Name: In Situ Chemotaxis Assay zur Untersuchung des mikrobiellen Verhaltens in aquatischen Ökosystemen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-05T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Erfahren Sie die In-Situ-Chemotaxis-Analyse zur Untersuchung mikrobiellen Verhaltens in aquatischen Ökosystemen. Diese mikrofluidische Methode ermöglicht die robuste Quantifizierung von Chemotaxis direkt im natürlichen Lebensraum.

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Diese Forschung wurde zum Teil von der Gordon and Betty Moore Foundation Marine Microbiology Initiative finanziert, indem sie GBMF3801 an J.R.S. und R.S., und einen Investigator Award (GBMF3783) an R.S. sowie ein Australian Research Council Fellowship (DE160100636) an J.B.R., eine Auszeichnung der Simons Foundation an B.S.L. (594111) und ein Stipendium der Simons Foundation (542395) an R.S. im Rahmen der Principles of Microbial Ecosystems (PriME) Collaborative.

Wir empfehlen, Abschnitt 1 vor Feldversuchen auszuführen, um die Ergebnisse zu optimieren.
1. Laboroptimierung
HINWEIS: Die im Optimierungsverfahren beschriebenen Volumina reichen für eine einzelne ISCA (bestehend aus 20 Brunnen) aus.
<ol><li>Herstellung der Chemikalie von Interesse HINWEIS: Die optimale Konzentration für jeden Chemo-Plünderer muss oft unter Laborbedingungen vor Feldeinsätzen bestimmt werden. Das Feld der chemischen Konzentration wird mit der Entfernung von der Quelle (ISCA-Brunnen) in der Größe abnehmen, was bedeutet, dass die Konzentration von Mikroorganismen in der Umgebung niedriger sein wird als die konzentration, die im Inneren des Geräts vorhanden ist. Die optimale Konzentration im ISCA-Gut hängt von der Diffusionsrate des Chemoattraktions ab. Wenn die Konzentration im Brunnen zu niedrig ist (nahe der Nachweisgrenze der Mikroben), werden keine positiven Chemotaxis beobachtet. Umgekehrt, wenn die Konzentration im Brunnen zu hoch ist, wird die Konzentration auch in der unmittelbaren Umgebung hoch sein und mikrobielle Akkumulation wird über den ISCA-Brunnen statt im Inneren auftreten. Daher sollten Verdünnungsreihen unter Laborbedingungen für jede Verbindung durchgeführt werden, um die optimale Konzentration für Feldeinsätze zu bestimmen. Idealerweise sollte auch ein Konzentrationsbereich vor Ort getestet werden, um Laborergebnisse zu bestätigen.<ol>
<li>2,5 L eines geeigneten Mediums mit der entsprechenden Salzkonzentration (z. B. phosphatgepufferter Kochsalzlösung [PBS] oder künstliches Meerwasser) vorbereiten. Filtern Sie das Medium mit einem 0,2-mm-Filter mit einer Peristaltik- oder Vakuumpumpe und einem Autoklaven.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 10 mM Lösung von Chemoattractant in 1 ml des sterilen Mediums vor. Filtern Sie die Chemoattractantlösung mit einem 0,2 m Spritzenfilter, um Partikel und mögliche Verunreinigungen zu entfernen. HINWEIS: Idealerweise sollten in der keine anderen organischen Verbindungen als das Chemoattractant vorhanden sein.</li>
	</ol></li>
	<li>Konzentrationsbereich nach Verdünnungsreihen<ol>
<li>Verdünnen Sie die gefilterte Chemolockant-Stammlösung in Reihe, die z.B. von 10 mM bis 100 m reicht. HINWEIS: Pro getesteter Konzentration wird mindestens ein Endvolumen von 0,7 ml benötigt.</li>
	</ol></li>
	<li>IsCA geladen<ol>
<li>Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit dem gefilterten Chemoattractant und schließen Sie sie an eine 27 G Spritze an. Halten Sie die ISCA mit dem Port nach oben, langsam injizieren Sie die Substanz, bis ein kleines Tröpfchen auf dem Hafen erscheint. ANMERKUNG: 1) Jede Verdünnung oder Substanz muss mit einer separaten Spritze und Einer Nadel injiziert werden, um eine Kreuzkontamination zu verhindern. 2) Dieses kleine Tröpfchen ist wichtig, weil es sicherstellt, dass keine Luftblase im Hafen gefangen ist, was die Fähigkeit von Mikroben beeinträchtigen könnte, durch den Hafen zu migrieren. 3) Es wird empfohlen, eine ganze Reihe pro Stoff oder Konzentration (fünf Brunnen) zu füllen, um ein ausreichendes Mindestvolumen für weitere Analysen bereitzustellen. 4) Eine Zeile pro ISCA sollte als Negativkontrolle fungieren und mit dem gefilterten Medium gefüllt werden, in dem die Mikroben ausgesetzt werden. Diese Behandlung erklärt die Wirkung der zufälligen Beweglichkeit durch Mikroben in die ISCA-Brunnen und sollte verwendet werden, um die Behandlungen zu normalisieren, die ein Chemoattraktionsmittel enthalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Einsatz im Labor<ol>
<li>Über Nacht eine 5 ml Kultur mit 1% Meeresbrühe (für Meeresbakterien) oder 1% Lysogenybrühe (LB, für Süßwasserbakterien) angereichert. HINWEIS: Motile bakterielle Isolate oder natürliche Bakteriengemeinschaften können für Laboreinsätze verwendet werden.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Kultur für 12 h bei Raumtemperatur (RT) und 180 Rpm. Nach 12 h, stellen Sie sicher, dass die mikrobiellen Gemeinschaften durch direkte Beobachtung unter dem Mikroskop motil sind.</li>
		<li>Die Kultur bei 1.500 x g für 10 min abdrehen und 1/100 in 150 ml geeignetem Medium (z.B. gefiltertes Meerwasser, gefiltertes Süßwasser) wieder aufsetzen.</li>
		<li>Legen Sie zwei kleine Stücke doppelseitigen Klebebandes auf die flache Oberfläche eines 200 ml Fassungsfachs (die Deckel von 1 ml Spitzenboxen haben dafür die idealen Abmessungen und können leicht autoklaviert werden). Platzieren Sie einen ISCA oben, um sicherzustellen, dass es sicher am Band befestigt wird. Füllen Sie das Einsatztablett mit einer 50 ml serologischen Pipette langsam mit der bakteriellen Lösung. HINWEIS: Füllen Sie das Fach, bis der ISCA unter ca. 1–2 cm Flüssigkeit getaucht ist. Wenn Sie mehrere Trays verwenden, verwenden Sie das gleiche Volume für alle.</li>
		<li>Lassen Sie die ISCA für 1 h brüten, um bakterielle Chemotaxis zu ermöglichen. Nach 1 h, entfernen Sie das Medium sehr sanft mit einer 50 ml serologischen Pipette, um turbulenten Fluss zu minimieren.</li>
