Name: Messung der Echtzeit-Arzneimittelreaktion in organotypischen Tumorgewebescheiben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Erfahren Sie die Messung der Echtzeit-Arzneimittelreaktion in organotypischen Tumorgewebescheiben für die Onkologie. Diese Methode ermöglicht mittleren Durchsatz bei der Arzneimittelprüfung an Patientenproben.

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Diese Arbeit wurde vom NIH/NCI [K22CA201229, P30CA015704] und der Sidney Kimmel Foundation [Kimmel Scholar Award], Lung Cancer Discovery Award (LCD-505536) unterstützt. Wir danken Dr. Alana Welm (University of Utah) für die Bereitstellung des Brustkrebs-PDX-Tumors. Wir danken auch den Mitarbeitern von Comparative Medicine, Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) für die Wartung des PDX-Modells und den Mitgliedern des Gujral-Labors für hilfreiche Diskussionen. N.N.A wird vom JSPS Overseas Research Fellowship und Dem Interdisciplinary Training Grant des FHCRC unterstützt. A.J.B. wird vom Chromosom Metabolism and Cancer Training Grant des FHCRC unterstützt.

Alle Mausexperimente wurden gemäß den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren des Tierschutzgesetzes und der Richtlinien der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Tieren in der biomedizinischen Forschung durchgeführt.
1. Herstellung von Tumorgewebescheiben
<ol><li>Bereiten Sie Gewebescheibenkultur (TSC) Medium nach dem Rezept in Tabelle 1vor. Filtern Sie das Medium mit einer 0,45 m-Vakuumfiltereinheit, um es zu sterilisieren.</li>
	<li>Aliquot 250 l TSC medium pro Well für eine 24 WellPlatte oder 1 ml Medium pro Well für eine 6 Wellplatte. Bewahren Sie die Platte in einem 37 °C, 5%CO2 befeuchteten Inkubator bis zur Verwendung auf. HINWEIS: Das Medium und Ergänzungen können je nach Gewebetypen und experimentellen Zielen optimiert werden. Die Menge des Mediums sollte gerade genug sein, um die poröse Membran eines Kultureinsatzes einzuweichen. Überschreiten Sie nicht den Grad der Membran. Passen Sie das mittlere Volumen an, wenn der mittlere Pegel zu niedrig oder zu hoch ist. Wenn Forscher immunmodulatorische Wirkstoffe testen, empfehlen wir eine Supplementierung des Mediums mit IL-210.</li>
	<li>Wenn Sie von Mäusen gewonnenes Tumorgewebe verwenden, Mäuse mit einem empfohlenen Verfahren einschläfern, die exponierte Haut von Mäusen durch Sprühen von 70% Ethanol desinsieren und Tumore mit aseptischen Techniken sezieren. Bewahren Sie das Tumorgewebe in einer Röhre auf, die eiskalte Hank es Balanced Salt Solution (HBSS) enthält.</li>
	<li>Wenn Sie frisches Tumorgewebe des Patienten verwenden, lagern Sie kurzfristig in eiskaltem HBSS oder in einer eiskalten Lösung der Belzer University of Wisconsin (UW) zur längerfristigen Lagerung (bis zu 24 h), um die Gewebelebensfähigkeit zu erhalten. HINWEIS: Scheiben aus einem PDX-Gewebe, das über Nacht in eiskalter UW-Lösung geliefert wurde, wurden erfolgreich hergestellt.</li>
	<li>Übertragen Sie das Tumorgewebe in eine 10 cm große Kulturplatte, die eiskalte HBSS enthält. Tumor mit einem Skalpell in die Hälfteschneiden schneiden, während er in eiskalteHBSS getaucht ist. Gestalten Sie Tumorgewebe mit einem Biopsie-Punch mit einem Durchmesser von 6 mm in Zylinder und trimmen Sie eine Seite, um eine flache Oberfläche zu schaffen. Bewahren Sie das Gewebe in eiskaltem HBSS bis zur Verwendung auf. ANMERKUNG: Vermeiden Sie die Einbeziehung des nekrotischen Bereichs des Gewebes, der sich in der Regel in der Mitte befindet und ein undurchsichtiges und zerbrechliches Aussehen hat.</li>
	<li>Richten Sie das Vibratome ein. Desinfizieren Sie alle Geräte mit 70% Ethanol. Legen Sie die Vibram-Pufferschale mit einem Acrylglasdeckel in die Mitte des Vibramme-Eisbades. Fügen Sie Eis in das Eisbad und füllen Sie die Pufferschale mit gekühlten HBSS, um das Gewebe beim Schneiden kühl zu halten. Befestigen Sie eine Rasierklinge am Klingenhalter. HINWEIS: Obwohl die Haltung von Vibratomen in einer semisterilen Umgebung keine Auswirkungen auf frühere Experimente hatte, wird empfohlen, das Vibratom unter einem Biosicherheitsschrank zu lagern, falls verfügbar.</li>
