Name: Ein Electrochemilumineszenz-basierter Assay für MeCP2-Proteinvarianten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Erfahren Sie die elektrochemilumineszenzbasierte Quantifizierung von MeCP2-Proteinvarianten in einer 96-Well-Platte. Diese Methode bietet höhere Sensitivität und Reproduzierbarkeit als Western Blot und ELISA für die Neurowissenschaft.

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Wir danken Dr. Brigitte Sturm für ihre Unterstützung beim ECLIA-Instrument.

Die Zulassung für die Beschaffung von Hautbiopsien zu Forschungszwecken wurde von der Human Research Ethics Committee of the Children es Hospital in Westmead, Australien, eingeholt. Die Zustimmung zu Tierversuchen erhielt das Bundesministerium für Wissenschaft, Forschung und Wirtschaft, die nach den örtlichen Tierschutzbestimmungen durchgeführt wurden (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
ANMERKUNG: Das Prinzip des ECLIA-Systems ist in Abbildung 1dargestellt.
1. Antikörperauswahl
<ol><li>Bewerten Sie das Signal-Rausch-Verhältnis für eine Reihe von verschiedenen MeCP2-Antikörpern und identifizieren Sie die beste Signalstärke und höchste Spezifität in der Kombination eines primären monoklonalen MeCP2-Antikörpers (Klon Mec-168) und eines polyklonalen MeCP2-Detektionsantikörpers (kundenspezifisch). Verwenden Sie für den sekundären Antikörper einen systemspezifischen Antikörper (Materialtabelle), der ebenfalls experimentell verifiziert wurde. HINWEIS: Tabelle 1 gibt einen Überblick über alle nachgewiesenen Antikörper während der MeCP2-ECLIA-Entwicklung und deren getestete Verdünnungsbereiche.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Funktion</td>
			<td>Namen</td>
			<td>Klon</td>
			<td>Verdünnung</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primäre</td>
			<td>Maus, anti-MeCP2</td>
			<td>Mec-168</td>
			<td>1:500 bis 1:10.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primäre</td>
			<td>Maus, anti-MeCP2</td>
			<td>4B6</td>
			<td>1:250 bis 1:4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primäre</td>
			<td>Maus, anti-MeCP2</td>
			<td>Herren-8</td>
			<td>1:500 bis 1:4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primäre</td>
			<td>Maus, anti-MeCP2</td>
			<td>1B11</td>
			<td>1:500 bis 1:4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primäre</td>
			<td>Kaninchen, anti-MeCP2</td>
			<td>D4F3</td>
			<td>1:500 bis 1:4.000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sekundären</td>
			<td>Kaninchen, anti-MeCP2</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>1:2,000 bis 1:20,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sekundären</td>
			<td>Kaninchen, anti-MeCP2</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>1:2,000 bis 1:20,000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Erkennung</td>
			<td>SULFO-TAG gekennzeichnet Anti-Kaninchen</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>1:500 bis 1:1.000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Liste der Antikörper und der verwendeten Arbeitsverdünnungen.
<ol start="2"><li>Alternativ können Sie jedes Paar MeCP2-Antikörper verwenden, das gut mit herkömmlichem ELISA funktioniert.</li>
</ol>2. Behandlung von HDFs mit TAT-MeCP2-Fusionsprotein
ANMERKUNG: TAT-MeCP2 wurde rekombinant in Escherichia coli exprimiert und mit Standardchromatographietechniken wie zuvorbeschrieben 8 gereinigt und bei -80 °C gelagert.
<ol><li>Platte 1 x 106 menschliche dermale Fibroblasten (HDF) Zellen in 100 mm Schalen und wachsen die Zellen über Nacht bei 37 °C mit 5%CO2, bis sie etwa 90% Konfluenz erreichen.</li>
	<li>Nehmen Sie eine Durchstechflasche mit TAT-MeCP2-Fusionsprotein heraus. Auf Eis auftauen und sanft mischen.</li>
	<li>TAT-MeCP2 auf eine Endkonzentration von 500 nM in 50 ml HDF-Kulturmedien verdünnen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Medien von 100 mm Geschirr und inkubieren Sie die Zellen mit 500 nM TAT-MeCP2 bei 37 °C für verschiedene Inkubationsperioden bis zu 24 h.</li>
	<li>Entfernen Sie die TAT-MeCP2-Lösung aus den Zellen. Waschen Sie die Zellen 2x mit vorgewärmter Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline (DPBS).</li>
	<li>Behandeln Sie die Zellen mit 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung für 5 min bei 37 °C10.</li>
	<li>Fügen Sie 6 ml HDF-Kulturmedien hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren und die Zellen in 15 ml-Röhren zu sammeln.</li>
	<li>Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 500 x g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen 2x mit eiskaltem DPBS. Das Pellet auf Eis aufbewahren und mit der Probenvorbereitung fortfahren.</li>
</ol>3. Probenvorbereitung
<ol><li>HDF-Lysate<ol>
<li>Bestimmen Sie die höchsten Proteingehalte von MeCP2 mit der REAP-Methode zur subzellulären Fraktionierung in die zytoplasmatischen und nuklearen subzellulären Kompartimente nach Suzuki et al.11. Beschränken Sie die Fraktionierung auf nicht mehr als sechs Proben pro Experiment.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mausgehirn lysiert<ol>
<li>Bereiten Sie 100 ml jedes hypotonischen Lysereagenz und Extraktionspuffer s.<ol>
<li>Für das hypotonische Lysereagenz 10 mM HEPES, 1,5 mM Magnesiumchlorid und 10 mM Kaliumchlorid gut mischen.</li>
