Name: Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) in Kartoffeln. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Erfahren Sie die virusbasierte microRNA-Silencing-Methode mit PVX zur funktionellen Charakterisierung endogener microRNAs in Kartoffeln. Dieses effiziente System ermöglicht schnelle Analysen ohne stabile Pflanzentransformation.

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Wir danken Dr. Yule Liu von der Tsinghua University für die Bereitstellung des PVX-LIC-Vektors. Diese Arbeit wurde von einem Start-up-Fonds der Texas A&M AgriLife Research und dem Hatch Project TEX0-1-9675 des USDA National Institute of Food and Agriculture an JS unterstützt.

1. Wachsen Sie Kartoffelpflanzen.
<ol><li>Vermehrung von In-vitro-Kartoffelpflanzen in Kulturröhrchen (25 x 150 mm) mit Murashige und Skoog (MS) Medien plus Gamborg-Vitamin (MS-Basalsalzmischung, Gamborg-Vitamin, 30 g/L Saccharose, 3,5 g/L Agar, pH = 5,7). Platzieren Sie die Röhren im Wachstumsraum unter 20–22 °C, 16 h Licht/8 h dunkler Photoperiode und einer Lichtintensität von 120 μmol/m2∙s1. HINWEIS: Neue Triebe und Wurzeln entwickeln sich normalerweise in 1-2 Wochen aus Pflanzen. Vermehren Sie jeden Monat Pflanzen mit frischen MS / Gamborg-Vitaminmedien.</li>
	<li>Vier Wochen später transplantieren Sie In-vitro-Pflanzen in den Boden und züchten sie in einem Gewächshaus unter 20–22 °C, 16 h Licht/8 h Dunkler Photoperiode und einer Lichtintensität von 120 μmol/m2∙s1. HINWEIS: Die Pflanzen mit neu entwickelten Wurzeln und Blättern sind zum Umpflanzen geeignet. Halten Sie die Feuchtigkeit für die frisch umgepflanzten Pflanzen für die ersten 3-4 Tage aufrecht.</li>
</ol>2. Konstruiere die VbMS-Vektoren.
<ol><li>Entwerfen und klonen Sie die kurzen Tandem-TM-Moleküle (STTM, Abbildung 1)22,53 für die interessierende miRNA. HINWEIS: Erfassen Sie miRNA-Sequenzen basierend auf experimentellen Daten oder aus der miRbase-Datenbank54,55,56,57,58,59. Die in dieser Studie verwendete miR166-Sequenz wurde bereits beschrieben60.<ol>
<li>Entwerfen Sie das TM-Modul, indem Sie eine Mismatch-Sequenz, normalerweise 5'-CTA-3', in die reverse Komplementsequenz der miRNA an der Stelle einfügen, die den 10.–11. Nukleotiden der miRNA entspricht. HINWEIS: Zum Beispiel ist die Stu-miR160-Sequenz 5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCC-3'61, wobei die 10.–11. Nukleotide fett gedruckt sind. Die umgekehrte Komplementsequenz (in Desoxynukleotiden) ist 5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' und die Mismatch-Bulge-Insertionsstelle ist fett dargestellt. Die TM-Molekülsequenz (Desoxynukleotid) sollte 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3' sein.</li>