	<li>Heben Sie vorsichtig ein biopsiegesgestotes Tumorgewebe aus dem HBSS mit Zahnzangen auf und entfernen Sie überschüssigen Puffer, indem Sie das Gewebe mit einem fusselfreien Papiertuch abwerfen.</li>
	<li>Legen Sie einen Tropfen medizinischer Qualität Cyanoacrylat Kleber auf der Probenplatte und legen Sie das Gewebe auf diesen Tropfen. Den Kleber 2–3 min lufttrocknen und in die Pufferschale legen. Ergänzen Sie mit einigen HBSS, bis das Gewebe vollständig in den Puffer eingetaucht ist. HINWEIS: Die Montage von Geweben in einer aufrechten, stabilen Position ist entscheidend, um gleichmäßig geschnittene Scheiben zu erzeugen. Wenn montierte Gewebe instabil sind, fügen Sie entweder mehr Kleber in das umgebende Gewebe, um eine aufrechte Position zu behalten, oder entladen Sie das Gewebe, glätten Sie den Boden und kleben Sie es wieder. Elastische Gewebe neigen dazu, beim Schneiden leichter geschoben und gebogen zu werden, in diesem Fall können kürzere Längen (&lt;5 mm) und mehrere Durchläufe geeignet sein. Bei extrem zerbrechlichen Geweben können Papiertücher das Gewebe zerstören. In diesem Fall kann das Gewebe auf eine Kunststoffoberfläche gelegt werden, um überschüssige HBSS abzuleiten.</li>
	<li>Passen Sie die Vibratome-Einstellungen an. Es werden folgende Einstellungen verwendet: Schnittdicke = 250 m, Amplitude = 3,00 mm, Schnittgeschwindigkeit = 0,01–0,25 mm/s und Klingenwinkel = 15°–21°. HINWEIS: Optimieren Sie die Schnitteinstellungen in Abhängigkeit von der Steifigkeit des Gewebes. Weichere Gewebe lassen sich leichter mit einem tieferen Klingenwinkel bei geringerer Geschwindigkeit schneiden. Ein Klingenwinkel von 18°, Schnittgeschwindigkeit zwischen 0,10 und 0,18 mm/s und eine Amplitude von 3,00 mm eignet sich gut für Maus-Tumoren 4T1 und PDX HCI010. Steiferes Gewebe kann mit einer schnelleren Klingengeschwindigkeit geschnitten werden.</li>
	<li>Legen Sie die Start- und Endpositionen des Blatts fest, und passen Sie die Höhe der Bühne an. Führen Sie das Gerät mit kontinuierlichem Modus, um Scheiben für mehrere Zyklen zu schneiden, bis das Gewebe gleichmäßig geschnitten werden.</li>
	<li>Setzen Sie das Schneiden des Gewebes fort. Übertragen Sie die Scheiben zusammen mit einer kleinen Menge HBSS-Puffer auf den Zellkultureinsatz mit Medium mit einer Breitspitzen-Transferpipette, mit Saugung, um die gesamte Scheibe zu heben. Legen Sie eine Scheibe pro Einsatz auf eine 24-Well-Platte. Ein Einsatz für 6 Wellplatten kann bis zu vier Scheiben für einen Replizieren aufnehmen. HINWEIS: Wenn die letzte Kante der Gewebescheibe noch am ungeschnittenen Gewebe befestigt ist, stoppen Sie das Vibram und trennen Sie die Gewebescheibe mit zwei Paaren feiner Spitzenzange, ohne die Gewebescheiben zu berühren oder zu stechen. Eine separate Rasierklinge kann bei der Entfernung hängendes Gewebe nützlich sein.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssigen Puffer mit einer feinen Spitze TransferPipette.</li>
	<li>Wenn die Klinge in die Nähe des geklebten Gewebes gelangt, stoppen Sie das Instrument, senken Sie die Bühne, entfernen Sie das versteifte Gewebe mit einer separaten Klinge und montieren Sie ein neues Gewebe. Fahren Sie mit dem Schneiden fort, bis genügend Scheiben gesammelt wurden.</li>
	<li>Die Platten in einem befeuchteten Inkubator auf 37 °C, 5%CO2. Die Gewebescheiben werden an der luft-flüssigen Interphase auf dem Zellkultureinsatz kultiviert. Die Gewebescheiben sind nach der ersten Scheibenvorbereitung 24-48 h für Experimente bereit. Für den langfristigen Anbau, tauschen Sie das Medium alle 2-3 Tage.</li>
</ol>2. Rentabilitätsmessung
<ol><li>Zur Durchführbarkeitsmessung der Gewebescheibe tauschen Sie das Medium nach den Anweisungen des Herstellers mit einem auf Lumineszenz basierenden Reagenzmessreagenz aus, das sowohl Luziferase als auch Prosubstrate bei 1:1.000 Verdünnung im TSC-Medium enthält. Das Reagenz misst die Reduktionsaktivität von lebenden Zellen von metabolisiertem Prosubstrate zu Luziferin11. Übertragen Sie 50 l Enzym-Substrat-Gemisch auf jede Gewebescheibe.</li>
