menschlichen Zellen als auch in Primärzellen aus Mausgewebe zu erkennen. Diese Methode ist einfach, empfindlich und kann mit minimalen Ausrüstungsanforderungen mit Standard-Biochemie-Techniken einfach durchgeführt werden. Diese Methode hat sich gezeigt, um erfolgreich neuartige S-acylated Proteine wie die Untereinheit des Protein-Translocating-Systems (Sec61b), das ribosomale ProteinSS11 (Rps11...

S-Acylierung ist eine reversible posttranslationale Modifikation, bei der eine fetthaltige Acylkette zu einem internen Cysteinrückstand auf einem Zielprotein über eine labile Thioesterbindung1verwendet wird. Es wurde zuerst als eine Modifikation von Proteinen mit Palmitat berichtet, eine gesättigte 16-Kohlenstoff-Fettsäure2, und daher wird diese Modifikation oft als S-Palmitoylierung bezeichnet. Zusätzlich zu Palmitat können Proteine durch eine Vielzahl von längeren und kürzeren gesättigten (Myristate und Stearat), einfach ungesättigten (Oleat) und mehrfach ungesättigten (Arachidonate und Eicosapentanoat) Fettsäuren3,4,5,6,7umkehrend modifiziert werden. In eukaryotischen Zellen wird die S-Acylierung von einer Familie von Enzymen katalysiert, die als DHHC-Protein-Acyltransferasen bekannt sind, und die umgekehrte Reaktion der Cystein-Deacylation wird durch Proteinthioesterasen katalysiert, von denen die meisten noch rätselhaft bleiben8.
Die Lability der Thioester-Bindung macht diese Lipidmodifikation reversibel, so dass sie Proteinclustering, Plasmamembranlokalisierung, intrazellulären Handel, Protein-Protein-Wechselwirkungen und Proteinstabilität9,10dynamisch regulieren kann. Folglich wurde die S-Acylierung mit mehreren Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter die Huntington-Krankheit, die Alzheimer-Krankheit und verschiedene Krebsarten (Prostata, Magen, Blase, Lunge, Kolorektal), was die Entwicklung zuverlässiger Methoden zum Nachweis dieser posttranslationalen Proteinmodifikation erfordert11.
Metabolische Etikettierung mit radioaktiver ([3H], [14C] oder [125I]) Palmitat war einer der ersten Ansätze, die entwickelt wurden, um das Protein S-Acylation12,13,14zu assayieren. Radiolabeling-basierte Methoden stellen jedoch gesundheitliche Bedenken dar, sind nicht sehr empfindlich, zeitaufwändig und erkennen nur lipidation von reichlich vorhandenen Proteinen15. Eine schnellere und nicht radioaktive Alternative zur Radioetikettierung ist die metabolische Etikettierung mit bioorthogonalen Fettsäuresonden, die routinemäßig zur Untersuchung der Dynamik der Protein-S-Acylation16verwendet wird. Bei dieser Methode wird eine Fettsäure mit einem chemischen Reporter (Alkyn- oder Azidgruppe) durch eine Proteinacyltransferase in das S-acylolate Protein eingearbeitet. Die Cycloadditionsreaktion Von Azid-Alkyn Huisgen (Klickchemie) kann dann verwendet werden, um eine funktionalisierte Gruppe, wie ein Fluorophor oder Biotin, an die integrierte Fettsäure zu binden, die den Nachweis des S-acyatierten Proteins17,18,19ermöglicht.
Acyl-Biotin-Austausch (ABE) ist eine der ausgiebig verwendeten biochemischen Methoden zur Erfassung und Identifizierung von S-acyatierten Proteinen, die einige der Mängel der metabolischen Kennzeichnung wie Ungeeignetheit für Gewebeproben15umgeht. Diese Methode kann für die Analyse der S-Acylation in einer Vielzahl von biologischen Proben, einschließlich Geweben und gefrorenen Zellproben20,21, angewendet werden. Diese Methode basiert auf der selektiven Spaltung der Thioesterbindung zwischen der Acylgruppe und dem Cysteinrückstand durch neutrales Hydroxylamin. Die befreiten Thiolgruppen werden dann mit einem Thiol-reaktiven Biotinderivat erfasst. Die erzeugten biotinylierten Proteine werden dann mit Streptavidin-Agarose affinitätsgereinigt und durch Immunoblotting analysiert.
Ein alternativer Ansatz, der als Acyl-Harz-unterstützte Erfassung (Acyl-RAC) bezeichnet wird, wurde später eingeführt, um den Biotinylierungsschritt durch die direkte Konjugation freier Cysteins durch ein Thiol-reaktives Harz zu ersetzen22,23. Diese Methode hat weniger Schritte im Vergleich zu ABE und kann in ähnlicher Weise verwendet werden, um Protein-S-Acylation in einer Vielzahl von Proben zu erkennen1.
Acyl-RAC besteht aus 4 Hauptschritten (Abbildung 1), 1. Sperrung freier Thiolgruppen; 2. Selektive Spaltung der Cystein-Acyl-Thioester-Bindung mit neutralem Hydroxylamin (HAM) zur Belichtung von Cystein-Thiol-Gruppen; 3. Erfassung der lipidierten Cysteins mit einem Thiol-reaktiven Harz; 4. Selektive Anreicherung der S-acyatierten Proteine nach Elution mit reduzierendem Puffer.
Die eingefangenen Proteine können dann durch Immunoblotting analysiert oder einer Massenspektrometrie (MS) basierten Proteomik unterzogen werden, um das S-acylierte Proteom in einer Vielzahl von Arten und Geweben zu bewerten22,24,25. Individuelle S-Acylierungsstellen können auch durch Trypsin-Verdauung der erfassten Proteine und Analyse der resultierenden Peptide durch LC-MS/MS22identifiziert werden. Hier zeigen wir, wie Acyl-RAC zum gleichzeitigen Nachweis der S-Acylation mehrerer Proteine sowohl in einer Zelllinie als auch in einer Gewebeprobe eingesetzt werden kann.