		<li>Entwurfsprimer für das Klonen des STTM-Fragments (Abbildung 1). Verwenden Sie DNA-Oligonukleotide mit der 48-nt-Spacer-Sequenz als Vorlage für das PCR-Klonen. Der Vorwärtsprimer besteht aus einem LIC1-Linker (5'-CgACgACAAgACCgT-3'), der Vorwärtssequenz des oben für TM entwickelten Moleküls und der partiellen 5'-Sequenz des 48-nt-Abstandhalters (5'-GTTGTTGTTGTTGTTATGGT-3'). Der Reverse Primer besteht aus einem LIC2-Linker (5'-gAggAgAagAgCCgT-3'), der reversen Komplementsequenz des TM-Moleküls und einem partiellen reversen Komplement zur 3'-Sequenz des 48-nt-Spacers (5'-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3'). HINWEIS: Die 48-nt-Abstandshaltersequenz ist 5'-GTTGTTGTTGTTGTTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAGAAT-3'. Zum Beispiel sollte für STTM-miR160 der Vorwärtsprimer 5'-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3' sein; Der Reverse Primer sollte 5'-gAggAgAagAgCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3' lauten (Abbildung 1).</li>
		<li>Amplifizieren Sie das STTM-Fragment in einem Volumen von 50 μL durch PCR unter Verwendung des synthetisierten universellen 48-nt-Abstandhalters als Vorlage und einer High-Fidelity-DNA-Polymerase.<ol>
<li>Richten Sie die PCR-Reaktion ein, indem Sie 0,5 μL jedes Primers (40 μM), 0,5 μL 48-nt-Spacer-Oligo (40 μM), 5 μL 10x PCR-Puffer, 1 μL dNTP-Gemisch (je 10 mM), 0,1 μL High-Fidelity-DNA-Polymerase (10 U/μL) und 43 μL ddH2O auf ein Gesamtvolumen von 50 μL mischen. 94 °C für 3 min, 32 Zyklen von 94 °C für 45 s, 60 °C für 45 s und 72 °C für 60 s.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Reinigen Sie das STTM-Fragment durch Ethanolfällung. Zu den PCR-Produkten werden 2,5 Volumen Ethanol und 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH = 4,0) gegeben. Kräftig mischen und 10 min bei 14.000 x g zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und spülen Sie das Pellet mit 1 ml 70% Ethanol ab. Trocknen Sie das Pellet und lösen Sie es in 20 μL ddH2O auf. HINWEIS: Verwenden Sie DNA-Elektrophorese, um die Amplifikation der STTM-PCR-Produkte zu überprüfen.</li>
		<li>Die T4-DNA-Polymerase-Reaktion auf Eis durch Mischen von 2,5 μL gereinigtem STTM PCR-Produkt, 0,5 μL 10x T4 DNA-Polymerase-Puffer, 0,05 μL 1 M Dithiothreitol (DTT), 0,25 μL 100 mM dATP, 0,1 μL T4-DNA-Polymerase (3 U/μL) und 1,6 μL ddH2O auf ein Gesamtvolumen von 5 μL mischen. und die Produkte 20 min lang bei 75 °C behandeln, um die T4-DNA-Polymerase zu inaktivieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie das PVX-basierte VbMS-Konstrukt vor.<ol>
<li>Verdauung von 5 μg PVX-LIC-Plasmid38 mit 2,5 μL SmaI (20 U/μL) in einem Volumen von 100 μL.</li>
		<li>Den verdauten PVX-LIC-Produkten wird eine gleiche Menge Phenol:Chloroform:Isopropanol (25:24:1, pH = 6,7/8,0) zugesetzt und kräftig vermischt. Zentrifugiere bei 14.000 x g für 10 min und überführe den Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie eine gleiche Menge Chloroform:Isopropanol (24:1) hinzu und wirbeln Sie kräftig. Zentrifuge bei 14.000 x g für 10 min. HINWEIS: Der PVX-LIC-Vektor beherbergt die LIC-Kassette zum Klonen. Die LIC-Kassette des PVX-LIC-Vektors enthält ein ccdB-Gen und ein Chloramphenicol-resistentes Gen und muss im E. coli-Stamm DB3.1 unter Verwendung von LB-Medium, das Kanamycin (50 μg/L) und Chloramphenicol (15 μg/L) enthält, aufrechterhalten/vermehrt werden.</li>