		<li>Rufen Sie die ISCA aus dem Bereitstellungstask ab, ohne die obere Oberfläche zu berühren. Verwenden Sie eine Pipette und Einweg-Wischer, um die verbleibende Flüssigkeit auf der ISCA-Oberfläche zu entfernen. HINWEIS: Es ist wichtig, die Ports während dieses Prozesses nicht zu berühren, da die daraus resultierenden Druckänderungen Bakterien aus der äußeren Umgebung entfernen oder in den Brunnen einbringen können und dadurch die bakterielle Dichte und Zusammensetzung im Brunnen verzerrt werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Abruf der Proben<ol>
<li>Halten Sie die ISCA mit dem Nachdruck nach unten, holen Sie das Volumen der Brunnen mit einer sterilen 27 G Spritzennadel, die an einer 1 ml Spritze befestigt ist. HINWEIS: Jede Zeile (wenn sie denselben Stoff enthält) kann gepoolt werden, um eine Arbeitsprobe von ca. 550 l bereitzustellen. Diese Probe kann anschließend je nach den erforderlichen nachgeschalteten Anwendungen in verschiedene Rohre eingegliedert werden.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Anzahl der Bakterien, die zu jeder Chemoattraktionskonzentration angezogen werden, indem Sie die Proben mit Durchflusszytometrie12analysieren. Wählen Sie die Konzentration von Chemoattractant, die Chemotaxis für nachfolgende Feldeinsätze maximiert.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Vorbereitung auf den Einsatz vor Ort
HINWEIS: Die Vorbereitung des Materials und die Konstruktion des Strömungsdämpfungsgehäuses (Abschnitt 2) müssen vor dem Einsatz durchgeführt werden.
<ol><li>Herstellung von Materialien<ol>
<li>Bereiten Sie alle in Tabelle 1aufgeführten Materialien vor. HINWEIS: Materialmengen werden für einen ISCA bereitgestellt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Konstruktion und Vorbereitung des Strömungsdämpfungsgehäuses HINWEIS: Das Strömungsdämpfungsgehäuse minimiert unerwünschte Turbulenzen, die sonst das Auftreten chemischer Gradienten verhindern, die von der ISCA ausgeht.<ol>
<li>Schneiden Sie die Teile für das Einsatzgehäuse mit einem Laserschneider aus einer 3 mm Acrylfolie. HINWEIS: Die Datei für die Stücke kann unter dem folgenden Link gefunden werden: <https://figshare.com/articles/Flow_damping_enclosure_for_ISCA_deployments/10630220>.</li>
		<li>Montieren Sie die lasergeschnittenen Stücke, wie in Abbildung 2 mit Acrylkleber gezeigt. HINWEIS: Montieren Sie die Teile mit Sorgfalt. Bohrungen oder Fehlausrichtungen können bei der Bereitstellung zu Lecks führen, was sich direkt auf die Datenqualität auswirkt.</li>
		<li>Lassen Sie das montierte Gehäuse über Nacht trocknen.</li>
		<li>Waschen Sie das Gehäuse mit entionisiertem Wasser.</li>
		<li>Identifizieren Sie mögliche Leckagen, indem Sie entionisiertes Wasser in das Gehäuse gießen. Beheben Sie mögliche undichte Verbindungen, indem Sie mehr Acrylkleber hinzufügen, und wiederholen Sie dann die Schritte 2.2.3–2.2.5.</li>
		<li>Schneiden Sie die Schraubgewinde in das Acrylstück, das zur Sicherung des ISCA verwendet wird. Dies kann mit einem Wasserhahn mit einem Durchmesser und einer Steigung erreicht werden, die zu den Befestigungsschrauben passt.<ol>
<li>Zuerst den Wasserhahn in einen Hahnenschlüssel anbringen und dann das Acrylstück sichern, das in einem Tischschrauber angezapft wird. Um die besten Ergebnisse zu erzielen, stellen Sie sicher, dass das Acrylstück so eben wie möglich ist. Stellen Sie sicher, dass der Hahn senkrecht zum Acrylstück ist, und drehen Sie den Hahnenschlüssel (im Uhrzeigersinn), indem Sie leichten Druck auf den Wasserhahn ausüben.</li>
			<li>Nach mehreren vollen Umdrehungen im Acrylstück die Drehung des Wasserhahns (gegen den Uhrzeigersinn) für ein Viertel einer Drehung umkehren, um Acryl aus dem Wasserhahn zu löschen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die gesamte Tiefe des Acrylstücks angezapft ist.</li>
			<li>Entfernen Sie schließlich den Wasserhahn (gegen den Uhrzeigersinn drehen) und testen Sie die Gewinde mit einer Schraube.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Verfahren vor Ort
<ol><li>Wasserfiltration<ol>
<li>Sammeln Sie Wasser vom Feldgelände, wenn Sie bereit sind, das Experiment zu starten. Filtern Sie 5 ml Wasser pro ISCA durch einen 0,2 m Spritzenfilter (mit einer 50 ml Spritze) in ein 50 ml konisches Zentrifugenrohr. HINWEIS: Ungefähr 3 ml gefiltertes Wasser sind erforderlich, um alle Brunnen eines ISCA zu füllen; Es wird jedoch empfohlen, 1) 5 ml pro Gerät zu filtern, um Verluste während des Vierfachfiltrationsprozesses zu berücksichtigen, und 2) Aliquots der Filtrate als Negativkontrollen sowohl für die Durchflusszytometrie als auch für molekulare Verfahren beizubehalten.</li>
		<li>Filtern Sie das Filtrat zweimal durch eine hydrophile GP-Filterpatrone von 0,2 m (beide Male mit derselben) mit einer neuen 50 ml Spritze in ein neues 50 ml konisches Zentrifugenrohr. Filtern Sie das Filtrat durch einen 0,02 m Spritzenfilter (mit einer neuen 50 ml Spritze) in ein neues 50 ml konisches Rohr. HINWEIS: Diese Vierfachfiltration sollte fast alle Mikroorganismen und Partikel aus dem Wasser entfernen. Halten Sie das endgültige Filtrat von jeder Wärmequelle fern, bis sie verwendet werden. Dieses Wasser wird verwendet, um alle in der ISCA verwendeten Chemikalien wieder auszusetzen, und es sollte bei der gleichen Temperatur wie das Wasser am Einsatzort gehalten werden. Konvektive Ströme, die durch Temperaturunterschiede zwischen den ISCA-Brunnen und der Außenumgebung ausgelöst werden, können andernfalls auftreten.</li>
		<li>Verwenden Sie Aliquots des Filtrats, um alle (typischerweise trocken) Chemopaugen auf die gewünschten Konzentrationen in 15 ml konischen Zentrifugenrohren auszusetzen.</li>
		<li>Filtern Sie die resuspendierten Chemoattractants durch einen 0,2 m Spritzenfilter mit einer 10 ml Spritze in sterile 15 ml konische Zentrifugenröhrchen, um unerwünschte Partikel oder wasserunlösliche Verbindungen (bei Verwendung von Extrakten) zu entfernen. HINWEIS: Filtern Sie vorsichtig, um zu verhindern, dass Partikel durch den Filter gelangen. Es ist wichtig, die Chemolockanten im ultragefilterten Wasser vom Feldplatz aus auszusetzen und nicht in andere Lösungen zu überweisen. Die Verwendung von Wasser aus dem Feldgelände ist notwendig, um (1) die gleiche Salzkonzentration in den Brunnen zu erhalten wie im Massenumweltwasser, um einen dichtegetriebenen Fluss zu verhindern und (2) sicherzustellen, dass der Nährstoffgehalt im Hintergrund innerhalb und außerhalb des Brunnens gleich ist.</li>