			<li>Für den Extraktionspuffer gut 20 mM HEPES, 1,5 mM Magnesiumchlorid, 0,42 M Natriumchlorid, 0,2 mM EDTA und 25% (v/v) Glycerin mischen.</li>
			<li>Stellen Sie den pH-Wert beider Puffer auf 7,9 ein.</li>
			<li>1 mM Dithiothreitol (DTT) und 1x Protease-Hemmer-Cocktail zu beiden Puffern frisch hinzufügen. Vor Gebrauch auf Eis abkühlen lassen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Suspend 100 mg des gesamten Maushirns (Stamm: C57BL/6J, Wildtyp männlich und weiblich und B6.129P2(C)-Mecp2tm1.1Bird/J, hemizygotes männchen und heterozygotes Weibchen; Alter: 4 bis 8 Wochen alt) in 1 ml eiskaltem hypotonischem Lysereage.</li>
		<li>Homogenisieren Sie das Gehirn mit einem vorgekühlten Dounce Ganzglas-Gewebehomogenisator durch 15 Striche Homogenisator A (locker, für große Freiraum) bzw. B (eng, für kleine Freiräume).</li>
		<li>Die homogenisierten Zellen bei 10.000 x g bei 10.000 x g bei 20 min bei 4 °C in ein sauberes Rohr und eine Zentrifuge übertragen. Entsorgen Sie den Überstand (oder halten Sie ihn als zytoplasmatische Fraktion für die weitere Verwendung).</li>
		<li>Setzen Sie das Pellet in 140 l Extraktionspuffer pro 100 mg Ausgangsmaterial wieder auf. Das Rohr in einen vorgekühlten Thermoblock geben und bei 4 °C 30 min sanft mischen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das Rohr bei 16.000 g für 10 min bei 4 °C. Den Überstand (d.h. die Kernfraktion) in ein neues vorgekühltes Rohr geben und bis zur Verwendung bei -80 °C lagern. HINWEIS: Die Proteinkonzentration von Lysaten aus Maushirn und HDFs kann durch den BCA-Proteintest beurteilt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. MeCP2-ECLIA-Protokoll
<ol><li>Vorbereitung von Waschlösung, Sperrpuffer und Assay-Verdünnungslösung (Tag 1)<ol>
<li>Fügen Sie 500 l Tween 20 bis 1 L PBS hinzu, um eine 0,05% Tween 20 in PBS-Lösung vorzubereiten, kräftig mischen und als "Waschlösung" kennzeichnen. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass nur frisch zubereiteter Waschpuffer verwendet wird.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Blockierlösung von 3% Blocker A (Materialtabelle) in phosphatgepufferter Saline (PBS) vor. Durch sanftes Rühren mischen, sterilisieren und im Kühlschrank aufbewahren, bis sie maximal zwei Wochen lang verwendet werden.</li>
		<li>Fügen Sie 5 ml Blockierlösung zu 10 ml PBS hinzu, um eine Assay-Verdünnungslösung vorzubereiten (1% Blocker A in PBS).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beschichtung von hochbindbaren Platten<ol>
<li>Nehmen Sie eine 96-Well Multi-Array-Single-Spot-High-Bind-Platte heraus. HINWEIS: Hohe Bindeplatten haben eine größere Bindungskapazität und damit einen größeren Dynamikbereich als Standardplatten mit hydrophoben Oberflächen.</li>
		<li>Den monoklonalen Maus-Anti-MeCP2-Antikörper auf Eis auftauen und 0,67 l des Antikörpers mit 4 ml PBS (1:6.000 Antikörperverdünnung in PBS) mischen. Wirbel die Antikörperlösung gut zu mischen und die Röhre als "Beschichtungslösung" zu kennzeichnen.</li>
		<li>Mit einem Mehrkanal-Pipettor dosieren Sie vorsichtig 25 L Beschichtungslösung in der unteren Ecke jedes Brunnens; dies wird als Lösungsbeschichtungsverfahren bezeichnet. Tippen Sie auf jeder Seite vorsichtig auf die 96-Well-Platte, um sicherzustellen, dass die Beschichtungslösung den Boden jedes Brunnens abdeckt.</li>
		<li>Versiegeln Sie die Platte mit einer Klebefolie und bebrüten Sie die Platte im Kühlschrank bei 4 °C über Nacht (12-16 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Blockierung (Tag 2)<ol>
<li>Nehmen Sie die Platte aus dem Kühlschrank und entfernen Sie die Folie.</li>
		<li>Entfernen Sie die Antikörper-Beschichtungslösung, indem Sie sie in den Abfallkorb werfen und tippen Sie auf die Platte auf ein Papiertuch, um die gesamte Beschichtungslösung aus den Brunnen zu entfernen.</li>
		<li>Fügen Sie 125 L Blockierlösung pro Bohrgut hinzu. Versiegeln Sie die Platte erneut und legen Sie sie auf einen Orbital-Mikroplatten-Shaker.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platte für 90 min bei Raumtemperatur mit konstantem Schütteln bei 800 Rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung von Normen und Proben<ol>
<li>Bereiten Sie während der Inkubationszeit die MeCP2- und/oder TAT-MeCP2-Proteinstandards und verschiedene Proben vor. HINWEIS: Der Für die Standardverdünnung verwendete Lysispuffer muss mit dem in den analysierten Proben verwendeten identisch sein.</li>
		<li>Nehmen Sie eine Durchstechflasche mit MePC2- und/oder TAT-MeCP2-Protein-Stammlösung (250 g/ml), Maus-Gehirnlysate und HDF-Lysate aus -80 °C heraus. Tauen Sie sie auf Eis.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Standard-Lagerlösung (MeCP2 und/oder TAT-MeCP2) in sauberen Rohren nach Tabelle 2.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Proben im Lysepuffer wie folgt: 1,20 g Maushirnlysat pro 25 L Lysepuffer und 0,25 ,1 g HDF-Lysat pro 25 L Lysepuffer. Bereiten Sie genügend Volumen jeder Probe vor, um eine Analyse in dreifacher Ausfertigung durchzuführen.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Standard</td>
			<td>Konzentration</td>
			<td>Verdünnung</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standard 1</td>
			<td>1.800 ng/mL</td>
			<td>1,08 l Standard-Lagerlösung + 148,92 l Lysispuffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standard 2</td>