<table><tbody><tr><td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tabletten</td><td>Sigma</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620444</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxylamin (HAM)</td><td>Sigma</td><td>159417</td><td></td></tr><tr><td>Methylmethanethiosulfonat (MMTS)</td><td>Sigma</td><td>64306</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Röhrenrotator</td><td>LabForce</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ML211</td><td>Cayman</td><td>17630</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Therm Cool-Heat-Shake</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000-HC</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl &beta;-D-Maltosid (DDM)</td><td>Sigma</td><td>D641</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase-Inhibitor Cocktail 2</td><td>Sigma</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>Thiopropyl-Sepharose 6B (TS)</td><td>Sigma</td><td>T8387</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonics Quantrex Sonicator</td><td>L &; R</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nachweis der protein-s-acylation mit acyl-resin assisted capture

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

Protein-S-Acylation, auch s-palmitoylation genannt, ist eine reversible posttranslationale Modifikation von Cysteinrückständen mit langkettigen Fettsäuren über eine labile Thioesterbindung. Die S-Akylierung, die sich als weitverbreiteter Regulierungsmechanismus herausbildet, kann fast alle Aspekte der biologischen Aktivität von Proteinen modulieren, von der komplexen Bildung bis hin zum Proteinhandel und der Proteinstabilität. Die jüngsten Fortschritte beim Verständnis der biologischen Funktion der Protein-S-Acylation wurden weitgehend durch die Entwicklung neuartiger biochemischer Werkzeuge erzielt, die einen robusten und empfindlichen Nachweis der Protein-S-Acylation in einer Vielzahl biologischer Proben ermöglichen. Hier beschreiben wir acylharzgestützte Erfassung (Acyl-RAC), eine kürzlich entwickelte Methode, die auf der selektiven Erfassung endogen s-acyatierter Proteine durch Thiol-reaktive Sepharose-Perlen basiert. Im Vergleich zu bestehenden Ansätzen benötigt Acyl-RAC weniger Schritte und kann in Verbindung mit der Massenspektrometrie zur Identifizierung neuartiger S-Acylierungsziele zuverlässigere Ergebnisse liefern. Eine wesentliche Einschränkung in dieser Technik ist die mangelnde Fähigkeit, zwischen Fettsäurearten zu unterscheiden, die über die gleiche Thioesterbindung an Cysteins gebunden sind.

Nach dem oben beschriebenen Protokoll verwendeten wir zunächst Acyl-RAC, um gleichzeitig die S-Acylierung mehrerer Proteine in Jurkat-Zellen zu erkennen, einer verewigten T-Zelllinie, die ursprünglich aus dem peripheren Blut eines T-Zell-Leukämiepatienten abgeleitet wurde27. Regulatorische T-Zellproteine, die zuvor als S-acylatierte9,28,29 identifiziert wurden, wurden ausgewählt, um den Nutzen dieser Meth...

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) ist eine hochempfindliche, zuverlässige und einfach durchzuführende Methode zum Nachweis reversibler Lipidmodifikationen von Cysteinrückständen (S-Acylation) in einer Vielzahl biologischer Proben.