	</ol></li>
	<li>ISCA-Füllung<ol>
<li>Führen Sie Abschnitt 1.3 aus, um die ISCA auszufüllen. HINWEIS: Es wird empfohlen, eine Reihe (fünf Brunnen) pro Substanz zu füllen (d. h. drei verschiedene Substanzen pro ISCA und eine ultrafiltrierte Meerwasserkontrolle).</li>
	</ol></li>
	<li>Einsatz vor Ort<ol>
<li>Schrauben Sie den ISCA (Abbildung 3A) auf Stück 9 des Gehäuses (Abbildung 2K und Abbildung 3B). HINWEIS: Das oben beschriebene Strömungsdämpfegehäuse kann zwei ISCAs nebeneinander oder einen ISCA in der Mitte enthalten.</li>
		<li>Schließen Sie das Gehäuse (Abbildung 3C) und versiegeln Sie es mit Klebeband (Abbildung 3D). HINWEIS: Falten müssen vermieden werden, um eine perfekte Versiegelung zu gewährleisten. Versiegeln Sie zuerst alle Seiten, dann (in einem zweiten Schritt) die Seitenlöcher, die verwendet werden, um Wasser aus dem Gehäuse am Ende der Probenahme abzuleiten. Versiegeln Sie die oberen und unteren Löcher nicht. Stellen Sie die ISCA nicht auf den Kopf, da dichtegetriebene Strömung in Brunnen auftreten kann, die Chemolockanten enthalten, was die Anzahl der Zellen in den Brunnen verzerrt.</li>
		<li>Da das Gehäuse während des Einsatzes stabil bleiben muss, wird empfohlen, es mit Bungee-Schnüren an von Menschenhand (z. B. Pontoon, Leiter) zu befestigen. HINWEIS: Das Gehäuse kann mit Bungee-Kabeln vor dem Eintauchen in das Wasser an einem Einsatzarm (hier eine modifizierte Klemme mit senkrechter Plattform) befestigt werden. Alternativ kann das Gehäuse mit geringem Gewicht auf flachen Substraten befüllt und gesichert werden. Wenn Einsätze im pelagischen Ozean vorgesehen sind, kann das Gehäuse an einem Netz mit einer Boje auf der einen Seite und Tauchgewicht auf der anderen Seite befestigt werden.</li>
		<li>Tauchen Sie das Gehäuse vollständig ein, um mit dem Füllen zu beginnen. Halten Sie das Gehäuse während der Füllung fest, um übermäßige Wasserbewegungen im Inneren zu verhindern. Sobald der Wasserstand die Oberseite des Gehäuses erreicht hat, stellen Sie sicher, dass keine Luft im Inneren eingeschlossen ist. HINWEIS: Falls einige Luftblasen eingeschlossen sind, neigen Sie das Gehäuse sanft mit dem nach oben gerichteten Entlüftungsloch, wodurch die Blasen entweichen können.</li>
		<li>Nach vollständiger Vollung die unteren und oberen Löcher mit zwei Steckern versiegeln, die aus Silizium oder Gummi hergestellt werden können, oder durch Abdichten der Extremitäten von 20 L Pipettenspitzen (Abbildung 4). HINWEIS: Dieser Schritt verhindert den Fluss innerhalb des Gehäuses während der Probenahme.</li>
		<li>Lassen Sie die ISCA für 1-3 h an Ort und Stelle für die Probenahme. HINWEIS: Die ideale Einsatzzeit wird in erster Linie durch die Temperatur des Wassers und die Verdoppelung der Zeit der Bakteriengemeinschaft bestimmt. Wenn die Wassertemperatur über 20 °C liegt, wird es nicht empfohlen, die ISCA für mehr als 1 h einzusetzen, da die Zellteilung in den Brunnen auftreten kann, die Chemolockanten enthalten, nach 1,5–2,0 h. Die optimale Einsatzzeit kann jedoch vor dem ISCA-Experiment getestet werden, indem natürliche Gemeinschaften mit den geladenen Chemikalien geändert und die Anzahl der Zellen im Laufe der Zeit quantifiziert werden.</li>
		<li>Entfernen Sie das Gehäuse aus dem Wasser. Legen Sie es über einen Behälter, so dass das Wasser aus dem Gehäuse abgelassen werden kann.</li>
		<li>Entfernen Sie den oberen Teil des Klebebandes sehr sanft von den vorderen Löchern. HINWEIS: Der Wasserfluss, der das Gehäuse verlässt, muss mit einer Tropfengeschwindigkeit sein. Fahren Sie ein Loch nach dem anderen fort, von der Oberseite des Gehäuses bis zum Boden. Es sollte etwa 10–15 min dauern, um das Gehäuse vollständig zu entleeren.</li>
		<li>Sobald die Wasserlinie unter der Oberseite des ISCA verläuft, entfernen Sie den unteren Stecker und entleeren Sie den Rest des Wassers.</li>
		<li>Während die ISCAs noch am Gehäuse befestigt sind, entfernen Sie vorsichtig das Wasser, das auf der OBERSEITE der ISCA gefangen ist, mit einer 1 ml Pipette.</li>
		<li>Entfernen Sie den ISCA, ohne die obere Oberfläche zu berühren, und entfernen Sie mit einem Einwegtuch die verbleibende Flüssigkeit auf der Oberfläche. HINWEIS: Es ist wichtig, die Ports während dieses Prozesses nicht zu berühren, da die daraus resultierenden Druckänderungen Massenbakterien in den Brunnen entfernen oder hinzufügen können und die Bakterienzahlen verzerrt.</li>
		<li>Rufen Sie die Beispiele aus der ISCA ab, indem Sie Schritt 1.5.1 wiederholen.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Nachgelagerte Anwendungen
HINWEIS: Volumes werden basierend auf einer 550-L-Probe (eine Zeile eines ISCA) angegeben.
<ol><li>Fix ieren Sie 100 l Brunnengehalt mit Glutaraldehyd (2% Endkonzentration) für die Durchflusszytometrie, um Chemotaxis zu jedem Lockmittel zu quantifizieren. HINWEIS: Auf Eis (oder bei 4 °C) aufbewahren und die Proben am selben Tag analysieren. Alternativ können Proben nach der Fixierung in flüssigem Stickstoff eingefroren werden, wenn eine Analyse am selben Tag nicht möglich ist. Durchflusszytometrie ist die empfohlene Methode, um die Anzahl der Zellen in den ISCA-Brunnen zu quantifizieren, da sie einfach, schnell und genau ist12.</li>
	<li>Snap Freeze 300 l Brunnengehalt in flüssigem Stickstoff für die nachfolgende DNA-Extraktion und -Analyse11. HINWEIS: Bewahren Sie die Proben bis zur Analyse bei -80 °C auf.</li>
	<li>Fügen Sie 90 L Well-Inhalt zu 10 l TE-Glyzerinpuffer hinzu und fangen Sie die Proben für die einzellige Genomik13ein.</li>
	<li>Auf Agarplatten, die das gewünschte Medium für die bakterielle Isolierung enthalten, 10–20 l verteilen.</li>
</ol>