	<li>Inkubieren Sie mit sanfter Erregung auf einem Orbital-Shaker, der sich in einem befeuchteten Inkubator befindet, der auf 37 °C mit 5%CO2 über Nacht eingestellt ist.</li>
	<li>Lumineszierende Signale können entweder mit einem Mikroplattenleser oder einem In-vivo-Bildgebungsinstrument für Gewebe gemessen werden, die in einer 24-Well-Platte kultiviert sind. Um die individuelle Lebensfähigkeit mehrerer Gewebe auf einer 6-Well-Platte zu messen, sollte ein In-vivo-Bildgebungssystem verwendet werden.<ol>
<li>Wenn Sie einen Mikroplattenleser verwenden, stellen Sie die Mikroplatte ohne Deckel ein. Jede Art von Mikroplattenleser, die in der Lage sind, die Leuchtintensität zu messen, sollte für das Experiment geeignet sein. Wir haben die folgenden Einstellungen verwendet: Lesezeit = 1 s, Messung von oben, Verstärkung = 200. HINWEIS: Für eine höhere Genauigkeit verwenden Sie eine Weißwand-Mikroplatte, um das Experiment einzurichten. Weißwandige, klare 24 Brunnenplatten wurden getestet, und in den meisten Fällen gefährden klare Brunnenplatten die Ergebnisse nicht.</li>
		<li>Wenn Sie ein In-vivo-Bildgebungssystem verwenden, um die Lebensfähigkeit zu messen, legen Sie die Platte in die Mitte der Bühne und entfernen Sie den Deckel. Erfassen Sie normale fotografische Bilder, gefolgt von Leuchtbildern mit einem Feld der Bühneneinstellung bei C, Autobelichtungszeit, f-Stop = 1, Objektiveinstellung als Mikroplatte mit Motivhöhe = 0,0 cm.</li>
		<li>Quantifizieren Sie die Lumineszenzintensität mit der Bildgebungssoftware, die mit dem in vivo Bildgebungssystem begleitet wird. Zeichnen Sie konsistente Bereiche von Interesse (ROI) um jede Gewebescheibe. Dieses Protokoll verwendet einen Kreis mit einem Durchmesser von 1 cm als ROI (siehe Abbildung 1). Messen Sie den Gesamtfluss (p/s) der Fläche.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Bewertung der Arzneimittelwirkung auf die Gewebescheiben
<ol><li>Messen Sie die Grundlebensfähigkeit vor der Behandlung mit dem in Abschnitt 2 erläuterten Aufleinenmessungsreagenz. HINWEIS: Wenn mehrere Gewebe eine signifikant geringere Lebensfähigkeit im Vergleich zu anderen haben, lassen Sie das Gewebe aus dem Test weg.</li>
	<li>Lösen Sie Medikamente in Dimethylsulfoxid (DMSO), um Lagerlösungen herzustellen. Bereiten Sie eine 10-fache Arzneimittellösung mit TSC oder einem anderen Kulturmedium (25 l/well für eine 24-Well-Platte mit einem Medium von 250 l) in den gewünschten Konzentrationen vor. Bereiten Sie für die Fahrzeugsteuerung ein Medium vor, das ein entsprechendes Volumen von DMSO enthält.</li>
	<li>Ergänzen Sie die 10x Drogenlösung zum Kulturmedium am unteren Ende des Brunnens. Mischen Sie durch Pipettieren und übertragen Sie 50 l des Mediums auf das Gewebe. HINWEIS: Wenn mehrere Gewebescheiben verfügbar sind, testen Sie Duplikate oder Triplicate für jede Bedingung.</li>
	<li>Über Nacht mit sanftem Schütteln auf einem Orbital-Shaker in einem 37 °C, 5%CO2,befeuchtetem Inkubator inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Platte vom Shaker und inkubieren Sie statisch im 37 °C, 5%CO2, befeuchteten Inkubator.</li>
	<li>Messen Sie zu den gewünschten Zeitpunkten die Lumineszenzintensität aus dem Gewebe mit einem Mikroplattenleser oder einem In-vivo-Bildgebungssystem. In der Regel werden Arzneimittelwirkungen nach 1-6 Tagen der Behandlung nachweisbar. HINWEIS: Das auf Lumineszenz basierende Reagenzreagenz ist unter Kulturbedingungen mindestens 3 Tage stabil. Allerdings kann das Substrat während des Testes je nach metabolischer Aktivität des Gewebes erschöpft sein. Wenn ein signifikanter Signalabfall in Geweben mit zuvor hohen Signalen beobachtet wird, ergänzen Sie das Substrat in allen Brunnen.</li>
	<li>Berechnen Sie die verbleibende Lebensfähigkeit der behandelten Tumorgewebe mit der folgenden Gleichung: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61036/61036eq1v2.jpg"> Die Lebensfähigkeit des behandelten Gewebes wird durch seine Ausgangslebensfähigkeit und Lebensfähigkeitsverschiebung von Kontrolltumorgeweben normalisiert.</li>
</ol>