		<li>Den Überstand in ein neues Zentrifugenrohr überführen. 2,5 Volumen Ethanol und 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH = 4,0) zugeben und kräftig mischen. Zentrifugiere bei 14.000 x g für 10 min und entferne den Überstand.</li>
		<li>Spülen Sie das Pellet mit 1 ml 70% Ethanol und wirbeln Sie es kräftig. Zentrifugiere bei 14.000 x g für 10 min und entferne den Überstand. Trocknen Sie das Pellet und lösen Sie das aufgeschlossene PVX-LIC-Plasmid mit 100 μL ddH2O auf.</li>
		<li>Richten Sie die T4-DNA-Polymerase-Reaktion auf Eis ein, indem Sie 2,5 μL verdaute PVX-LIC-Vektor-DNA, 0,5 μL 10x T4-DNA-Polymerase-Puffer, 0,05 μL 1 M DTT, 0,25 μL 100 mM dTTP und 0,1 μL T4-DNA-Polymerase (3 U/μL) in einem Gesamtvolumen von 5 μL mischen. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 °C für 15 min und behandeln Sie die Produkte bei 75 °C für 20 min bis 20 min inaktivieren Sie die T4-DNA-Polymerase.</li>
	</ol></li>
	<li>Klonen Sie die STTM-Sequenz mithilfe einer LIC-Reaktion in den PVX-LIC-Vektor. Mischen Sie die T4 DNA Polymerase-behandelten STTM PCR Produkte (5 μL) und die T4 DNA Polymerase-behandelten PVX-LIC Plasmide (5 μL). 5 min bei 70 °C inkubieren, an einer Rampe von 0,1 °C/s auf 22 °C abkühlen und 30 min mit einer PCR-Maschine bei 22 °C halten. HINWEIS: Verlängern Sie die Inkubationszeit auf über Nacht bei 4 °C, um eine höhere Effizienz des LIC-Klonens zu erreichen.</li>
	<li>5 μL der LIC-Reaktionsprodukte in die E. coli DH5α umwandeln und auf einer LB-Platte mit 50 μg/ml Kanamycin wachsen62,63. Wählen und verifizieren Sie positive Kolonien durch PCR mit den Klonprimern und dem universellen Primer für den PVX-LIC-Vektor, gefolgt von der Sequenzierung.<ol>
<li>Führen Sie eine Kolonie-PCR mit dem Vorwärtsprimer für PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') in Kombination mit dem Reverse Primer für das STTM-Klonen durch, um positive Klone zu identifizieren. Die Größe des PCR-Bandes sollte ~ 300 bp betragen. HINWEIS: Überprüfen Sie die Sequenzen von STTM-Fragmenten anhand der Terminatorzyklussequenzierung64,65.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolieren Sie die PVX-STTM-Plasmide aus den validierten Klonen und wandeln Sie sie in Agrobacterium-Stämme GV3101, GV2260 oder EHA10562,63 um. Verifizieren Sie Agrobacterium-Kolonien durch PCR. HINWEIS: Bestätigen Sie Agrobacterium-Kolonien durch PCR mit dem Forward Primer für PVX-LIC und dem Reverse Primer für das STTM-Klonen.</li>
</ol>3. Führen Sie einen PVX-basierten VbMS-Assay in Kartoffelpflanzen durch.