<ol><li>Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+microbes+see+a+sea+of+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Marine microbes see a sea of gradients.</a> Science. 338, 628-633 (2012).</li>
<li>Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microbial+motility+and+chemotaxis+in+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).</li>
<li>Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repulsion+of+bacteria+from+marine+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Repulsion of bacteria from marine surfaces.</a> Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).</li>
<li>Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+toward+phytoplankton+drives+organic+matter+partitioning+among+marine+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria.</a> PNAS. 113, 1576-1581 (2016).</li>
<li>Matilla, M., Krell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+bacterial+chemotaxis+on+host+infection+and+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity.</a> FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).</li>
<li>Adler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis in bacteria.</a> Science. 153, 708-716 (1966).</li>
<li>Adler, J., Dahl, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+measuring+the+motility+of+bacteria+and+for+comparing+random+and+non-random+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility.</a> Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).</li>
<li>Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for bacterial chemotaxis.</a> Integrative Biology. 2, 604-629 (2010).</li>
<li>Hol, F. J. H., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zooming+in+to+see+the+bigger+picture%3A+microfluidic+and+nanofabrication+tools+to+study+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zooming in to see the bigger picture: microfluidic and nanofabrication tools to study bacteria.</a> Science. 346, 1251821(2014).</li>
<li>Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+expanding+the+frontiers+of+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology.</a> Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).</li>
<li>Lambert, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics-based+in+situ+chemotaxis+assay+to+study+the+behaviour+of+aquatic+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities.</a> Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).</li>
<li>Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+cell+cycle+analysis+of+natural+populations+of+marine+picoplankton+by+flow+cytometry+using+the+nucleic+acid+stain+SYBR+Green+I%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I.</a> Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+genomes+from+uncultivated+environmental+microorganisms+using+FACS-based+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics.</a> Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).</li>
<li>Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGaworzewska%2C+ET+%22Microbiology%22">Microbiology</a>. , (1982).</li>
<li>Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+exudation+and+rhizosphere+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Root exudation and rhizosphere biology.</a> Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Auf der Skala der aquatischen Mikroorganismen ist die Umwelt bei weitem nicht homogen und ist oft durch physikalische/chemische Gradienten gekennzeichnet, die mikrobielle Gemeinschaften1,15strukturieren. Die Fähigkeit von motilen Mikroorganismen, Verhalten (d.h. Chemotaxis) zu verwenden, erleichtert die Nahrungsaufnahme innerhalb dieser heterogenen Mikroumgebungen1. Das Studium von Chemotaxis direkt in der Umwelt hat das Potenzial, wichtig...