Nachweis der Protein-S-Acylation mit Acyl-Resin Assisted Capture

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

Acyl-resin assisted capture oder Acyl-RAC ist eine empfindliche und zuverlässige Methode, die verwendet werden kann, um Protein-S-Acylation in einer Vielzahl von biologischen Proben zu erkennen. Dieses Protokoll umgeht einige der Einschränkungen der metabolischen Etikettierung und Radiobeschriftung und ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis der S-Acylation mehrerer Proteine. Nicht nur lebende Zellen, sondern auch Primärgewebe und gefrorene Proben.S-Acylation kann eine Vielzahl von zellulären Prozessen regulieren, wie Proteinhandel, Plasmamembran-Targeting, Signaltransduktion, Eisentransport und Protein-Protein-Wechselwirkungen. Es ist wichtig, für jedes Experiment eine frisch zubereitete Hydroxylaminlösung mit sorgfältig angepasstem pH-Wert zu verwenden, um eine effiziente und spezifische Spaltung der Thioesterbindung zu gewährleisten. Bei einer Demonstration dieser Methode ist es entscheidend für Schritte wie Chloroform, Methanolfällung.Das Pfannkuchen-Formpellet, das während dieses Schritts erhalten wird, sollte sehr sorgfältig behandelt werden. Es kann zerbrechlich sein und ein teilhteller Verlust der Probe während des Schritts kann zu einer ungleichmäßigen Probenrückgewinnung führen. Demonstriert wird das Verfahren von Savannah West, einer Doktorandin unseres Labors.Um Zelllysate zu erhalten, sammeln Sie die interessendeckenden Zellen in einem konischen Zentrifugenrohr. Und entfernen Sie alle Zellablagerungen durch Zentrifugation. Waschen Sie das Pellet in 5 Milliliter PBS.Und die Zellen sofort in 600 Mikroliter frisch zubereiteten Lysepuffern wieder aussetzen. Die Probe bei 1.500 Umdrehungen pro Minute in einem Thermoshaker 30 Minuten bei vier Grad Celsius aufstellen. Vor dem Löschen der Lysate, Pelletwaschmittel und lösliches Material durch Zentrifugation.Am Ende der Zentrifugation das gereinigte Lysat in einem vorgekühlten 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr auf Eis sammeln. Und führen Sie einen Bradford- oder Bicinchoninsäure-Assay durch, um die Proteinkonzentration nach Standardprotokollen abzuschätzen. Methanol und Chloroform im Verhältnis 2:1 lysieren.Schütteln Sie rigoros, um eine homogene Suspension zu schaffen und zentrifugieren Sie die Probe, um ein Proteinpellet an der Schnittstelle zwischen den wässrigen und organischen Phasen zu sammeln. Kippen Sie das Rohr, verwenden Sie eine Nadel oder eine Gel-Ladespitze, um so viel Lösungsmittel wie möglich zu aspirieren. Das Proteinpellet für einige Minuten an der Luft trocknen.Vor dem sanften Mischen des Rohrinhalts mit 600 Mikroliter Methanol, achten Sie darauf, das Pellet nicht aufzubrechen. Nach sorgfältigem Entfernen des Methanolwaschens das Proteinpellet auf einer Bankplatte ca. fünf Minuten trocknen. Als nächstes setzen Sie das Proteinpellet in 200 Mikroliter 2SHB-Puffer wieder aus.Und Wirbel bei 42 Grad Celsius und 1.500 Umdrehungen pro Minute in einem Thermo-Shaker. Wenn das Pellet aufgelöst ist, fügen Sie der Probe 200 Mikroliter 0,2%MMTS in 2SHB hinzu. Und das Protein 15 Minuten bei 42 Grad Celsius und 1.500 Umdrehungen pro Minute in einem Thermoshaker inkubieren.Führen Sie am Ende der Inkubation 3:4 Chloroform-Methanol-Fällungen durch, wie gezeigt. Um das MMTS zu entfernen, lösen Sie das Pellet in 100 Mikroliter frischen 2SHB Puffer mit Wirbel. Und verdünnen Sie die Probe mit 300 Mikroliter Puffer A nach jedem Niederschlag.Nach der endgültigen Fällung die Proben in 200 Mikroliter 2SHB-Puffer auflösen und mit 240 Mikroliter Puffer A verdünnen. Messen Sie die Proteinkonzentration erneut und legen Sie 40 Mikroliter aus jeder Probe als Eingangssteuerung beiseite. Teilen Sie Proben in zwei gleiche Volumina von 200 Mikrolitern auf. Und markieren Sie die Tuben als plus Hydroxylamin und MinusHydroxylamin.50 Mikroliter frisch zubereitetes neutrales zwei molares Hydroxylamin zu einer Endkonzentration von 400 Millimolaren in das Plus-Hydroxylamin-Röhrchen geben. Und 50 Mikroliter neutrales zwei molares Natriumchlorid zur Negativkontrolle, ein Minus Hydroxylamin-Rohr. Dann fügen Sie 30 Mikroliter TS Perlenschlämme in jedes Rohr.Und drehen Sie die Rohre für ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Perlen viermal mit 1%SDS in Puffer A, um Resthydroxylamin zu entfernen. Nach der letzten Wäsche alle Perlenproben mit drei sanften einminütigen Mikrozentrifugationen waschen.Sorgfältig die Überstand eisstillieren und die Perlen in 500 Mikroliter 1%SDS in Puffer A bei jeder Wäsche wieder aufhängen. Nach der letzten Wäsche, drehen Sie die Perlen vorsichtig nach unten, wie gezeigt. Und so viel Überstand wie möglich aspirieren, ohne die Perlen zu stören.Um die Proteine aus den Perlen zu gewinnen, fügen Sie 50 Mikroliter 4%SDS-Probenpuffer in jede Röhre und inkubieren die Proben bei 80 Grad Celsius und 1, 500 Umdrehungen pro Minute für 15 Minuten in einem Thermoshaker. Lassen Sie die Proben am Ende der Inkubation abkühlen, bevor Sie zentrieren, um die Perlen vollständig zu pellet. Dann verwenden Sie eine Gel-Ladespitze, um die eluierten Proteine in neue 1,5-Milliliter-Röhren zu übertragen.Und führen Sie die Proben auf einem SDS-PAGE-Gel aus, um die S-Acylation der proteine von Interesse durch Western Blotting zu analysieren. Tyrosinkinase Lck kann in Lysaten nachgewiesen werden, die mit neutralem zwei molarem Hydroxylamin behandelt werden. die Thioesterbindung zwischen Cysteinrückständen und der Fettsäure-Feuchtigkeit zu spalten.und Reprobing mit Antikörpern gegen Proteine Fyn und LAT zeigen, dass Acyl-Harz-unterstützter Capture-Assay verwendet werden kann, um die S-Akylierung mehrerer Proteine gleichzeitig zu analysieren. Darüber hinaus kann die S-Akylierung von Lck, Fyn und LAT in primären Maussplenozyten leicht erkannt werden. Gibt an, dass diese Änderung zwischen zwei Arten konserviert wird.Neben der Identifizierung neuartiger S-acyatierter Proteine kann diese Methode auch zur Beurteilung von Veränderungen der Protein-S-Acylation unter verschiedenen biologischen Bedingungen eingesetzt werden. Die Anzahl der neu identifizierten S-acyatierten Proteine hat enorm zugenommen, nachdem die Verdoppelung eine schnelle und zuverlässige Technik wie Acyl-RAC bedeutete. Neben der Identifizierung neuartiger S-acyatierter Proteine kann diese Methode auch zur Beurteilung von Veränderungen der Protein-S-Acylation unter verschiedenen biologischen Bedingungen eingesetzt werden.