<ol><li>Verpflanzen Sie 4 Wochen alte In-vitro-Kartoffelpflanzen in den Boden. Die transplantierten Pflanzen werden 3–4 Tage später einem VbMS-Assay unterzogen.</li>
	<li>Impfen Sie Kartoffelpflanzen mit Agrobacterium , das die PVX-STTM-Plasmide enthält. HINWEIS: Für den VbMS-Assay in Kartoffeln werden agrobacterium-vermittelte Infiltration und Zahnstocher-kratzende Inokulation gleichzeitig durchgeführt.<ol>
<li>Picken und impfen Sie positive Transformanten, die PVX-STTM-Vektoren enthalten, in 50 ml flüssige LB mit 50 μg/ml Kanamycin und 50 μg/ml Rifampicin. Wachsen Sie in einem 28 °C Inkubator bei 220 U / min für 16 h bis OD600 = 1,0.</li>
		<li>Gleichzeitig streifen Sie die positiven Agrobacterium-Kolonien auf mindestens zwei neue LB-Platten mit 50 μg/ml Kanamycin und 50 μg/ml Rifampicin und wachsen 1 Tag lang bei 28 °C. Fügen Sie den PVX-LIC38,66-Vektor als Kontrolle und PVX-GFP67,68 zur Überwachung der Virusausbreitung hinzu.</li>
		<li>Sammeln Sie die Agrobacterium-Flüssigkultur durch Zentrifugation bei 3.400 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Agrobacterium-Zellen mit einem gleichen Volumen an Infiltrationspuffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES und 200 μM Acetosyringon, pH = 5,6) resuspendieren und auf OD600 = 1,0 einstellen. Bei Raumtemperatur 6 h inkubieren.</li>
		<li>Infiltrieren Sie die Agrobacterium-Kultur mit einer 1 ml nadellosen Spritze in die Abaxialseite vollständig expandierter Blätter.<ol>
<li>Drehen und halten Sie ein Blatt mit einer Hand und verwenden Sie dann einen Finger, um die Blattlamina von der adaxialen Seite an der Infiltrationsstelle zu stützen. Halten Sie die Spritze mit der anderen Hand senkrecht zur Blattoberfläche und infiltrieren Sie die Agrobacterium-Kultur in die abaxiale Seite der Lamina.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kratzen Sie die Agrobacterium-Kultur von den LB-Platten und kratzen Sie mit einem Zahnstocher an der Stammoberfläche der ersten ein oder zwei Internodien der infiltrierten Kartoffelpflanzen. Kratzen Sie vorsichtig die Epidermis des Stiels. Vermeiden Sie es, durch den Stängel zu stechen, was zu schweren Schäden an den Pflanzen führen kann.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Züchten Sie die infiltrierten Pflanzen bei 22 °C mit einer Photoperiode von 16 h Licht/8 h Dunkelheit und einer Lichtintensität von 120 μmol/m2∙ s1 in einem Gewächshaus. HINWEIS: Phänotypen, die durch miRNA-Silencing verursacht werden, treten normalerweise 2-4 Wochen nach der Aminokulation auf (Abbildung 2, Abbildung 3). Es dauert in der Regel 10-20 Tage, bis der VbMS-Phänotyp nach der Infiltration auftritt. Der VbMS-Phänotyp hängt von den Eigenschaften der spezifischen miRNA- und Zielgene, den Wachstumsbedingungen und den Kartoffelsorten ab.</li>
</ol>4. Führen Sie eine Ausdrucksanalyse durch.
<ol><li>Wenn Phänotypen 2-4 Wochen nach der Aminokulation auftreten, sammeln Sie Gewebe wie Triebe, Blätter, Blüten oder Wurzeln mit Phänotypen aus den VbMS-Pflanzen und Geweben aus den Kontrollpflanzen mit einer Schere. Isolieren Sie die Gesamt-RNAs aus den gesammelten Geweben.</li>
	<li>Überprüfen Sie die RNA-Qualität durch Elektrophorese62,63 und quantifizieren Sie die RNA-Konzentration, indem Sie die OD260-Absorption mit einem Spektralphotometer messen.</li>
	<li>Verwenden Sie stem-loop real-time reverse transcription PCR (RT-PCR), um die miRNA-Expression zu analysieren.<ol>
