Optimierung zur Sequenzierung und Analyse degradierter FFPE-RNA-Proben

Diese Methode beschreibt die Schritte zur Verbesserung der Qualität und Quantität der Sequenzdaten, die aus formal in-fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) RNA-Proben gewonnen werden können. Wir beschreiben die Methodik zur genaueren Bewertung der Qualität von FFPE-RNA-Proben, bereiten Sequenzierungsbibliotheken vor und analysieren die Daten aus FFPE-RNA-Proben.

Unser Protokoll kann verwendet werden, um die Qualität und Quantität der Genexpressionsdaten zu verbessern, die aus FFPE-abgeleiteten RNA-Proben, insbesondere in suboptimalen Qualitätsproben, generiert werden. Diese Technik bewertet die RNA-Qualität in FFPE-Gewebeproben und ermöglicht die Optimierung ihrer nachgelagerten Verarbeitung, um die Quantität und Qualität der Probensequenzierungsdaten zu verbessern. Diese Methode ermöglicht die umfassende Charakterisierung eines Transkripts in biologischen und klinischen Proben und kann Einblicke in funktionelle Elemente des Genoms in Entwicklung und Krankheit geben.

Der FFPE-RNA-Abbau und die Auswahl der Methoden für Die Proben-QC, die Bibliotheksvorbereitung und die Datenanalyse können sehr schwierig sein. Seien Sie bei der Auswahl der richtigen Methoden und geeigneten Kontrollen akribisch. Visuelle Demonstration ermöglicht es den Betrachtern, die kleinen subtilen Änderungen und Vorsichtsmaßnahmen zu beobachten, die während der Planung, Bewertung und des Sequenzierungsprozesses erforderlich sind, insbesondere für schlecht erhaltene FFPE-Proben.

Um die Qualität der RNA-Probe zu überprüfen, führen Sie die Probe auf einem RNA-QC-System gemäß den Anweisungen des Herstellers aus und verwenden Sie die entsprechende Bioanalyse-Software, um die Verteilung der RNA-Fragmente innerhalb der Probe zu analysieren und den Anteil der Fragmente zu berechnen, die länger als 100 und 200 Nukleotide sind. Identifizieren Sie auf der Grundlage der QC-Metriken die Proben mit weniger als 40 % der Fragmente, die länger als 100 Nukleotide sind, um den Ausschluss dieser Proben von der Verarbeitung zu ermöglichen. Für die Sequenzierung die entsprechenden Sequenzierungsreagenz-Kits entsprechend den Laufparametern in einem Raumtemperatur-Wasserbad auftauen und das Reagenzfach nach dem Auftauen auf vier Grad Celsius legen.

Legen Sie das Flow-Zell-Paket 30 Minuten bei Raumtemperatur. Während sich das Paket erwärmt, öffnen Sie die Illumina Experiment Manager-Anwendung, und wählen Sie Beispielblatt erstellen aus. Wählen Sie den zu verwendenden Sequenzer aus, und klicken Sie auf Weiter.

Geben Sie den Reagenz-Kit-Barcode und die anderen geeigneten Workflow-Parameter ein. Laden Sie dann ein Beispielblatt hoch, das nach den Kriterien der Illumina-Sequenz erstellt wurde. Um die Beispielbibliothek und die Steuerungsbibliothek PhiX vorzubereiten, denaturiert und verdünnt die Bibliotheken auf die entsprechenden Konzentrationen, und mischen Sie die Sample- und PhiX-Steuerbibliotheken, um ein Volumenverhältnis von 5% PhiX zu erhalten.

Wenn die Durchflusszellen bereit sind, entfernen Sie die Umhüllung, reinigen Sie die Glasoberfläche mit einem fusselfreien Alkoholwisch und trocknen Sie das Glas mit einem niedrigen Fussellaborgewebe. Entfernen Sie die Reagenzpatrone aus der Vier-Grad-Celsius-Lagerung und invertieren Sie die Patrone fünfmal, um die Reagenzien zu mischen. Tippen Sie vorsichtig auf die Patrone auf der Bank, um Luftblasen zu reduzieren und laden Sie die denaturierte und verdünnte Probe in die Reagenzpatrone im dafür vorgesehenen Reservoir.

