Immunfärbung von Drosophila-Hoden für die konfokale 3D-Analyse großer Spermatozyten

Die Färbung von Drosophila-Geweben, wie z. B. Hodenproben, ist aufgrund der begrenzten Antikörperpenetration oft problematisch. Unser Fixierungsprotokoll mit NP40 und Heptan ermöglicht eine einheitliche und reproduzierbare Markierung. Durch die Beibehaltung der Gewebeform bei gleichzeitiger Ermöglichung einer tiefen Penetration der Antikörper ermöglicht dieses Verfahren die reproduzierbare, quantifizierbare Erfassung der Immunfärbung in drei Dimensionen, sowohl einzeln als auch in Kolokalisationsstudien.

Für die Bewertung diploider Keimzellen werden die Fliegen null bis 15 Stunden nach der Eklosion durch eine kurze Exposition gegenüber Kohlendioxid betäubt und die Fliegen auf ein Fliegenpad übertragen. Legen Sie das Pad unter ein Präpariermikroskop mit 10-facher Vergrößerung und entfernen Sie mit einer Pinzette die Köpfe von fünf bis 10 männlichen Fliegen. Übertragen Sie die enthaupteten Fliegenkörper auf 100 Mikroliter Ringer-Puffer auf einen silikonbeschichteten Glasobjektträger auf einer schwarzen Hintergrundstütze und greifen Sie mit der 40-fachen Vergrößerung und einer Pinzette Nummer fünf eine Fliege zwischen Brustkorb und Bauch.

Ziehen Sie dann den Bauch vom Thorax weg und isolieren Sie schnell die Hoden und das angrenzende Gewebe vom Fliegenkadaver. Sobald alle Hoden entnommen wurden, reinigen Sie die Proben von jeglichem verbleibenden Gewebe und verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze, um den überschüssigen Puffer um die präparierten Hoden herum zu entfernen. Geben Sie dann einen Tropfen 4%iger Paraformaldehyd auf die Hoden und geben Sie das Gewebe schnell in ein Röhrchen mit zwei Millilitern frisch zubereiteter 4%iger Paraformaldehydlösung, die mit 20%NP40 und Heptan ergänzt wird.

Für eine gründliche Fixierung der Hodenproben schütteln Sie das Röhrchen 30 Sekunden lang vertikal, bevor Sie die Hoden auf einem Rotationsmischer 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Übertragen Sie das Röhrchen am Ende der Inkubation in ein Röhrchengestell und lassen Sie die Hoden am Boden des Röhrchens absetzen. Entfernen Sie das gesamte Heptan und die Fixierlösung und spülen Sie die Hoden dreimal schnell mit PBS aus.

Übertragen Sie die Hoden nach dem letzten Waschen in ein neues 200-Mikroliter-Röhrchen und verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette mit einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze, um überschüssigen Puffer zu entfernen. Geben Sie dann 200 Mikroliter frisches PBS-In das Röhrchen und legen Sie die Hoden auf Eis. Für die Antikörpermarkierung der Hodenproben ersetzen Sie das PBS durch 200 Mikroliter 0,3 % PBS-T für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur.

Nach der Permeabilisierung blockieren Sie jede unspezifische Bindung mit 0,3 % PBS-T plus 5 % normalem Ziegenserum für eine Stunde bei Raumtemperatur, bevor Sie 200 Mikroliter des primären Antikörpers von Interesse, verdünnt in 0,3 % PBS-T plus 5 % normalem Ziegenserum, für eine Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius oder Raumtemperatur mit Schaukeln hinzufügen. Am nächsten Morgen waschen Sie die Proben mit drei 15-minütigen Wäschen mit frischen 0,3 % PBS-T und Schaukeln bei Raumtemperatur pro Waschgang und lassen Sie die Hoden durch die Schwerkraft am Boden des Röhrchens absetzen. Geben Sie 200 Mikroliter eines geeigneten Sekundärantikörpers in das Röhrchen für eine vierstündige Inkubation unter Schaukeln bei Lichtschutz bei Raumtemperatur, bevor Sie die Proben in frischem 0,3 %PBS-T pro Waschgang waschen, wie gezeigt.