<li>Entwerfen Sie für bestimmte miRNAs einen Stem-Loop-Reverse-Transkriptionsprimer. Stem-Loop-RT-Primer enthalten ein universelles 5'-Backbone und eine 3' 6-nt-Erweiterung einer spezifischen miRNA. Entwerfen Sie ein 5'-Universal-Backbone (5'- GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3'), das eine Stamm-Loop-Struktur bildet. (Der Großbuchstabe entspricht einer umgekehrt-wiederholten Sequenz und der Kleinbuchstabe dem Schleifenbereich).</li>
		<li>Ein Teil der 5'-Backbone-Sequenz, die eine Schleife bildet, dient als reverse Primer für die nachfolgende PCR-Amplifikation (fett-kursive Sequenz in der Backbone-Sequenz). Fügen Sie eine 6-nt-Erweiterungssequenz hinzu, die umgekehrt komplementär zum 3'-Ende der miRNA ist, das für den Stem-Loop-Primer von Interesse ist, um Spezifität für die umgekehrte Transkription bereitzustellen (ergänzende Abbildung 1A). HINWEIS: Entwerfen Sie den Stem-Loop-Reverse-Transkriptionsprimer, wie von Chen et al.69 und Erika Varkonyi-Gasic et al.70,71,72 beschrieben. Zum Beispiel ist der Stem-Loop Reverse Transcription Primer für Stu-miR160 als 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGCATA-3' konzipiert. Der Stem-Loop Reverse Transkription Primer für die Kartoffel miR165/166 Familie ist als 5'-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGGG(A/G)A-3' konzipiert. (Die fett gedruckten Großbuchstabensequenzen bieten die Spezifität der reversen Transkription für bestimmte miRNAs).</li>
		<li>Richten Sie die Reverse-Transkriptionsreaktion ein, indem Sie 50–200 ng Gesamt-RNA, 1 μL des Stem-Loop-Reverse-Transkriptionsprimers (100 μM), 2 μL 10x Puffer, 0,2 μL RNase-Inhibitor (40 U/μL), 0,25 μL dNTPs (je 10 mM) und 1 μL Reverse Transkriptase (200 U/μL) auf Eis mischen. Nukleasefreies ddH2O zu einem Gesamtvolumen von 20 μL hinzufügen.</li>
		<li>Führen Sie eine umgekehrte Transkription mit dem gepulsten reversen Transkriptionsverfahren durch. Inkubieren Sie das Reverse Transkriptionsreaktionsgemisch bei 16 °C für 30 min, führen Sie einen Temperaturzyklus von 30 °C für 30 s, 42 °C für 30 s und 50 °C für 1 s für insgesamt 60 Zyklen durch und inaktivieren Sie die Reverse Transkriptase durch Inkubation bei 85 °C für 5 min.</li>
		<li>Für die Real-Time-PCR-Analyse der miRNA-Expression entwerfen Sie den Forward-Primer basierend auf der miRNA-Sequenz, schließen jedoch keine Sequenzen ein, die sich mit dem oben entworfenen Stem-Loop-Reverse-Transkriptions-Primer überlappen. Fügen Sie den 5' des Vorwärtsprimers eine 3-7-nt-Erweiterung hinzu, um die Länge, die Schmelztemperatur und den GC-Gehalt zu optimieren (ergänzende Abbildung 1). HINWEIS: Der universelle Reverse Primer ist 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. Zum Beispiel ist der Stem-Loop Reverse Transkription Primer für Stu-miR160 als 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3' konzipiert. Der Stem-Loop Reverse Transcription Primer für die miR165/166-Familie ist 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3'. Die fett gedruckten Sequenzen dienen als 5'-Erweiterungen zur Primer-Optimierung. Die Stem-Loop-Reverse-Transkriptions-Primer und die Real-Time-PCR-Primer für miRNA können mit dem miRNA Primer Design Tool73 entworfen werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthetisieren Sie cDNAs der Ziel-mRNAs mittels Standard-Reverse-Transkriptions-PCR (RT-PCR). Inkubieren Sie das Reverse Transkriptionsreaktionsgemisch bei 37 °C für 60 min und inaktivieren Sie die Reverse Transkriptase durch Erhitzen auf 85 °C für 5 min. HINWEIS: (1) Prognostizieren Sie Ziel-mRNAs mit dem psRNATarget-Programm74, wenn die Ziel-mRNAs nicht bekannt sind. (2) Der universelle Reverse Transcription Primer für mRNA ist ein verankerter Primer 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT</li>