			<td>600 ng/mL</td>
			<td>50 l Standard 1 + 100 l Lysispuffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standard 3</td>
			<td>200 ng/mL</td>
			<td>50 l Standard 2 + 100 l Lysispuffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standard 4</td>
			<td>66,67 ng/ml</td>
			<td>50 l Standard 3 + 100 l Lysispuffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standard 5</td>
			<td>22,22 ng/ml</td>
			<td>50 l Standard 4 + 100 l Lysispuffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standard 6</td>
			<td>7,41 ng/ml</td>
			<td>50 l Standard 5 + 100 l Lysispuffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standard 7</td>
			<td>2,47 ng/ml</td>
			<td>50 l Standard 6 + 100 l Lysispuffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standard 8</td>
			<td>0,82 ng/ml</td>
			<td>50 l Standard 7 + 100 l Lysispuffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standard 9</td>
			<td>0,27 ng/ml</td>
			<td>50 l Standard 8 + 100 l Lysispuffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Standard 10</td>
			<td>0 ng/mL</td>
			<td>150 L Lysis-Puffer</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Standardserien von 0 bis 1.800 ng/ml.
<ol start="5"><li>Hinzufügen der Muster und Standardlösungen<ol>
<li>Entfernen Sie die Sperrlösung, indem Sie sie in den Abfallkorb werfen und tippen Sie auf die Platte auf ein Papiertuch, um die gesamte Blocklösung aus den Brunnen zu entfernen.</li>
		<li>Waschen Sie die Platte 3x mit 150 l Waschlösung, indem Sie die Waschlösung hinzufügen und sofort entfernen.</li>
		<li>Fügen Sie 25 Ul von Standards und Proben in die untere Ecke des Brunnens mit einer einkanaligen Pipette.</li>
		<li>Versiegeln Sie die Platte und bebrüten Sie die Platte für 4 h bei Raumtemperatur mit konstantem Schütteln bei 800 Umdrehungen von 15.00 Uhr.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Unbeschrifteter Detektionsantikörper<ol>
<li>Den polyklonalen Kaninchen-Anti-MeCP2-Antikörper auf Eis auftauen. Verdünnen Sie den Antikörper 1:6.000 in Assay-Verdünnungslösung.</li>
		<li>Entfernen Sie die Standards und Proben, indem Sie sie in den Abfallkorb werfen und tippen Sie auf die Platte auf ein Papiertuch.</li>
		<li>Waschen Sie die Platte 3x mit 150 l Waschlösung, indem Sie die Waschlösung hinzufügen und sofort entfernen.</li>
		<li>Fügen Sie mit dem Mehrkanal-Pipettor 25 L unbeschrifteten Detektionsantikörper zu jedem Brunnen hinzu. Versiegeln Sie die Platte und bebrüten Sie sie für 1 h mit konstantem Schütteln bei 800 Umdrehungen bei Raumtemperatur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spezifischer konjugierter Antikörper<ol>
<li>Nehmen Sie den spezifischen sekundären Antikörper (Tabelle der Materialien) aus dem Kühlschrank und legen Sie ihn auf Eis. Den Antikörper 1:666.67 in assay verdünnungsmitteler Lösung verdünnen und sanft mischen.</li>
		<li>Entfernen Sie den kostenlosen unbeschrifteten Sekundärantikörper, indem Sie ihn in den Abfallkorb werfen und auf ein Papiertuch tippen.</li>
		<li>Waschen Sie die Platte 3x mit 150 l Waschlösung, indem Sie die Waschlösung hinzufügen und sofort entfernen.</li>
		<li>Fügen Sie mit dem Mehrkanalpipettor 25 L spezifischen konjugierten Antikörper (Materialtabelle) zu jedem Brunnen hinzu. Versiegeln Sie die Platte und brüten für 1 h mit konstantem Schütteln bei 800 Umdrehungen bei Raumtemperatur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lesen der Platte<ol>
<li>Entfernen Sie den freien konjugierten Antikörper (Tabelle der Materialien), indem Sie ihn in den Abfallkorb werfen und tippen Sie auf die Platte auf ein Papiertuch.</li>
		<li>Waschen Sie die Platte 3x mit 150 l Waschlösung.</li>
		<li>Fügen Sie 150 L 1x Tris-basierten Gold-Lesepuffer (Tabelle der Materialien) mit Tensid enthaltenTripropylamin als Co-Reaktant für die Lichterzeugung auf die Platte. Vermeiden Sie Luftblasen, indem Sie Reverse Pipettiertechniken verwenden.</li>
		<li>Legen Sie die Platte auf die Mikroplatten-Erkennungsplattform (Materialtabelle) und starten Sie die Messung sofort. Verwenden Sie die Einstellungen für die 96-Well-Plattenerfassung.</li>
		<li>Erfassen Sie die Elektrochemilumineszenzsignale mit einer eingebauten CCD-Kamera in einem Elektrochemilumineszenz-Erkennungssystem (Materialtabelle) und erfassen Sie die Signalzahlen, die relativen Lichteinheiten (RLU) entsprechen und direkt proportional zur Lichtintensität sind. HINWEIS: Bei elektrochemischer Stimulation emittiert das an die Kohlenstoffelektrode gebundene Ruthenium-Etikett Leuchtlicht bei 620 nm. Analysieren Sie Daten mit der instrumentenbegleiteten Software (Tabelle der Materialien).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDebad%2C+JD+%22Electrogenerated+Chemiluminescence%22">Electrogenerated Chemiluminescence</a>. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Zur Messung der endogenen MeCP2-, rekombinanten MeCP2- und TAT-MeCP2-Spiegel wurde eine 96-Well-Platte ECLIA entwickelt. Es hat sich gezeigt, dass der Verlust der MeCP2-Proteinfunktion zum RTT-Syndrom6führt, für das die Behandlung derzeit auf Symptommanagement und Physiotherapie beschränkt ist. Eine vielversprechende Behandlungsmöglichkeit ist die sogenannte Proteinersatztherapie, bei der MeCP2-Spiegel bis zu ihrer benötigten Konzentration12,,13...