<ol><li>Klemm, F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+therapeutic+response+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer.</a> Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).</li>
<li>Horvath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+out+irrelevant+cell-based+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Screening out irrelevant cell-based models of disease.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).</li>
<li>Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failures+in+Phase+III%3A+Causes+and+Consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Failures in Phase III: Causes and Consequences.</a> Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+approaches+to+study+cell-cell+interactions+in+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment.</a> Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).</li>
<li>van der Kuip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> BMC Cancer. 6, 86(2006).</li>
<li>Nagaraj, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+Analysis+of+Tumor+Slice+Explants+As+a+Prerequisite+for+Diagnostic+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58569(2018).</li>
<li>Naipal, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+slice+culture+system+to+assess+drug+response+of+primary+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer.</a> BMC Cancer. 16, 78(2016).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+slice+cultures+enable+precise+study+of+the+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment.</a> Oncoimmunology. 6 (7), 1333210(2017).</li>
<li>Sivakumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+tumor+slice+cultures+provide+a+versatile+platform+for+immuno-oncology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery.</a> Oncoimmunology. 8 (12), 1670019(2019).</li>
<li>Duellman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Cell+Viability+Assay+and+Use+in+Inhibitor+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li>
<li>Lazaro, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment%2C+characterization%2C+and+long-term+maintenance+of+cultures+of+human+fetal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes.</a> Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).</li>
<li>Chadwick, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brain+Tumor%2FOrganotypic+Slice+Co-culture+System+for+Studying+Tumor+Microenvironment+and+Targeted+Drug+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53304(2015).</li>
<li>Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Glioblastoma+Organotypic+Slice+Culture+Model+for+Study+of+Tumor+Cell+Migration+and+Patient-specific+Effects+of+Anti-Invasive+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53304(2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