Verschiedene Mikroorganismen verwenden Beweglichkeit und Chemotaxis, um lückenhafte Nährstoffumgebungen auszubeuten, Wirte zu finden oder schädliche Bedingungen zu vermeiden1,2,3. Diese mikrobiellen Verhaltensweisen können wiederum die Raten der chemischen Transformation beeinflussen4 und symbiotische Partnerschaften in terrestrischen, Süßwasser- und marinen Ökosystemen fördern2,5.
Chemotaxis wurde in den letzten 60 Jahren unter Laborbedingungen ausgiebig untersucht6. Die erste quantitative Methode zur Untersuchung von Chemotaxis, der Kapillar-Assay, beinhaltet ein Kapillarrohr, das mit einem vermeintlichen Chemolockant gefüllt ist, das in eine Suspension von Bakterien eingetaucht ist6. Die Diffusion der Chemikalie aus dem Rohr erzeugt einen chemischen Gradienten, und chemotaktische Bakterien reagieren auf diesen Gradienten, indem sie in die Röhre7wandern. Seit der Entwicklung des Kapillar-Assays, der heute noch weit verbreitet ist, wurden viele andere Techniken entwickelt, um Chemotaxis unter zunehmend kontrollierten physikalisch-chemischen Bedingungen zu untersuchen, wobei die jüngste mit der Verwendung von Mikrofluidik8,9,10.
Mikrofluidik, zusammen mit Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie, ermöglicht die Verfolgung des Verhaltens einzelner Zellen als Reaktion auf sorgfältig kontrollierte Gradienten. Obwohl diese Techniken unser Verständnis von Chemotaxis erheblich verbessert haben, wurden sie auf den Einsatz im Labor beschränkt und übersetzen sich nicht leicht in den Einsatz in Umweltsystemen. Infolgedessen wurde die Fähigkeit natürlicher Bakteriengemeinschaften, Chemotaxis in natürlichen Ökosystemen zu verwenden, nicht untersucht; Daher ist das derzeitige Verständnis der potenziellen ökologischen Bedeutung von Chemotaxis auf künstliche Laborbedingungen und eine begrenzte Anzahl von laborkultivierten bakteriellen Isolaten ausgerichtet. Die kürzlich entwickelte ISCA überwindet diese Einschränkungen11.
Die ISCA baut auf dem allgemeinen Prinzip des Kapillar-Assays auf; Es nutzt jedoch moderne Mikrofabrikationstechniken, um eine hochgradig replizierte, leicht einsetzbare experimentelle Plattform für die Quantifizierung von Chemotaxis zu Verbindungen zu liefern, die für die natürliche Umwelt von Interesse sind. Es ermöglicht auch die Identifizierung und Charakterisierung von chemotaktischen Mikroorganismen durch direkte Isolierung oder molekulare Techniken. Während das erste Arbeitsgerät selbstgefertigt und aus Glas und PDMS11gebaut wurde, besteht die neueste spritzgegossene Version aus Polycarbonat, wobei ein hochstandardisiertes Herstellungsverfahren verwendet wird (für Interesse an der neuesten Version des Geräts können die entsprechenden Autoren kontaktiert werden).
Der ISCA ist Kreditkartengröße und besteht aus 20 Brunnen, die in einem 5 x 4-Well-Array verteilt sind, die jeweils durch einen kleinen Port (800 m Durchmesser) mit der äußeren aquatischen Umgebung verbunden sind. Abbildung 1). Vermeintliche Chemoattractants, die über den Hafen in die Brunnen geladen werden, diffundieren in die Umgebung, und chemotaktische Mikroben reagieren, indem sie durch den Hafen in den Brunnen schwimmen. Da viele Faktoren das Ergebnis eines ISCA-Experiments in der natürlichen Umgebung beeinflussen können, wird dieses Schritt-für-Schritt-Protokoll neuen Benutzern helfen, potenzielle Hürden zu überwinden und effektive Bereitstellungen zu erleichtern.