Der Elektrochemilumineszenz-Immunoassay (ECLIA) basiert auf einem Verfahren, bei dem Etiketten verwendet werden, die bei elektrochemisch stimulierter Lumineszenz emittiert werden. Es ist eine allgemein anwendbare Technik für den quantitativen Nachweis biologischer Analyten in der Grundlagenindustrie und der akademischen Forschung, der Lebensmittelindustrie sowie in der klinischen Diagnostik1. Üblicherweise wird eine Einwegplatte mit Carbon-Tintenelektroden verwendet. Diese Elektroden fungieren als Festphasenträger für den Immunoassay. Ein sekundärer Antikörper wird mit einem elektrochemilumineszierenden Etikett konjugiert und wenn Strom auf das System aufgebracht wird, wird die Lichtemission des chemischen Etiketts ausgelöst. Ein ultra-low noise charge coupled device (CCD) zeichnet die Lichtintensität auf, die direkt proportional zum Antigen ist, das an den Aufnahmeantikörper gebunden ist, was zur Quantifizierung des Zielanalyten der Probe2führt. Im Vergleich zum enzymgebundenen Immunsorbent-Assay (ELISA) gilt ECLIA als vorteilhaft, da es eine höhere Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit sowie eine bessere Automatisierung und Konsistenzbietet 3.
Hier analysierten wir die Methyl-CpG-Bindungsprotein-2 (MeCP2)-Spiegel in Proben menschlichen und murinen Ursprungs sowie verschiedene Varianten des rekombinanten Proteins mit dem neu entwickelten ECLIA-System. MecP2 ist ein X-verknüpftes Nukleinsäure-bindendes Protein, das bekanntermaßen mit methylierten DNA-Sequenzen interagiert. Dieses Protein ist in die Regulation der Genexpression4,5verwickelt. Funktionsverlustmutationen im Gen, die dieses Protein kodiert, sind die Hauptschuldigen, die das Rett-Syndrom (RTT), eine schwere neuroentwicklungsbedingten Störungverursachen 6. Eine weitere MeCP2-bedingte Erkrankung, das MECP2-Duplikationssyndrom, führt auch zu neurologischen Symptomen, die sich mit denen von RTT7überschneiden können. MECP2 Insbesondere sind Frauen meist von RTT betroffen, während Männer meist vom MECP2-Duplikationssyndrom 6,7betroffen sind.
Diese Störungen sind mit unzureichenden oder überschüssigen MeCP2-Spiegeln bzw. im Zentralnervensystem (ZNS) verbunden. Daher müssten Behandlungsoptionen für RTT, die eine Erhöhung des MeCP2-Spiegels im CNS beinhalten, die nachteiligen Auswirkungen im Zusammenhang mit einem Überschuss an MeCP27vermieden werden. Aufgrund dieser Tatsache ist eine hochsensible und genaue Quantifizierung des MeCP2-Proteinspiegels, wie sie vom ECLIA-System bereitgestellt wird, entscheidend für die Weiterentwicklung der RTT sowie der Forschung zum MECP2-Duplizierungssyndrom. MECP2 Die präzisen Messungen von endogenen und exogenen MeCP2-Spiegeln aus menschlichen Zelllinien und Mausgewebeproben sowie eines rekombinanten Proteins bestehend aus humanem MeCP2-Isoform B (auch bekannt als Isoform e1) und einer minimalen N-terminalen HIV-TAT-Transduktionsdomäne (TAT-MeCP2), die das Potenzial hat, die Blut-Hirn-Schranke8,,9 zu überqueren, werden in dieser Arbeit vorgestellt.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td>Hypotonisches Lysereagenz, Extraktionspuffer</td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Farbstoffreagenzkonzentrat</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Probenvorbereitung Nachweis AB SULFO-TAG markiert Anti-Kaninchen</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>R32AB-1</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper-Entdeckungs-Workbench 4.0</td><td>Meso Scale Discovery</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>DMEM (1X)</td><td>gibco von Life Technologies</td><td>41966-029</td><td>Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (steril)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>Probenvorbereitung, Waschlösung, Beschichtungslösung</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>Extraktionspuffer</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td>Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td>Extraktionspuffer</td></tr><tr><td>Gold Read Buffer T (1x) mit Tensid</td><td>Mesoskala Diagnostik</td><td>R92TG</td><td>MeCP2 ECLIA-Protokoll</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Hypotonisches Lysereagenz, Extraktionspuffer</td></tr><tr><td>KIMBLE Dounce Gewebeschleifer-Set</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8938</td><td>Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>Laborschüttler, Schaukelbewegung (niedrige Geschwindigkeit)</td><td>GFL</td><td>3014</td><td>MeCP2 ECLIA-Protokoll</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl*6H20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>Hypotonisches Lysereagenz, Extraktionspuffer</td></tr><tr><td>MeCP2 (Human) Rekombinantes Protein (P01)</td><td>Abnova Corporation</td><td>H00004204-P01</td><td>Zellbehandlung</td></tr><tr><td>Microseal B-Siegel</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td><td>MSB1001</td><td>zur Plattenversiegelung</td></tr><tr><td>Monoklonales Anti-MeCP2, hergestellt in der Maus, Klon Mec-168, gereinigtes Immunglobulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6818-100UL; RRID:AB_262075</td><td>Antikörper, Beschichtungslösung</td></tr><tr><td>MSD Blocker A</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>R93BA-4</td><td>Blocker</td></tr><tr><td>MSD SECTOR Imager 2400</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>I30AA-0</td><td>MeCP2 ECLIA Protokoll</td></tr><tr><td>Multi-Array 96-well Plate</td><td>Meso Scale Diagnostics</td><td>L15XB-3/L11BX-3</td><td>MeCP2 ECLIA Protokoll</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>gibco von Life Technologies</td><td>15140122</td><td>Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>Polyklonales Anti-MeCP2, hergestellt in Kaninchen</td><td>Eurogentec S.A.</td><td>kundenspezifischer</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Merck KGaA</td><td>1049361000</td><td>Hypotonisches Lysereagenz</td></tr><tr><td>Primär AB Maus, Anti-MeCP2 (1B11)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB1404063; RRID:AB_10737296</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Primär AB Maus, anti-MeCP2 (4B6)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WH0004204M1; RRID:AB_1842411</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Primär AB Maus, anti-MeCP2 (Mec-168)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6818; RRID:AB_262075</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Primär AB Maus, anti-MeCP2 (Men-8)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7443; RRID:AB_477235</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Primär AB Kaninchen, anti-MeCP2 (D4F3)</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>3456S; RRID:AB_2143849</td><td></td>Antikörper-Protease-Inhibitor-Cocktail</tr><tr><td>(100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8340</td><td>Hypotonisches Lysereagenz, Extraktionspuffer</td></tr><tr><td>Sekundär AB, Kaninchen, Anti-MeCP2</td><td>Eurogentec S.A.</td><td>kundenspezifischer</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Sekundär AB, Kaninchen, Anti-MeCP2</td><td>Merck</td><td>07-013</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>Extraktionspuffer</td></tr><tr><td>SULFO-TAG Markierter Anti-Kaninchen-Antikörper (Ziege)</td><td>Mesoskala Diagnostik</td><td>W0015528S</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>TAT-MeCP2 Fusionsprotein</td><td>Inhouse-Produktion</td><td></td><td>Zellbehandlung</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 0,25% (1X)</td><td>gibco von Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>Zellbehandlung</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td>Waschlösung</td></tr></tbody></table>