In diesem Protokoll zeigen wir eine Plattform für quantitative und Echtzeit-Arzneimittelwirksamkeitsstudien an organotypischen Tumorgewebescheiben. Das Gewebescheibenkultursystem bietet deutliche Vorteile gegenüber herkömmlichen zellbasierten In-vitro-Methoden, indem es die Zellheterogenität und die physiologischen Eigenschaften der nativen Tumormikroumgebung erfasst. Diese Plattform ermöglicht auch einen höheren Durchsatz für Arzneimittelwirksamkeitstests und hilft dabei, die Lücke zwischen Zellkulturstudien und In-vivo...

Krebszellwechselwirkungen mit den physikalischen und biochemischen Eigenschaften des umgebenden Stromalgewebes bilden das TME. TME kann Tumorwachstum stimulieren, Metastasen und modulieren Tumorreaktion auf Therapie1. In der konventionellen präklinischen Arzneimittelentwicklung werden Arzneimittelkandidaten in der Regel zuerst mit kultivierten Krebszelllinien gescreent, einer Assay-Plattform, der die TME2kritisch fehlt. Dieser Mangel an physiologischem TME in zellbasierten Vorscreening-Stadien kann die Entdeckung wirksamer Wirkstoffe in tumortragenden Tiermodellen einschränken und zur hohen Zermürbungsrate vieler vielversprechender Onkologie-Medikamente in späteren klinischen Entwicklungsstadien beitragen3.
Trotz der Bedeutung von TME bei der Modulation von Tumormedikamentenreaktionen schränken experimentelle Zwänge die Anwendung physiologisch relevanterer Systeme in den frühen Stadien der Arzneimittelentdeckung und -entwicklung ein. Es ist unpraktisch, Hunderte von therapeutischen Wirkstoffen auf Tumore von Tiermodellen oder Patiententumorproben zu überprüfen. Tatsächlich sind chirurgische Proben knappe Ressourcen mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund, und das Screening von Tausenden von Kandidatenmolekülen in Tiermodellen ist aufgrund von experimentellem Umfang, Kosten und Tierschutz nicht machbar.
Tumorgewebe-Scheibenkultur, wo präzise geschnittene, dünne Tumorabschnitte ex vivo kultiviert werden, kann die Begrenzung der physiologischen TME in Medikamenten-Screening-Assays angehen. Historisch gesehen, der Bereich der Neurowissenschaften Pionier und machte umfangreiche Optimierungen der Schnittkultur für Gehirngewebe4. In jüngster Zeit haben viele Studien die Vorbereitung von Scheiben aus verschiedenen Arten von Tumorgewebe gezeigt, einschließlich zelllinienabgeleiteter Tumoren, spontaner Tumormodelle, von Patienten abgeleiteter Xenografts (PDX) und Primärpatiententumoren. Ex-vivo-Gewebeschnittkultur integriert Vorteile sowohl von in vivo als auch von in vitro Kultur5. Tumorgewebescheiben behalten intakte Gewebearchitektur und vielfältige Zellzusammensetzung, was die Untersuchung von Krebszellen im TME-Kontext ermöglicht.
Dieses Protokoll führt ein organotypisches Tumorgewebe-Slice-Kultursystem in Kombination mit einem Echtzeit-, hochsensiblen Lebensfähigkeitstest ein, um Arzneimittelreaktionen zu bewerten. Arzneimittelwirksamkeitstests an organotypischen Tumorgewebescheiben in zuvor eingeführten Protokollen beruhen auf der Messung von Veränderungen der Zelllebensfähigkeit durch Fluoreszenzfarbstoff-Inkorporation, Immunhistochemie (IHC) oder MTT ((3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 Diphenyltetrazoliumbromid) Assay6,7,8,9. Alle diese Methoden sind Jedoch Endpunkt-Assays und leiden unter geringer Empfindlichkeit, langer Verarbeitungszeit, komplexen Datenanalysen, einem engen Signalbereich und hohem experimentellen Fehler. Unser auf Lumineszenz basierendes, zellkompatibles Reagenz verbessert diese Tests, indem es einen breiten Signalbereich und eine sofortige Messung (ca. 5 min) ohne vorherige Verarbeitung und minimale Nachbearbeitung bietet. Dieses Reagenz ist hochempfindlich und kann in den Zellkulturmedien koexistieren, was eine kontinuierliche und zeitliche Messung der Zelllebensfähigkeit ermöglicht. Dieses Assay-System ist anwendbar auf Daspereder präputiert es bei der präklinischen Arzneimittelentwicklung auf Gewebescheiben.

