Quantifizierung der menschlichen Norovirus-Virus-ähnlichen Partikelbindung an commensale Bakterien mittels Durchflusszytometrie

Ziel dieses Protokolls ist es, die Bindung des eukaryotischen Erregers humanes Norovirus an Bakterien zu quantifizieren. Nach der Durchführung eines ersten Virus-Bakterium-Anhang-Assays wird die Durchflusszytometrie verwendet, um viral gebundene Bakterien in der Population zu erkennen.

Virusbakterielle Wechselwirkungen können für eine erfolgreiche Virusinfektion und Stimulation einer Wirtsimmunantwort wichtig sein. Aber derzeit können hochkonzentrierte und gereinigte Bestände an humanem Norovirus nicht im Labor produziert werden. Diese Technik kann mit jedem Virus verwendet werden, der an Bakterien bindet, für die entweder virusähnliche Partikel oder lebende Viren zur Verfügung stehen.

Es ermöglicht uns, Wechselwirkungen zwischen diesen Viren und Bakterien zu quantifizieren. Impfen Sie fünf Milliliter flüssiges Medium mit einer einzigen isolierten Kolonie Enterobacter Cloacae von einer Agarplatte direkt aus gefrorenem Glycerinbestand. Wachsen Sie die Bakterien über Nacht.

Am nächsten Tag 1,3 Milliliter Aliquots der Kultur in zwei separate 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhren übertragen. Zentrifugieren Sie die Rohre fünf Minuten lang bei 10.000 x g. Entfernen Sie die Überräube, und waschen Sie die Proben dann zweimal mit einem Milliliter steriler 1X PBS für jede Wäsche.

Zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang wieder bei 10.000 x g. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1,3 Milliliter steriler 1X PBS wieder auf. Beginnend mit 0,5 Milliliter gewaschener Kultur, verdünnen Sie die Bakterien in 1X PBS von 10 auf minus eins bis 10 bis minus vier.

Messen Sie mit einem Spektralphotometer die optische Dichte der gewaschenen unverdünnten Kultur und jede der vier Verdünnungen bei 600 Nanometern. Führen Sie 10-fache serielle Verdünnungen in 1X PBS für jede der vorherigen Verdünnungen durch. Verteilen Sie 100 Mikroliter der letzten drei Verdünnungen für jede Serie auf Agarplatten, um die Anzahl der koloniebildenden Einheiten pro Milliliter pro Probe zu bestimmen.

Lassen Sie die Platten bei Raumtemperatur fünf Minuten trocknen. Invertieren Sie die Platten und inkubieren Sie sie im Inkubator. Nach der Herstellung der Reagenzien, Antikörper und Bakterien, wie im Manuskript beschrieben, montieren Sie alle Materialien in einem BSL-2 Biosicherheitsschrank.

Virusähnliche Partikel für humane Noroviren sind als BSL-2-Erreger gelistet, und alle Arbeiten, die mit VLP durchgeführt werden, sollten in einem zertifizierten Biosicherheitsschrank durchgeführt werden. Fügen Sie 10 Mikrogramm menschliche Norovirus-VLPs zu jeder Röhre von Bakterien hinzu und mischen Sie sie gründlich durch Pipettieren. Inkubieren Sie die Rohre für eine Stunde bei 37 Grad Celsius mit konstanter Rotation.

Zentrifugieren Sie die Rohre nach der Inkubation fünf Minuten lang bei 10.000 x g. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das bakterielle Pellet in einem Milliliter PBS wieder auf. Nachdem Sie die Waschschritte einmal wiederholt haben, zentrieren Sie die Rohre fünf Minuten lang wieder bei 10.000 X g.

Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das VLP-Bakterienpellet in 150 Mikroliter5%Sperrpuffer wieder aus. Ein häufiger Fehler, der auftritt, ist, dass Rohre ausgetauscht werden und die falsche Behandlung hinzugefügt wird. Um dies zu verhindern, ordnen Sie alle Rohre in Linien an, die der richtigen Behandlung entsprechen, und fügen Sie den Röhren eine Behandlung auf einmal hinzu.