Laden Sie die Durchflusszelle, die Pufferpatrone und die Reagenzkassette auf das System. Führen Sie dann eine automatisierte Überprüfung durch, und überprüfen Sie die Ausgabe, um sicherzustellen, dass die Ausführungsparameter die Systemprüfung bestehen. Wenn die automatisierte Prüfung abgeschlossen ist, wählen Sie Start aus, um mit der Sequenzierung zu beginnen.

Um die QC-Ergebnisse vor der Verarbeitung von QC und QC nach der Ausrichtung zu visualisieren, führen Sie multi-QC aus, um einen aggregierten Bericht im HTML-Format zu generieren. Um Batcheffekte zu bestimmen und die Qualitätszuordnung des angegebenen Datasets zu bewerten, verwenden Sie ein R-Skript, um eine Hauptkomponentenanalyse auszuführen. Die Stichprobenkorrelationsanalyse kann dann mit der Pearson-Korrelation zwischen verschiedenen Proben durchgeführt werden.

Die Schätzung des Anteils von Fragmenten, die länger als 100 Nukleotide sind, ist nützlicher als eine Schätzung der Fragmente, die länger als 200 Nukleotide sind, da sie empfindlicher ist, um den Anteil kleinerer Fragmentgrößen für stark degradierte RNA-Proben genau zu messen. Angesichts des hohen Abbaugrads im Probensatz wird eine Methode zur Vorbereitung der RNA-Bibliothek insgesamt empfohlen. Hier werden z. B. Sequenzierungsbibliotheken angezeigt, die aus vier verschiedenen Beispielen erstellt wurden.

Hier werden Übersichten über die Qualität der RawQ-Dateisequenzierung und den Inhalt von Beispieladaptern angezeigt. FastQC-Screening kann dabei helfen, Verunreinigungen wie bakterielle oder Mauskontaminationen in den Proben zu erkennen. Die STAR-Ausrichtung kann verwendet werden, um den Anteil der Lesevorgänge zu bestimmen, die dem Referenzgenom zugeordnet sind, den Prozentsatz der Lesevorgänge, die dem Referenzgenom eindeutig zugeordnet sind, und den Anteil der Lesevorgänge, die nicht zugeordnet wurden oder die mehreren Loci zugeordnet wurden.

Die Karten- und RSeQC-Statistiken können verwendet werden, um den Prozentsatz der Messenger-RNAs, intronischen und intergenen Basen zu bestimmen, die in den zugeordneten Lesevorgängen vorhanden sind. Für diese repräsentativen Analysen hatten einige degradierte Bibliotheken eine drei Primierungsverzerrung, in der mehr Lesevorgänge näher an den drei Primierungen als an den fünf Primierungszielen abgebildet wurden. Darüber hinaus kann eine Hauptkomponentenanalyse durchgeführt werden, um den Prozentsatz der Gesamtvariation zu bestimmen, die von den Hauptkomponenten für die biologischen Replikationen jeder Probe erfasst wird.

Achten Sie darauf, Probendegradation zu vermeiden, Replikationen und mehrere Schichten für jede Probe vorzubereiten, die entsprechenden Metriken zu verwenden, um die Probenqualität zu bewerten, und die richtige Bibliotheksvorbereitungsmethode zu verwenden. Mit dieser Methode können größere NGS-Studien mit bisher unbrauchbaren FFPE-Proben mit unterschiedlichen Lagerzeiten und Bedingungen durchgeführt werden, um Einblicke in eine Vielzahl unterschiedlicher Krankheitszustände zu gewinnen. Diese Technik ebnete den Forschern den Weg, bestehende große Archive von FFPE-Proben mit umfangreichen klinischen Informationen zu untersuchen und kann bevölkerungsbasierte Krebsstudien erheblich verbessern.