<table><tbody><tr><td>10-cm-Schale</td><td>Corning</td><td>430293</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Schale</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7524</td><td></td></tr><tr><td>4T1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>Biopsie-Stanze mit 6 mm Durchmesser</td><td>Integra Miltex</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960-5g</td><td>Für TSC mittel</td></tr><tr><td>Belzer UW Kühlhauslösung (UW-Lösung)</td><td>Bridge to Life</td><td>500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Membrane</td><td>Mix Fisher</td><td>wissenschaftliche 356234</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Corning</td><td>MT-25950CQC</td><td></td></tr><tr><td>Doppelschneidige Edelstahl-Schneidklingen</td><td>TED PELLA</td><td>121-6</td><td>Zum Schneiden von</td></tr><tr><td>Doxorubicin (Hydrochlorid)</td><td>Cayman Chemical</td><td>15007</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Zange mit feiner Spitze</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4974</td><td></td></tr><tr><td>Zange mit feiner Spitze</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767-500g</td><td>Für TSC Medium</td></tr><tr><td>HBSS ohne Calcium, Magnesium oder Phenol Rot</td><td>Gibco</td><td>14-175-103</td><td></td></tr><tr><td>HCI010</td><td>Dr. Alana Welm, University of Utah</td><td>Brustkrebs PDX</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Puffer Lösung</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Für TSC Medium</td></tr><tr><td>ITS + Premix</td><td>Fisher Scientific</td><td>354352</td><td>Für TSC Medium</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Leica VT1200S Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>Für TSC Medium</td></tr><tr><td>Millicell Zellkultureinsatz, 12 mm, hydrophiles PTFE, 0,4 & Mikro; m</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Millicell Zellkultureinsatz, 30 mm, hydrophiles PTFE, 0,4 & Mikro; m</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-500g</td><td>Für TSC Medium</td></tr><tr><td>PELCO Pro CA44 Tissue Adhesive</td><td>TED PELLA</td><td>10033</td><td>Glue</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140163</td><td>Für TSC Medium</td></tr><tr><td>RealTime-Glo MT Cell Viability Assay</td><td>Promega</td><td>G9711</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante Maus EGF</td><td>BioLegend</td><td>585608</td><td>Für TSC Medium</td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875135</td><td></td></tr><tr><td>Single Edge Industrial Razor Blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Zum Entfernen von verklebtem Gewebe</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Corning</td><td>25-035-CI</td><td>Für TSC Medium</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Fisher Wissenschaftliche</td><td>BW13115E</td><td>Für TSC Medium</td></tr><tr><td>Staurosporin</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-3510A</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tooothed Pinzette</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5155</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipetten</td><td>Fisher scientific</td><td>13-711-7M</td><td>Breite Spitze</td></tr><tr><td>Transferpipetten</td><td>Samco Scientific</td><td>235</td><td>Feine Spitze</td></tr><tr><td>William's Medium E, ohne Glutamin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12551032</td><td>für TSC-Medium</td></tr></tbody></table>

messung der echtzeit-arzneimittelreaktion in organotypischen tumorgewebescheiben

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Tumorgewebe bestehen aus Krebszellen, infiltrierten Immunzellen, Endothelzellen, Fibroblasten und extrazellulärer Matrix. Dieses komplexe Milieu bildet die Tumormikroumgebung (TME) und kann die Reaktion auf Therapie in vivo oder Arzneimittelreaktion ex vivo modulieren. Herkömmliche Krebsmedikamenten-Entdeckungs-Screens werden an Zellen durchgeführt, die in einer Monoschicht kultiviert werden, einem System, das den Einfluss von TME kritisch vermisst. So stärken experimentelle Systeme, die empfindliche und hochdurchsatzige Assays mit physiologischem TME integrieren, den präklinischen Wirkstoffentdeckungsprozess. Hier führen wir ex vivo Tumorgewebescheibenkultur als Plattform für das Mittel-Hochdurchsatz-Medikamentenscreening ein. Organotypische Gewebescheibenkultur stellt präzise geschnittene, dünne Tumorabschnitte dar, die mit Unterstützung einer porösen Membran in einer Flüssigkeits-Luft-Schnittstelle gepflegt werden. In diesem Protokoll beschreiben wir die Herstellung und Wartung von Gewebescheiben, die aus Maustumoren und Tumoren aus patientenabgeleiteten Xenograft-Modellen (PDX) hergestellt werden. Um Veränderungen der Gewebelebensfähigkeit als Reaktion auf die medikamentöse Behandlung zu bewerten, haben wir einen biokompatiblen Lumineszenz-basierten Lebensfähigkeitstest genutzt, der eine Echtzeit-, schnelle und empfindliche Messung lebensfähiger Zellen im Gewebe ermöglicht. Mit dieser Plattform evaluierten wir dosisabhängige Reaktionen von Gewebescheiben auf den Multikinase-Inhibitor, Staurosporin und das zytotoxische Mittel Doxorubicin. Darüber hinaus zeigen wir die Anwendung von Gewebescheiben für die Ex-vivo-Pharmakologie, indem wir 17 klinische und präklinische Medikamente auf Gewebescheiben untersuchen, die aus einem einzelnen PDX-Tumor hergestellt werden. Unsere physiologisch relevante, hochempfindliche und robuste Ex-vivo-Screening-Plattform wird die Entdeckung und Entscheidungsfindung von präklinischen Onkologie-Medikamenten erheblich stärken.