ein electrochemilumineszenz-basierter assay für mecp2-proteinvarianten

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

Die ECLIA ist eine vielseitige Methode, die in der Lage ist, endogene und rekombinante Proteinmengen in einem 96-Well-Format zu quantifizieren. Um die ECLIA-Effizienz zu demonstrieren, wurde dieser Test verwendet, um intrinsische Konzentrationen von MeCP2 im Gehirngewebe der Maus und die Aufnahme von TAT-MeCP2 in humanen dermalen Fibroblasten zu analysieren. Der MeCP2-ECLIA erzeugt hochpräzise und reproduzierbare Messungen mit geringem Intra- und Inter-Assay-Fehler. Zusammenfassend haben wir eine quantitative Methode zur Bewertung von MeCP2-Proteinvarianten entwickelt, die in Hochdurchsatz-Bildschirmen eingesetzt werden können.

Das Prinzip des ECLIA-Systems ist in Abbildung 1beschrieben. Standardkurven für zwei MeCP2-Varianten sind in Abbildung 2dargestellt. Eine genaue Quantifizierung war über einen breiten Konzentrationsbereich (1.800 ng/ml) möglich. In Abbildung 3wurden MeCP2-Spiegel von Lysaten aus Dem mausgehirn und HDFs analysiert. Die MeCP2-Expression in Kernlysaten im Gehirn von heterozygoten, Wildtyp- und Knockout-Mäusen wurde in <strong class="xf...

Der Elektrochemilumineszenz-Immunoassay (ECLIA) ist ein neuartiger Ansatz für den quantitativen Nachweis endogener und exogen angewendeter MeCP2-Proteinvarianten, der hochquantitative, genaue und reproduzierbare Messungen mit geringem Intra- und Inter-Assay-Fehler über einen weiten Arbeitsbereich erzeugt. Hier wird das Protokoll für die MeCP2-ECLIA im 96-Well-Format beschrieben.

