Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay für die spezifische und schnelle Detektion von Tilapia Lake Virus

Das Tilapia-Seevirus ist ein sich abzeichnendes Virus und ansteckende Krankheitserreger, die eine hohe Sterblichkeit in Tilapia und seinen Hybridarten verursachen. Da Tilapia eine Hauptproteinquelle für viele Entwicklungsländer ist, hat die neue Virusinfektion große Auswirkungen auf die Aquakultur in Tilapia und bedroht auch die weltweite Ernährungssicherheit. Die Entwicklung einer schnellen, genauen und empfindlichen Methode zum Nachweis des Virus im Fischgewebe wird der Krankheitsbekämpfung helfen und die Auswirkungen des Virus verringern.

In diesem Video zeigen wir die reverse transkription-Loop-vermittelte isothermale Amplifikation, oder RT-LAMP-Assay, für die schnelle Erkennung des Tilapia-Seevirus in Fischproben. Teil zwei, RNA-Extraktion. Fügen Sie zunächst 3250 Milligramm Lebergewebe in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr, das 600 bis 1000 Mikroliter Säure guanidinium-phenol-Basenreage enthält, und Hackfleisch bis zur Homogenität.

Zentrifugieren Sie bei 10.000 RCF für 30 Sekunden und übertragen Sie den Überstand in ein neues Rohr. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 95% Ethanol in die Röhre und mischen Sie gründlich. Übertragen Sie die Lösung in eine Spin-Säule, in ein Sammelrohr gelegt, dann Zentrifuge bei 10 000 RCF für 30 Sekunden.

Verwerfen Sie den Durchfluss, und übertragen Sie die Spalte in ein neues Sammelrohr. Fügen Sie 400 Mikroliter RNA PreWash in die Spalte und Zentrifuge bei 10.000 RCF für 30 Sekunden hinzu. Verwerfen Sie den Durchfluss, und wiederholen Sie diesen Schritt.

Fügen Sie 700-Mikroliter-RNA-Waschpuffer in die Säule und Zentrifugieren bei 10.000 RCF für zwei Minuten hinzu. Anschließend die Säule in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr geben. Schließlich wird RNA mit einem 100-Mikroliter-, Nuklease-freien Wasser und Zentrifugen bei 10.000 RCF für 30 Sekunden in die Säulenmatrix eingebracht.

Teil 3, Primer-Design. Der PrimerExplorer Version 4 ist das gängigste Bioinformatik-Tool zur Entwicklung effizienter LAMP- oder RT-LAMP-Primer, in dem gute Handbücher für die Software auf ihrer Website verfügbar sind. Hier entstanden vier spezifische Primer, bestehend aus zwei internen und zwei externen Primern, um sechs verschiedene Regionen im Segment 3 von TiLV zu erkennen, aus Thailand.

Nachdem Sie die Website betreten haben, auf der der Link im Video angezeigt wird, klicken Sie auf PrimerExplorer V4. Wählen Sie die Datei aus, die die Sequenz des Segments 3 von TiLV im FASTA-Format enthält, die von der GenBank-Nummer, KX631923 oder tilapia lake virus TV1 Segment 3 abgerufen wurde, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Primer Design. Sobald Sie auf die Schaltfläche Generieren klicken, wird die Software verarbeitet, und die Ergebnisse werden angezeigt. Nach der Optimierung der Sequenzen für die LAMP-Verstärkung wurden insgesamt ein Paar externer Primer und zwei Paare von internen Primern für diese Studie ausgewählt, um die TiLV-Infektion zu erkennen.

Dieser Satz der Primer wird hier gezeigt. Teil 4, Demonstration von RT-LAMP. Der Master-Mix für RT-LAMP-spezifisch für Tilapia SeeVirus, umfasst die folgenden Chemikalien.

Bereiten Sie einen Master-Mix mit den in der Tabelle angegebenen Chemikalien vor. 22 Mikroliter Master-Mix in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr geben. Fügen Sie dann drei Mikroliter RNA-Vorlage in die Reaktionsröhre ein.

Für die Negativkontrolle destilliertes Wasser anstelle von RNA-Materialien verwenden und gut mischen. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 65 Grad Celsius für 60 Minuten, gefolgt von 80 Grad Celsius für 10 Minuten. Nach der Inkubation für 30 Minuten werden die kalorimetrischen Veränderungen visuell mit bloßen Augen beobachtet.

Gegebenenfalls können wir die Ergebnisse des RT-LAMP-Assays bestätigen, indem wir die Gelelektrophorese auf 1,5%Agarose-Gel, das mit einer 100-Volt-Konstante läuft, 40 Minuten lang durchführen, wobei ein Kilobase-Paar molekularer Größe DNA-Leiter als Marker geladen wird, um die Fragmentgröße zu bestimmen. Teil 5, repräsentative Ergebnisse und Interpretation. Nach der Inkubation für 30 Minuten wurde die Kornfluoreszenzreaktion, die auf eine positive Amplifikation von TiLV in Fischgeweben hindeutet, offensichtlich in infizierten Proben unter UV-Licht bei einer Wellenlänge von 365 Nanometern beobachtet, während die der Negativkontrolle eine klare und leicht farblose Lösung hatten.

Entsprechend wurde die Verstärkung von RT-LAMP-Produkten bei der Agarose-Gel-Elektrophorese bestätigt, die verschiedene Größen der mehrfachen Amplifikationen invertierter DNA-Wiederholungen zeigte und in TiLV-infizierten Proben Stammschleifenstrukturen unter UV-Lampen bildete, während in tiLV-infizierten Proben keine Bänder in den Brunnen der Negativkontrolle angezeigt wurden, wobei die Ergebnisse mit denen des RT-LAMP-Tests in Einklang standen. Um die Ausbreitung des Tilapia-Seevirus zu reduzieren, ist ein sofortiges Screening dieser infizierten Fische mit einer effektiv diagnostischen Methode einer der wichtigen Schlüssel. Der neu entwickelte RT-LAMP-Assay sollte daher ein schnelles und sensibles Diagnoseinstrument bieten, das im Prozess der Biosicherheitsmaßnahme eingesetzt werden kann.

Der Test kann entweder im Labor oder in Einrichtungen vor Ort verwendet werden. Wir hoffen, dass die Methode umgesetzt wird, um die Population infizierter Fische zu überprüfen, die zur Verringerung der Ausbreitung des Tilapia-Seevirus führen könnte.