Hier zeigen wir ein Zeit-Kurs, multiple Drug Efficacy Evaluation Protocol für TumorgewebeScheiben aus Maus 4T1 Brusttumorgewebe und ein Brustkrebs PDX Modell, HCI01012. Wir haben erfolgreich Gewebescheiben aus mehreren mausabgeleiteten Tumoren, PDX und frischen Patiententumoren10vorbereitet. Der gesamte Arbeitsablauf des Tumorgewebepräparats und des Arzneimittelwirksamkeitstests ist in Abbildung 1beschrieben. Im Allgemeinen konnten wir 20–40 Ge...

Wir führen ein Protokoll zur Messung der Echtzeit-Arzneimittelreaktion in organotypischen Tumorgewebescheiben ein. Die hier skizzierte experimentelle Strategie bietet eine Plattform, um mittelhohe Durchsatz-Medikamenten-Screens auf Gewebescheiben durchzuführen, die aus klinischen oder Maustumoren unter ex vivo-Bedingungen abgeleitet werden.

Messung der Echtzeit-Arzneimittelreaktion in organotypischen Tumorgewebescheiben

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

Unser Protokoll ist mit anderen molekularen Analysemethoden kompatibel und ermöglicht die Beurteilung, wie Medikamente die Lebensfähigkeit von in-Takt-Gewebescheiben und die Leistung eines mittleren Durchsatz-Screenings beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass wir die Lebensfähigkeit einer ganzen Gewebescheibe in Echtzeit mit sehr wenig Vor- oder Nachbearbeitung messen können. Diese Technik beschleunigt die präklinische Arzneimittelentwicklung und Onkologie, indem sie Wirkstoffkandidaten oder Gewebescheiben testet, die direkt aus Tumorgewebeproben von Patienten erworben wurden.Unsere Echtzeit-Methode zur Beurteilung der Gewebelebensfähigkeit ist sehr vielseitig und kann auf Krebsbiologie-, Neurowissenschaften und Entwicklungsbiologie-Studien angewendet werden. Die Vorbereitung von in-taktfähigen, lebensfähigen Gewebescheiben ist der Schlüssel zum Erfolg des Verfahrens. Die Vibratome-Einstellungen in mittlerer Zusammensetzung sollten je nach Gewebetyp und Festigkeit angepasst werden.Am Tag der Tumorgewebescheibenerfassung, aliquot 250 Mikroliter Gewebescheibenkultur medium pro Brunnen in einer 24 Brunnenplatte und legen Sie einen Gewebekultureinsatz in jeden Brunnen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Quelle: Ciraku, L., et. al. Ein Ex-vivo-Hirnschnittmodell zur Untersuchung und gezielten Bestimmung des Wachstums von Hirnmetastasen bei Brustkrebs. J. Vis. exp. (2021). Dieses Video zeigt die Bildgebung von Luciferase-exprimierenden Tumorzellen in einem organotypischen Maushirnschnitt. Luciferin wird dem Medium zugesetzt, und die Platte wird in die Kammer des In-vivo-Bildgebungssystems gelegt. Die Parameter für die Bilderfassung werden angepasst und die Form und Größe des Tumors definiert.

Biolumineszenz-Bildgebung zur Beurteilung des Tumorwachstums in einem organotypischen Maus-Hirnschnitt

Die organotypischen Hirnschnitt Co-Kultur mit Karzinomzellen ermöglicht die Visualisierung morphologische Veränderungen durch Fluoreszenz sowie Hellfeld-(Video)-Mikroskopie während des Prozesses der Karzinomzellinvasion von Hirngewebe. Dieses Modellsystem ermöglicht auch für die Zellaustausch und die Wiederauffüllung Ansätze und bietet eine Vielzahl von Manipulationen und Analysen.

Co-Kultur-System mit einer Scheibe Organotypische Gehirn-und 3D-Sphäroid von Karzinomzellen

Viele Arten von menschlichen Hirntumoren sind auf bestimmte Regionen innerhalb des Gehirns beschränkt und in Kultur schwer zu züchten. Dieses Protokoll befasst sich mit der Rolle der Tumormikroumgebung und untersucht neue medikamentöse Behandlungen durch die Analyse fluoreszierender primärer Hirntumorzellen, die in einem organotypischen Maushirnschnitt wachsen.