Ein Electrochemilumineszenz-basierter Assay für MeCP2-Proteinvarianten

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

Die ECLIA ist eine einfache, aber effiziente Methode zur Quantifizierung des zellulären Niveaus von MeCP2. Die ECLIA ist schnell, empfindlicher und einfacher zu handhaben im Vergleich zu anderen Quantifizierungsmethoden wie dem Western Blot und dem ELISA. Um die Waschlösung vorzubereiten, die 0,5%Tween 20 in PBS ist, fügen Sie 500 Mikroliter Tween 20 zu einem Liter PBS hinzu und mischen Sie kräftig.Bereiten Sie eine Blockierlösung von 3%Blocker A und PBS vor und rühren Sie vorsichtig. Sterilisieren Sie die Blockierlösung durch Filtration. Um die Assay-Verdünnungslösung 1%Blocker A und PBS vorzubereiten, fügen Sie die Blockierlösung fünf Milliliter zu 10 MilliliterPBS hinzu.Als nächstes tauen Sie die monoklonale Maus Anti-MeCP2 Antikörper auf Eis. Mischen Sie 0,67 Mikroliter des Antikörpers mit vier Milliliter PBS, dann wirbeln Sie die Lösung. Um die 96-Well-Hochbindungsplatte zu beschichten, geben Sie sorgfältig 25 Mikroliter Beschichtungslösung in die untere Ecke jedes Brunnens, mit einem Mehrkanal-Pipetter.Dab die 96-Well-Platte sanft auf jeder Seite, um sicherzustellen, dass die Beschichtungslösung den Boden jedes Brunnens bedeckt. Versiegeln Sie die Platte mit Klebefolie und bebrüten Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Holen Sie die 96-Well-Platte aus dem Kühlschrank und entfernen Sie die Folie.Entfernen Sie die Antikörperbeschichtungslösung in den Brunnen, indem Sie sie in einen Abfallbehälter schieben. Tippen Sie dann auf die Platte auf ein Papiertuch, um die verbleibende Lösung zu entfernen. Als nächstes fügen Sie 125 Mikroliter Blockierlösung zu jedem Brunnen hinzu.Dann versiegeln Sie die Platte erneut mit Klebefolie. Legen Sie die Platte auf einen Orbital-Mikroplatten-Shaker, der auf 800 Umdrehungen pro Minute eingestellt ist, und inkubieren Sie sie 90 Minuten lang bei Raumtemperatur. Tauen Sie auf Eis eine Durchstechflasche mit MeCP2 oder Tat-MeCP2 Protein-Stock-Lösung, Maus Gehirnlysate, und HDF Lysate.Verdünnen Sie die Proteinstammlösung in sauberen Röhrchen, wie in Tabelle 2 des Manuskripts beschrieben. Als nächstes die Lysatproben verdünnen. Für die Maus Gehirnlysate, verwenden Sie ein bis 20 Mikrogramm pro 25 Mikroliter LysePuffer.Für das HDF-Lysat 0,25 zu einem Mikrogramm pro 25 Mikroliter Lysepuffer hinzufügen. Nachdem die 96-Well-Platte 90 Minuten lang inkubiert wurde, entfernen Sie die Sperrlösung aus den Brunnen, indem Sie sie in einen Abfallbehälter schieben. Tippen Sie dann auf die Platte auf ein Papiertuch, um die verbleibende Lösung zu entfernen.Dann waschen Sie den Teller dreimal mit 150 Mikroliter Waschlösung, indem Sie die Waschlösung hinzufügen und sofort entfernen. Fügen Sie 25 Mikroliter Standards und Proben in die Brunnen der 96-Well-Platte. Versiegeln Sie die Platte und inkubieren Sie sie weitere vier Stunden bei Raumtemperatur mit konstanten 800 RPM Schütteln.Den unbeschrifteten Detektionsantikörper, polyklonales Kaninchen Anti-MeCP2, auf Eis auftauen. Mit Assay-Verdünnungslösung den Antikörper im Verhältnis eins zu 6 000 verdünnen. Wenn die 96-Well-Platte auf dem Shaker inkubiert ist, entfernen Sie die Standards und Proben, indem Sie