Für jede bakterielle Probe 50 Mikroliter verdünnter humaner Norovirus-GII-Antikörper zubereiten. Verdünnen Sie den Antikörper mit 5% Blockierpuffer 1 bis 125 für E.cloacae-Proben. Bereiten Sie 50 Mikroliter verdünnten Isotyp-Antikörpers für jede Bakterielle Probe mit den gleichen Verdünnungsverhältnissen vor.

Teilen Sie jede Befestigungsprobe in 350 Mikroliter-Aliquots auf, indem Sie sie in saubere 1,5 Milliliter Zentrifugenrohre übertragen. Um ungefärbte Steuerelemente zu erstellen, fügen Sie dem ersten Aliquot aus jeder Bakterienprobe 50 Mikroliter Blockierpuffer hinzu. Für die gefärbten Proben 50 Mikroliter der GII-Antikörperverdünnung zu dem zweiten Satz von Aliquots hinzufügen.

Erstellen Sie die Isotyp-Steuerelemente, indem Sie 50 Mikroliter des verdünnten Isotyp-Antikörpers zu dem dritten Satz von Aliquots hinzufügen. Alle Proben auf Eis und im Dunkeln 30 Minuten lang bebrüten. Dann zentrifugieren Sie alle Proben bei 10.000 X g für fünf Minuten.

Entsorgen Sie die Überräube und setzen Sie jede Probe in 150 Mikroliter FCSB wieder aus. Wiederum Zentrifugieren Sie alle Proben bei 10.000 X g für fünf Minuten. Verwerfen Sie erneut die Überräube und setzen Sie die Proben in 100 Mikroliter FCSB wieder aus.

Nachdem Sie die Proben ein letztes Mal zentrifugiert und die Überstande entsorgt haben, setzen Sie die Proben in 150 Mikroliter FCSB wieder aus. Übertragen Sie jede Probe in ein Rohr mit 400 Mikroliter FCSB für ein Gesamtvolumen von 550 Mikrolitern. Bewahren Sie die Proben bei 4 Grad Celsius auf, bis sie durch Durchflusszytometrie analysiert werden.

Die VLP-Befestigung wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen. Zuerst wurden Dichtediagramme verwendet, um zelluläre Trümmer auszukleben, gefolgt von nachfolgenden Punktdiagramm-Gating, um bakterielle Doublets und Zellklumpen zu entfernen. Repräsentative Histogramme zeigen einen Mangel an PE-Signal in bakteriellen Proben und eine Verschiebung der PE-Signalintensität in VLP:Bakteriumproben im Vergleich zu ungefärbten und Isotyp-Kontrollen.

Nach einer Stunde Inkubation mit 10 Mikrogramm VLP wurde die Durchflusszytometrie partikelbindend an E.colacae und L.gasseri nachgewiesen. Um die Grenze der Bindungsquantifizierung für diesen Test zu bestimmen, wurde vor der Zugabe zu den Bakterien eine Verdünnungsreihe der VLPs erzeugt. Die Verringerung der VLP-Menge führte zu entsprechenden Reduktionen der durch VLP gebundenen Prozentbakterien.

Das Virus:Bakterium-Verhältnis zu kennen und das Verhältnis zwischen den Experimenten konsistent zu halten, ist wichtig für die Interpretation der Ergebnisse. Bakterielle und virale Mutanten können erzeugt werden, um gezielt die mikrobiellen Oberflächenstrukturen zu bestimmen, die diese Wechselwirkung vermitteln. Diese Technik ermöglicht es Forschern, Fragen zu Umständen und Bedingungen zu beantworten, die Norovirus-Bakterien-Wechselwirkungen beeinflussen, einschließlich, wie Veränderungen des Virusgenotyps, bakterielle Wachstumsbedingungen und Veränderungen in bakteriellen Oberflächenstrukturen die virale Bindung verändern.