Ein Hirntumor / Organotypischen Co-Kultursystem für die Untersuchung Tumor-Microenvironment und gezielte Arzneimitteltherapie

Aktuelle Ex-vivo- Modelle von Glioblastom (GBM) sind nicht für eine physiologisch relevante Untersuchung der menschlichen Tumorinvasion optimiert. Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung und Pflege von organotypischen Scheibenkulturen aus frischem menschlichem GBM-Gewebe vor. Es wird eine Beschreibung der Zeitraffer-Mikroskopie und der quantitativen Zellmigrationsanalyse-Techniken gegeben.

Ein menschliches Glioblastom Organotypisches Scheibenkulturmodell zur Untersuchung der Tumorzellmigration und patientenspezifischen Wirkungen von antiinvasiven Arzneimitteln

Wir stellen eine Methode zur Energieerzeugung, Anbau und systematische Analyse der organotypischen Scheiben aus murinen Lungentumoren abgeleitet. Wir beschreiben auch für Scheibendicke optimieren und das Medikament Konzentrationen zur Behandlung von Tumor-Scheiben auswählen.

Einrichtung und Analyse der Tumor Slice Explants als Voraussetzung für diagnostische Tests

Dieses Protokoll beschreibt die Aufbereitung von organotypischen Schnittkulturen (OTSCs). Diese Technik ermöglicht die ex vivo-Kultivierung von intaktem mehrzelligem Gewebe. OTSCs können sofort eingesetzt werden, um ihr jeweiliges Ansprechen auf Medikamente in einer multizellulären Umgebung zu testen.

Organotypische Schnittkulturen als präklinische Modelle der Tumormikroumgebung bei primärem Pankreaskarzinom und Metastasierung

Dieses Protokoll beschreibt eine halbautomatische Methode für Organoid-Wirkstoff-Screenings mit mittlerem bis hohem Durchsatz und mikroskopunabhängige, automatisierte Bildanalysesoftware zur Quantifizierung und Visualisierung multiparametrischer, einzelorganoider Arzneimittelreaktionen zur Erfassung der intratumoralen Heterogenität.

Multiparametrisches Tumor-Organoid-Wirkstoff-Screening mit Weitfeld-Live-Cell-Imaging für die Bulk- und Einzelorganoid-Analyse

Wir beschreiben ein Protokoll für die Herstellung, Kultivierung und Visualisierung von menschlichen Krebserkrankungen, die Metastasen in die Peritonealoberflächen gebildet haben. Resezierte Tumorproben werden mit einem Vibratom geschnitten und auf permeablen Einsätzen kultiviert, um die Sauerstoffversorgung und Viabilität zu erhöhen, gefolgt von Bildgebung und nachgeschalteten Analysen mittels konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie.

Kultivierung und Bildgebung von ex vivo organotypischen Pseudomyxoma-Peritonei-Tumorschnitten aus resezierten humanen Tumorproben

Patient-Derived Tumor Organoids sind ein ausgeklügeltes Modellsystem für die Grundlagen- und translationale Forschung. Dieser Methodenartikel beschreibt die Verwendung von Multiplex-Fluoreszenz-Lebendzell-Imaging zur gleichzeitigen kinetischen Beurteilung verschiedener Organoid-Phänotypen.

Multiplex-Lebendzell-Bildgebung für das Ansprechen auf Medikamente in patientenabgeleiteten Organoidmodellen von Krebs

Wir stellen ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die hochauflösende, markierungsfreie und dreidimensionale Bildgebung von Organoiden mittels Low-Coherence-Holotomographie vor. Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung von Organoidkulturen, die Aufnahme von Bildern und die computergestützte Bildanalyse und ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung der strukturellen Dynamik und des Wirkstoffansprechens in lebenden Organoiden.

Markierungsfreie, hochauflösende 3D-Bildgebung und maschinelle Lernanalyse von Darmorganoiden mittels Low-Coherence-Holotomographie

Erfahren Sie die Messung der Echtzeit-Arzneimittelreaktion in organotypischen Tumorgewebescheiben für die Onkologie. Diese Methode ermöglicht mittleren Durchsatz bei der Arzneimittelprüfung an Patientenproben.

Messung der Echtzeit-Arzneimittelreaktion in organotypischen Tumorgewebescheiben

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