<table><tbody><tr><td>Acrylkleber</td><td>Evonik</td><td>1133</td><td>Acrifix 1S 0116</td></tr><tr><td>Acrylplatte</td><td>McMaster-Carr</td><td>8505K725</td><td>Oder andere Firma</td></tr><tr><td>Klebeband</td><td>Scotch</td><td>3M 810</td><td>Scotch Magic Band</td></tr><tr><td>Autoklav</td><td>Systec</td><td>D-200</td><td>Oder andere</td></tr><tr><td>Firma Tischzentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>75002451</td><td>Oder andere Firma</td></tr><tr><td>Bungee-Seil</td><td>Paracord Planet</td><td>667569184000</td><td>oder anderes Unternehmen</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen - 2 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BR780546-500EA</td><td>Eppendorf Röhrchen</td></tr><tr><td>Konisches Zentrifugenröhrchen - 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>11507411</td><td>Falcon Röhrchen</td></tr><tr><td>Konisches Zentrifugenröhrchen - 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>10788561</td><td>Falcon Röhrchen</td></tr><tr><td>Entfaltungsarm</td><td>Irwin</td><td>1964719</td><td>Oder andere</td></tr><tr><td>Firma Einsatz Gehäusestecker</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-4</td><td>Alternativen im Manuskript ansehen</td></tr><tr><td>Einwegwischer</td><td>Kimtech - Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>Beckman</td><td>C09756</td><td>CYTOFlex</td></tr><tr><td>Glutaraldehyd 25%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td>Oder anderes Unternehmen</td></tr><tr><td>Grüner Fluoreszenzfarbstoff</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9430</td><td>SYBR Grün I - 1:10.000 Endverdünnung</td></tr><tr><td>Hydrophile GP-Filterpatrone - 0,2 & Mikro; m</td><td>Merck</td><td>C3235</td><td>Sterivex Filter</td></tr><tr><td>In Situ Chemotaxis Assay (ISCA)</td> <td>–</td><td></td> <td>Korrespondierende Autoren kontaktieren</td></tr><tr><td>Laserschneider</td><td>Epilog Laser</td><td>Fusion pro 32</td><td>Oder andere Firma</td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022</td><td>Oder andere Firma</td></tr><tr><td>Marine Broth 2216</td><td>VWR</td><td>90004-006</td><td>Difco</td></tr><tr><td>Nylon Flachkopfschrauben</td><td>mit Schlitz McMaster-Carr</td><td>92929A243</td><td>M 2 & 4 & 8 mm</td></tr><tr><td>Pipettensatz</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-403-151</td><td>Oder</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen anderer Firma - 1 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-2A</td><td>Oder</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen anderer Firma - 20 & Mikro; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-4</td><td>Pipettenspitzen anderer Hersteller</td></tr><tr><td>- 200 &micro; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-1</td><td>Oder andere Firma</td></tr><tr><td>Meersalz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9883</td><td>Für künstliches Meerwasser</td></tr><tr><td>Serologische Pipette - 50</td><td>mL Sigma Aldrich</td><td>SIAL1490-100EA</td><td>Oder andere Firma</td></tr><tr><td>Spritzenfilter - 0,02 &micro; m</td><td>Whatman</td><td>WHA68091002</td><td>Anatop Filter</td></tr><tr><td>Spritzenfilter - 0,2 & Mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>10695211</td><td>Oder andere Firma</td></tr><tr><td>Spritzennadel 27G</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710004020</td><td>0,4 & mal 12 mm</td></tr><tr><td>Spritzen - 1 mL</td><td>Codau</td><td>329650</td><td>Insulin Luer U-100</td></tr><tr><td>Spritzen - 10 mL</td><td>BD</td><td>303134</td><td>Oder andere Firma</td></tr><tr><td>Spritzen - 50 mL</td><td>BD</td><td>15899152</td><td>Oder andere Firma</td></tr><tr><td>Schlauch Gestell - 15 mL</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V80</td><td>Oder anderes Unternehmen</td></tr><tr><td>Röhrchengestell - 50 mL</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V80</td><td>Oder anderes Unternehmen</td></tr><tr><td>Unbeschichteter Schnellarbeitsstahl Allzweckhahn</td><td>McMaster-Carr</td><td>8305A77</td><td>Oder anderes Unternehmen</td></tr><tr><td>Vakuumfilter - 0,2 &Mikro; m</td><td>Merck</td><td>SCGPS05RE</td><td>Steritop Filter</td></tr></tbody></table>