detection-of-protein-s-acylation-using-acyl-resin-assisted-capture

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Capture Compounds sind trifunktionelle kleinen Molekülen, um die Komplexität des Proteoms durch funktionelle reversible kleines Molekül-Protein-Wechselwirkung durch Photo-Vernetzung und Reinigung gefolgt reduzieren. Hier verwenden wir ein Capture Compound...

Profiling von Methyltransferasen und andere S-Adenosyl- L-Homocystein-bindende Proteine ​​von Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

Zelloberflächen-Proteine ​​sind biologisch wichtige und weithin glykosyliert. Wir stellen hier eine Glykopeptid-Capture-Ansatz für einfache LC-MS basierte Proteomanalysen löslich zu machen, zu bereichern, und deglycosylieren diese Proteine.

Glycopeptid-Capture für Zelloberflächen Proteomics

Dieses Protokoll beschreibt die erforderlichen Schritte zur Durchführung von in vitro und in vivo Deacetylierungsassays, um die Rolle von Proteinen als spezifische Deacetylierungssubstrate für Sirtuine zu etablieren und die Rolle der reversiblen Lysinacetylierung als posttranslationale Modifikation weiter zu untersuchen.

Deacetylierung Assays zu entwirren, das Zusammenspiel zwischen Sirtuine (SIRT2) und spezifische Protein-Substrate

Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung von LAP-markierten induzierbaren stabilen Zelllinien zur Untersuchung der Proteinfunktion, der raumzeitlichen subzellulären Lokalisation und der Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke.