die Platte in einen Abfallbehälter schieben.Tippen Sie dann auf die Platte auf ein Papiertuch, um die verbleibende Lösung zu entfernen. Waschen Sie die Platte dreimal mit 150 Mikroliter Waschlösung, indem Sie die Waschlösung hinzufügen und sofort entfernen. Fügen Sie mit dem Mehrkanal-Pipetter 25 Mikroliter unbeschrifteter Detektions-Antikörperlösung zu jedem Brunnen hinzu.Versiegeln Sie die Platte und inkubieren Sie sie für eine Stunde bei Raumtemperatur mit konstantem Schütteln bei 800 Umdrehungen pro Minute. Erhalten Sie den spezifischen sekundären Antikörper aus dem Kühlschrank und legen Sie ihn ein Eis. Den Sekundärkörper in assay verdünnungsmitteler Lösung verdünnen und sanft mischen.Um den freien unbeschrifteten Detektionsantikörper aus der 96-Well-Platte zu entfernen, blättern Sie in den Abfallbehälter und tippen Sie dann auf die Platte auf ein Papiertuch. Nach dem Waschen der Platte dreimal wie pervily beschrieben, fügen Sie 25 Mikroliter Sekundärantikörper zu jedem Brunnen mit dem Mehrkanal-Pipetter. Versiegeln Sie die Platte und inkubieren Sie sie für eine Stunde bei Raumtemperatur mit konstantem Schütteln bei 800 Umdrehungen pro Minute.Entfernen Sie den freien Sekundärantikörper, indem Sie in den Abfallbehälter einsteigen und die Platte auf ein Papiertuch klopfen, und waschen Sie die Platte dann, wie zuvor beschrieben, dreimal. Zu jedem Brunnen der Platte, fügen Sie 150 Mikroliter 1X Tris Basis Gold Read Buffer mit Tensid, enthält Tripropylamin als Coreactant für die Lichterzeugung. Um luftblasen zu vermeiden, verwenden Sie Reverse Pipetting-Techniken.Platzieren Sie die 96-Well-Platte auf der Mikroplattenplattform mit Elektrochemilumineszenz-Detektionssystem. Mit der eingebauten CCD-Kamera beginnen Sie sofort mit der Datenerfassung. Aufzeichnungssignalzählungen, die relativen Lichteinheiten entsprechen und direkt proportional zur Lichtintensität sind.MeCP2-Standardkurven wurden aus menschlichem MeCP2 in mehreren Messungen erzeugt. Die ECLIA kann rekombinantes menschliches MeCP2 über einen Bereich von einem Nanogramm pro Milliliter bis 1800 Nanogramm pro Milliliter genau quantifizieren. Mit ECLIA wurden MeCP2-Proteinspiegel in Kernlysaten im Gehirn von heterozygoten und weiblichen Wildtypmäusen und von einer MeCP2-Knockout-Maus gemessen.ECLIA wurde an Zelllysaten aus einer gesunden Kontrolle und aus der ca. 806delG Zelllinie als Modell für das Rett-Syndrom verwendet durchgeführt. Kein MeCP2-Protein wurde in den mutierten Zelllinien durch ECLIA oder durch Immunfluoreszenz nachgewiesen.ECLIA wurde auch verwendet, um die Aufnahme von Tat-MeCP2 durch die MeCP2 mangelhafte Zelllinie Überstunden zu untersuchen. Die Inter- und Intra-Assay-Präzision von ECLIA wurde an drei aufeinanderfolgenden Tagen ermittelt. Für zukünftige Proteinersatztherapien kann die MeCP2-Bereitstellung nach der Proteinstandbewertung durch die ECLIA wiederholt optimiert werden.

an-electrochemiluminescence-based-assay-for-mecp2-protein-variants

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Eine preiswerte, einen hohen Durchsatz-Verfahren für die simultane Detektion von bis zu 43 molekulare Ziele beschrieben. Anwendungen der MPCR / RLB gehören mikrobielle Typisierung und Erkennung von mehreren Erregern aus klinischen Proben.