in situ chemotaxis assay zur untersuchung des mikrobiellen verhaltens in aquatischen Ökosystemen

In Situ Chemotaxis Assay to Examine Microbial Behavior in Aquatic Ecosystems

Mikrobielle Verhaltensweisen wie Motilität und Chemotaxis (die Fähigkeit einer Zelle, ihre Bewegung als Reaktion auf einen chemischen Gradienten zu verändern), sind in den bakteriellen und archaealen Bereichen weit verbreitet. Chemotaxis können in heterogenen Umgebungen erhebliche Vorteile beim Erwerb von Ressourcen mit sich bringen. Es spielt auch eine entscheidende Rolle bei symbiotischen Wechselwirkungen, Krankheiten und globalen Prozessen, wie biogeochemische Radfahren. Aktuelle Techniken beschränken jedoch die Chemotaxis-Forschung auf das Labor und sind im Feld nicht leicht anwendbar. Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für den Einsatz des In-situ-Chemotaxis-Assays (ISCA) vorgestellt, einem Gerät, das eine robuste Abfrage von mikrobiellen Chemotaxis direkt in der natürlichen Umgebung ermöglicht. Die ISCA ist ein mikrofluidisches Gerät, das aus einem 20-Well-Array besteht, in das Chemikalien von Interesse geladen werden können. Einmal in wässrigen Umgebungen eingesetzt, diffundieren Chemikalien aus den Brunnen und erzeugen Konzentrationsgradienten, die Mikroben spüren und darauf reagieren, indem sie über Chemotaxis in die Brunnen schwimmen. Der Brunneninhalt kann dann beprobt und verwendet werden, um (1) die Stärke der chemotaktischen Reaktionen auf bestimmte Verbindungen durch Durchflusszytometrie zu quantifizieren, (2) isolierbare und kulturresponsive Mikroorganismen zu isolieren und (3) die Identität und das genomische Potenzial der antwortenden Populationen durch molekulare Techniken zu charakterisieren. Die ISCA ist eine flexible Plattform, die in jedem System mit wässriger Phase eingesetzt werden kann, einschließlich Meeres-, Süßwasser- und Bodenumgebungen.

Dieser Abschnitt stellt Laborergebnisse mit der ISCA vor, um die chemotaktische Reaktion von Marinemikroben auf einen Konzentrationsbereich von Glutamin zu testen, einer Aminosäure, die bekanntermaßen Bodenbakterien anzieht14. Die Konzentration von Glutamin, die die stärkste chemotaktische Reaktion in den Labortests auslöste, wurde verwendet, um einen Chemotaxis-Assay in der Meeresumwelt durchzuführen.
Zur Durchführung der Labortests wurden Meerwassergemeinschaften, die...

Hier wird das Protokoll für einen In-situ-Chemotaxis-Assay vorgestellt, ein kürzlich entwickeltes mikrofluidisches Gerät, das Studien des mikrobiellen Verhaltens direkt in der Umwelt ermöglicht.

In Situ Chemotaxis Assay zur Untersuchung des mikrobiellen Verhaltens in aquatischen Ökosystemen

Microbial behaviors, such as motility and chemotaxis (the ability of a cell to alter its movement in response to a chemical gradient), are widespread ...