Stabile Zelllinien zur Untersuchung von Proteinfunktionen, Spatiotemporal Lokalisierung und Protein Interaction Networks induzierbare LAP-getaggt

Sialinsäure Säure ist eine typische Monosaccharid-Einheit in Glykokonjugate gefunden. Es ist in einer Vielzahl von molekularen und zellulären Interaktionen beteiligt. Hier präsentieren wir eine Methode zur Zelle Oberfläche Sialinsäure Säure Ausdruck mit metabolischen Glykan mit N- Acetylmannosamine Derivate zu ändern.

Metabolische Glykan der Sialinsäure Säure mit N-Acyl-Mannosamines geändert

Untersuchung mehrere, können endogene post-translationalen Modifikationen für ein Zielprotein extrem schwierig sein. Hier beschriebene Techniken nutzen eine optimierte Lyse Puffer und Filter System entwickelt mit spezifischen PTM-targeting, Affinität Matrizen, die Acetylierung, Ubiquitination, Sumoylierung 2/3 und Tyrosin Phosphorylierung Änderungen für ein Ziel zu erkennen Protein mit einem einzigen, gestrafften System.

Nutzung eines umfassenden Immunopräzipitation Bereicherung System um eine endogene Post-translationale Modifikation Profil für Zielproteine zu identifizieren

Hier präsentieren wir objektive Quantifizierung der standortspezifischen Protein Acetylierung und/oder Succinylation Belegung (Stöchiometrie) eine gesamte Proteoms durch eine ratiometrischen Analyse der endogenen Modifikationen, Änderungen, die nach quantitativen chemische Acylation mit stabilen Isotopen-Label Anhydride. In Kombination mit sensiblen Daten-unabhängige Übernahme Massenspektrometrie erhalten Sie genaue Website Belegung Messungen.

Quantifizierung der standortspezifischen Protein Lysin Acetylierung und Succinylation Stöchiometrie mittels Massenspektrometrie Daten-unabhängige Übernahme

Wir präsentieren eine Methode zur Reinigung, Detektion und Identifizierung von diGly Peptiden, die aus ubiquitinierten Proteinen aus komplexen biologischen Proben stammen. Die vorgestellte Methode ist reproduzierbar, robust und übertrifft die veröffentlichten Methoden in Bezug auf den Grad der Tiefe der Ubiquitinom-Analyse.

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

Dieser Workflow beschreibt die Gleichzeitige der zeit- und kosteneffizienten Anreicherung mehrerer Protein-Post-Translational-Modifikationen (PTMs) für die quantitative globale proteomische Analyse. Das Protokoll nutzt ptM-Anreicherung auf Peptidebene mit mehreren konjugierten Antikörpern, gefolgt von einer datenunabhängigen Erfassungsmassenspektrometrieanalyse, um biologische Einblicke in PTM-Übersprechen zu gewinnen.

Gleichzeitige Affinitätsanreicherung von zwei posttranslationalen Modifikationen für Quantifizierung und Standortlokalisierung

Die Untersuchung der Fettacylierung hat wichtige Auswirkungen auf zelluläre Proteininteraktionen und -krankheiten. Hier wird ein modifiziertes Protokoll zur Verbesserung der Klickchemie von fettacylierten Proteinen vorgestellt, das in verschiedenen Zelltypen angewendet und mit anderen Assays, einschließlich Pulse-Chase und Massenspektrometrie, kombiniert werden kann.

Optimierter Einbau von Alkynyl-Fettsäure-Analoga zum Nachweis von fettacylierten Proteinen mittels Klickchemie

Die Proteinthioloxidation hat unter normalen physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen erhebliche Auswirkungen. Wir beschreiben die Details einer quantitativen Redox-Proteomik-Methode, die harzgestützten Einfang, isobare Markierung und Massenspektrometrie verwendet, um eine ortsspezifische Identifizierung und Quantifizierung von reversibel oxidierten Cysteinresten von Proteinen zu ermöglichen.

Harzgestützte Erfassung in Verbindung mit isobarer Tandem-Massenmarkierung für eine multiplexige Quantifizierung der Proteinthioloxidation

Lernen Sie die Acyl-RAC-Methode zur zuverlässigen Detektion von Protein-S-Acylierung in verschiedenen biologischen Proben. Diese Technik ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer Proteine und überwindet die Grenzen herkömmlicher Markierungsverfahren.

Nachweis der Protein-S-Acylation mit Acyl-Resin Assisted Capture

Weitere Videos entdecken