Waschen Sie die Proben nach dem Waschgang von 0,3 % PBS-T einmal in 0,2 % PBS-T und einmal in 0,1 % PBS-T für 30 Minuten pro Waschgang auf der Wippe, gefolgt von einem letzten 30-minütigen Waschgang nur mit PBS. Nach der PBS-Wäsche werden die Proben 15 Minuten lang bei lichtgeschützter Raumtemperatur mit 180 Mikrolitern einer DAPI-Lösung von einem Mikrogramm pro Milliliter in PBS markiert, gefolgt von drei 5-minütigen Wäschen in frischem PBS pro Waschgang. Zeichnen Sie nach dem letzten Waschen mit einem hydrophoben Barrierestift einen Kreis auf einen sauberen Objektträger und verwenden Sie eine 0,1 %PBS-T grundierte Pipettenspitze, um die Hoden auf den Objektträger zu übertragen.

Überschüssiges PBS aspirieren und 100 Mikroliter Citifluor AF1 hinzufügen. Legen Sie vorsichtig einen Glasdecker über das Taschentuch, achten Sie darauf, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden, und verwenden Sie klaren Nagellack, um den Deckglas auf dem Objektträger zu versiegeln, bevor Sie die Objektträger durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie betrachten. Nachdem Sie konfokale Bilder der Proben aufgenommen haben, importieren Sie die Bilder in ein geeignetes Bildanalyse-Softwareprogramm.

Verwenden Sie dann die manuelle Segmentierung, um den Zellkern innerhalb jeder Zelle zu definieren und die Pearson-Korrelationskoeffizienten innerhalb des gesamten Volumens zwischen zwei Fluorophoren zu bestimmen. Dieses Protokoll ermöglicht die Aufnahme von konfokalen Bildern von ausreichender Qualität, die für die 3D-Rekonstitution behandelt werden können. Zum Beispiel wird in diesen vier benachbarten seriellen Abschnitten eines Spermatozyten des Stadiums S5 ein niedriger Spiegel von Mad1 an der Kernhülle beobachtet und eine hohe Akkumulation von Mad1 kann in Verbindung mit einer DAPI-Färbung im Zellkern sichtbar gemacht werden.

In diesem 3D-rekonstituierten Bild kann das geringe Vorhandensein von Mad1 an der Kernoberfläche und die hohe Akkumulation von Mad1 im Zellkern zusammen mit der DNA beobachtet werden. In diesen 3D-Rekonstitutionen können große S5-Spermatozyten beobachtet werden, die mit Nucleoporin 62 und Mad1 oder Importin-beta und DAPI gefärbt wurden. In beiden Rekonstruktionen scheinen die mit den Kernporen assoziierten Komponenten als Punkte unregelmäßiger Größe ungleichmäßig über den Kernrand verteilt zu sein.

Unter Beibehaltung des 3D-Volumens der Zellen ermöglicht dieses Protokoll auch ein gleichmäßiges Eindringen von Antikörpern von Interesse in die Tiefe jeder Zelle, was quantitative Analysen, wie z. B. Kolokalisation, ermöglicht. Da das Protokoll eine zuverlässige Messung von Kolokalisationen aus unabhängigen Hoden ermöglicht, kann es auch zum Vergleich der Färbung in verschiedenen Fliegengenotypen verwendet werden. Die Menge an verwendetem NP40 ist entscheidend für eine ausreichende Permeabilisierung.

Wenn das Verfahren genau befolgt wird, können eine reproduzierbare Markierung und eine 3D-Konservierung der Kernstruktur erreicht werden. Obwohl die Färbung von Geweben innerhalb von Drosophila schwierig sein kann, kann dieses Protokoll leicht für andere Proben angepasst werden.