Unser Protokoll ermöglicht es uns, mikrobielle Chemotaxis direkt in ihrem Lebensraum robust zu quantifizieren. Und so können wir Mikroorganismen isolieren und das metabolische Potenzial besser quantifizieren und verstehen. Der In-situ-Chemotaxis-Assay, kurz ISCA, ist ein flexibles, benutzerfreundliches und einfaches Gerät, das neue Einblicke in mikrobielle Verhaltensweisen und damit die Rolle und Funktion von Mikroorganismen in jeder Umgebung mit einer flüssigen Phase ermöglicht.Das Verfahren für den Einsatz sowohl im Labor als auch vor Ort demonstriert Estelle Clerc, die derzeit Doktorandin in meiner Forschungsgruppe ist. Vor der Zubereitung des Chemolockanten das Medium mit einem 0,2 Mikrometer Filter filtern und die gefilterte Lösung autoklavieren. Als nächstes bereiten Sie eine 10 Millimolar Lösung von Chemoattractant in 1 Milliliter des sterilen Mediums vor, und filtern Sie die Chemoattraktionslösung mit einem 0,2 Mikrometer Spritzenfilter, um Partikel und mögliche Verunreinigungen zu entfernen.Anschließend die gefilterte Chemolock-Stammlösung in Reihe verdünnen, nach dem experimentellen Protokoll. Um eine ISCA zu füllen, befestigen Sie eine 27-Spur-Nadel an einer 1 Milliliter-Spritze und laden Sie eine Spritze für jede Konzentration des gefilterten Chemoattractants. Halten Sie das Gerät mit dem Nachoben zeigenden Port, injizieren Sie langsam jede Konzentration der Substanz in jede der fünf Brunnen einer Reihe des Geräts, bis ein kleines Tröpfchen über jedem Port erscheint.Wenn alle Brunnen gefüllt sind, übertragen Sie 1,5 Milliliter der Meeres- oder Süßwasserbakterienkultur von Interesse in 150 Milliliter des entsprechenden Bakterienkulturmediums. Als nächstes legen Sie zwei kleine Stücke doppelseitigen Klebebandes auf die flache Oberfläche eines 200 Milliliter-Trays. Und sichern Sie eine ISCA auf jedem Stück Klebeband.Mit einer 50 Milliliter serologischen Pipette füllen Sie langsam die Einsatzschale mit der bakteriellen Lösung. Und lassen Sie die Bakterien auf den Chemoattractant von Interesse für eine Stunde reagieren. Um die Analyse zu beenden, verwenden Sie eine neue 50-Milliliter-Pipette, um das Medium vorsichtig aus dem ISCA-Fach zu entfernen.Um die Samples abzurufen, positionieren Sie zuerst die ISCA, sodass der Port nach unten zeigt. Als nächstes verwenden Sie eine sterile 1 Milliliter Spritze mit einer 27-Spur-Nadel, um die Lösung aus jedem Brunnen zu ziehen. Ziehen der Proben aus jeder Reihe der gleichen Konzentration in ein einzelnes Rohr.Analysieren Sie dann die Proben durch Durchflusszytometrie, um die Anzahl der Bakterien zu bestimmen, die von jeder Chemoattraktionskonzentration angezogen werden. Um eine ISCA für den Einsatz vor Ort vorzubereiten, sammeln Sie zunächst 5 Milliliter Wasser pro ISCA von der Feldseite und filtern Sie das Wasser durch einen 0,2-Mikrometer-Spritzenfilter in ein 50 Milliliter konisches Rohr. Die Spritze gefiltertes Wasser zweimal durch eine hydrophile GP-Filterpatrone passieren und das Filtrat nach jeder Spülung in einem neuen 50-Milliliter-Konikulentenrohr einsammeln.Filtern Sie das Wasser dann durch einen 0,02 Mikrometer Spritzenfilter in ein neues 50-Milliliter-Rohr. Verwenden Sie Aliquots des Filtrats, um alle Chemoattraktivitätsvon Interesse auf die gewünschten Konzentrationen in einzelnen 15 Milliliter konischen Röhren wieder auszusetzen. Dann verwenden Sie 10 Milliliter Spritzen, um die resuspendierten Chemoattractants durch einzelne 0,2 Mikrometer Spritzenfilter in sterile 15 Milliliter konische Zentrifugenrohre zu filtern, um unerwünschte Partikel oder wasserunlösliche Verbindungen zu entfernen.Schrauben Sie für den ISCA-Feldeinsatz jede ISCA auf Stück 9 des Gerätegehäuses und schließen Sie das Gehäuse. Versiegeln Sie das Gehäuse mit Klebeband und verwenden Sie Bungee-Kabel, um das Gehäuse an einem Einsatzarm und einer vom Menschen hergestellten Struktur zu befestigen. Alternativ kann das Gehäuse mit einem geringen Gewicht auf einem flachen Substrat gesichert oder an einem Netz im pelagischen Ozean befestigt werden.Tauchen Sie das Gehäuse vollständig ein, um die Füllung zu starten, und halten Sie das Gehäuse fest, um übermäßige Wasserbewegungen im Inneren zu verhindern. Sobald der Wasserstand die Oberseite des Gehäuses erreicht hat, stellen Sie sicher, dass keine Luft im Inneren eingeschlossen ist. Wenn das Gehäuse vollständig voll ist, versiegeln Sie die unteren und oberen Löcher mit zwei Steckern.Dann lassen Sie die ISCA für 1 bis 3 Stunden an Ort und Stelle. Entfernen Sie am Ende der Probenahmezeit das Gehäuse aus dem Wasser. Legen Sie das Gehäuse über einen Behälter, um das Wasser abzuleiten, und entfernen Sie vorsichtig den oberen Teil des Klebebandes von den vorderen Löchern.Sobald die Wasserleitung unter der Oberseite des ISCA passiert ist, entfernen Sie den unteren Stecker und entleeren Sie den Rest des Wassers. Während die ISCAs noch am Gehäuse befestigt sind, verwenden Sie eine 1 Milliliter Pipette oder eine 1 Milliliter Spritze, um das auf jeder ISCA eingeschlossene Wasser sorgfältig zu entfernen und die ISCAs zu entfernen, ohne die obere Oberfläche zu berühren. Verwenden Sie dann ein Einweg-Wischtuch, um die verbleibende Flüssigkeit auf der Oberfläche zu entfernen, und holen Sie die Proben ab, wie für die Laborprobenabrufung demonstriert.In dieser repräsentativen In-vitro-Analyse wurde 1 Millimolar als die optimale Glutamin-Einsatzkonzentration bestimmt, da es eine signifikante chemotaktische Reaktion induzierte, die 18-fach höher war als die gefilterte Meerwasserkontrolle. Höhere und niedrigere Konzentrationen von Glutamin induzierten auch signifikante, aber schwächere, chemotaktische Reaktion. In dieser Feldeinsatzanalyse wurden fünf ISCA-Replikationen, gefüllt mit 1 Millimolar-Glutamin, für eine Stunde an einem Küstenort in der Nähe von Sydney, Australien, eingesetzt.Und die mit Glutamin gefüllte ISCA zog fast dreimal mehr Bakterien an als die mit gefiltertem Meerwasser gefüllten Kontrollbrunnen. Das Wichtigste, was Sie bei der Bereitstellung der ISCA sowohl im Labor als auch vor Ort beachten sollten, ist, starke Flüssigkeitsströme zu vermeiden, die Chemotaxis verhindern. ISCA-abgeleitete Proben können verwendet werden, um bestimmte Organismen oder Gene zu identifizieren, das genomische Potenzial von chemotaktischen Organismen zu charakterisieren und bestimmte Stämme auf selektiven Medien gezielt zu isisolationen.

in-situ-chemotaxis-assay-to-examine-microbial-behavior-aquatic

Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Die Herstellung von mikrofluidischen Kanälen und deren Umsetzung in Experimenten zur Untersuchung der chemotaktischen Jagdverhalten von marinen Mikroben innerhalb eines lückenhaft Nährstoff seascape und das Schwimmverhalten der Bakterien innerhalb Scherströmung beschrieben sind.

Chemotaktische Reaktion der marinen Mikroorganismen zu Micro-Scale Nutrient Layers

Studium der bakteriellen Chemotaxis Mit Mikrofluidik - Interview

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