Multiplex PCR und Reverse-Line-Blot-Hybridisierung Assay (MPCR / RLB)

In diesem Video demonstrieren wir den Elektrochemilumineszenz-Immunoassay zur Quantifizierung von Zielproteinkonzentrationen in verschiedenen Proben. Dieser Assay basiert auf der Lumineszenz, die bei der elektrochemischen Reaktion erzeugt wird. Die Intensität des emittierten Lichts ist proportional zur Menge des Zielproteins in der Probe.

Elektrochemilumineszenz-Assay zur Quantifizierung der Zielproteinspiegel im Gehirnlysat

Dieses Video beschreibt das Chemilumineszenz-basierte Western Blot von immunpräzipitierten Lysaten. Die Technik hilft bei der Bestimmung der Proteinverarbeitung und -aktivierung. Das detektierte Chemilumineszenzsignal ist proportional zum Grad der Proteinverarbeitung während seiner Aktivierung.

Chemilumineszenz-Western-Blot-Assay für die Proteinverarbeitung

Messung von Biomarkern in komplexen biologischen Proben wird zunehmend Führung klinische Entscheidungsfindung. Wir beschreiben eine sehr empfindliche Methode, um gleichzeitig die Herzmyosin bindendes Protein-C, Creatin-Kinase-MB und Troponin I im Serum von Patienten mit Myokardinfarkt und gesunden Kontrollpersonen.

Eine empfindliche und spezifische Quantifizierung Methode zur Bestimmung der Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C durch Elektrochemilumineszenz Immunoassay

Wir beschreiben ein Hochdurchsatz-Multiplex, und gezielte proteomic Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) -Assay mit Potential für klinische Umsetzung entwickelt. Der Test kann für Neurodegeneration, wie Apolipoprotein E-Varianten (E2, E3 und E4), und messen deren allelische Expression potentielle Marker und Risikofaktoren zu quantifizieren.

Ein hoher Durchsatz, Multiplexed und Proteom-CSF-Assay Gezielte Quantifizieren Neurodegenerative Biomarkers und Apolipoprotein E Isoformen-Status

Wir berichten über eine kleine Hairpin RNA (ShRNA) und die nächste Generation Sequencing-basiertes Protokoll zur Identifizierung von Regulatoren der X-Chromosom Inaktivierung in einem murinen Zelllinie mit Firefly Luciferase und Hygromycin-Resistenz-Gene verschmolzen, das Methyl CpG verbindliches Protein 2) MeCP2) gen auf dem x-Chromosom inaktiv.

Gepoolte ShRNA Bildschirm für die Reaktivierung des MeCP2 auf dem inaktiven X-Chromosom

Hier präsentieren wir ein Protokoll für eine effiziente Einzelschritt-Reinigung des aktiven unmarkierten Menschen zehn-elf Translokation-2 (TET2) 5 Methylcytosine Dioxygenase mit Ionenaustausch Chromatographie und seine Assay mit eine flüssige Chromatographie-Tandem-Masse Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Ansatz.

Effiziente Reinigung und LC-MS/MS-basierten Assay-Entwicklung für zehn-elf Translokation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Generierung eines lebensfähigen weiblichen Murinmodells mit nicht zufälliger X-Chromosomeninaktivierung, d.h. das mütterlich vererbte X-Chromosom ist in 100% der Zellen inaktiv. Wir beschreiben auch ein Protokoll zur Prüfung der Machbarkeit, Verträglichkeit und Sicherheit der pharmakologischen Reaktivierung des inaktiven X-Chromosoms in vivo.

Ein nicht zufälliges Mausmodell zur pharmakologischen Reaktivierung von Mecp2 auf dem inaktiven X-Chromosom

CENP-A-Ubiquitylierung ist eine wichtige Voraussetzung für die CENP-A-Ablagerung am Zentromer, die durch Dimerisierung zwischen Zellteilung vererbt und für die Zelllebensfähigkeit unverzichtbar ist. Hier beschreiben wir die Analyse der Massenspektrometrie, um die Ubiquitylierung des MIT EYFP markierten CENP-A-Proteins (EYFP-CENP-A) zu identifizieren.

Massenspektrometrieanalyse zur Identifizierung der Ubiquitylierung von EIFP-A mit EYFP-Tags (EYFP-CENP-A)

DNA-Methyltransferasen sind potenzielle Ziele für Krebsmedikamente. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um kleine Moleküle auf DNA-Methyltransferase-Hemmung zu untersuchen. Dieser Assay verwendet eine Endonuklease, um die DNA-Methylierung an die Fluoreszenzerzeugung zu koppeln und ermöglicht die Überwachung der Enzymaktivität in Echtzeit.

Kontinuierlicher fluoreszenzbasierter Endonuklease-gekoppelter DNA-Methylierungsassay zum Screening auf DNA-Methyltransferase-Inhibitoren

Erfahren Sie die elektrochemilumineszenzbasierte Quantifizierung von MeCP2-Proteinvarianten in einer 96-Well-Platte. Diese Methode bietet höhere Sensitivität und Reproduzierbarkeit als Western Blot und ELISA für die Neurowissenschaft.

Ein Electrochemilumineszenz-basierter Assay für MeCP2-Proteinvarianten

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