	<li>Richten Sie die real-time PCR-Reaktion sowohl für die miRNA von Interesse als auch für die Ziel-mRNAs ein. Mischen Sie 0,5 μL Template-cDNA, 5 μL 2x real-time PCR-Puffer mit SYBR green, 0,05 μL jedes Forward- und Reverse-Primers (40 μM) und 4,4 μL ddH2O in einem Gesamtvolumen von 5 μL auf Eis.</li>
	<li>Bei 95 °C für 3 min, 40 Zyklen von 95 °C für 3 s und 60 °C für 30 s inkubieren. Führen Sie eine anschließende Schmelzkurvenanalyse wie folgt durch: Inkubieren bei 95 °C für 15 s, Abkühlen auf 60 °C an einer Rampe von 20 °C/s, Halten bei 60 °C für 60 s, Erhitzen auf 95 °C bei einer Rampe von 0,2 °C/s und Halten bei 95 °C für 15 s. Analysieren Sie die Ct-Werte mit den ΔΔCt-Methoden76,77 und zeichnen Sie die Mittelwerte mit Standardfehlern auf. HINWEIS: (1) Die real-time PCR Primer für Ziel-mRNAs können wie beschrieben entworfen werden75. (2) Das Kartoffelpolyubiquitin-10-Gen kann als interne Kontrolle für die Normalisierung in Kartoffeln dienen. Der Vorwärtsprimer für das Kartoffelpolyubiquitin-10-Gen ist 5'-ATGTTGCCTTTCTTATGTGTGGTTG-3' und der reverse Primer 5'-TTATTTATTCACATAAACGACAGTTCAACC-3'. (3) Bei der Real-Time-PCR-Analyse können Kontamination und Primer-Dimer-Bildung zu falsch positiven Ergebnissen führen. Um die unspezifische Amplifikation zu überwachen und die Haftung der Real-Time-PCR-Analyse zu erhöhen, wird empfohlen, Kontrollen ohne Template und Reverse Transkriptase für Real-Time-PCR-Assays einzubeziehen.</li>
</ol>

Wir präsentieren ein PVX-basiertes miRNA-Silencing-System zur Charakterisierung der Funktion von endogenen miRNAs in Kartoffeln durch Integration des STTM-Designs in den PVX-Vektor. Das VbMS-System erwies sich als wirksam bei der Stummschaltung von miRNA165/166 in Kartoffeln, einer hochkonservierten miRNA-Familie über Pflanzenarten hinweg.
Der TM-Ansatz wurde entwickelt, um die Expression von miRNAs auf der Grundlage einer künstlichen miRNA-Zielmimik zu stören, die eine Mismatch-Schleife an de...

Pflanzliche microRNAs (miRNAs) werden als 20–24 nukleotidlange, kernkodierte regulatorische RNAs1 charakterisiert und spielen eine grundlegende Rolle in fast jedem Aspekt pflanzenbiologischer Prozesse, einschließlich Wachstum und Entwicklung2,3, Photosynthese und Metabolismus4,5,6,7, Hormonsynthese und Signalisierung8,9, biotische und abiotische Reaktionen10, 11,12,13 und Nährstoff- und Energieregulierung14,15. Die regulatorischen Rollen von pflanzlichen miRNAs sind gut programmiert und werden typischerweise auf posttranskriptionaler Ebene erfüllt, indem die Ziel-mRNAs entweder gespalten oder translational unterdrückt werden.
Enorme Fortschritte wurden bei der Identifizierung, transkriptionellen Profilerstellung und Zielvorhersage von miRNAs in Kartoffeln gemacht16,17,18,19,20,21. Die funktionelle Charakterisierung von miRNAs in Pflanzen, einschließlich Kartoffeln, ist jedoch aufgrund des Mangels an effizienten und hochdurchsatzigen genetischen Ansätzen hinter anderen Organismen zurückgeblieben. Es ist eine Herausforderung, eine funktionelle Analyse einzelner miRNA durch Standard-Loss-of-Function-Analyse durchzuführen, da die meisten miRNAs zu Familien mit erheblicher genetischer Redundanz gehören22. Darüber hinaus kann eine einzelne miRNA mehrere Zielgene kontrollieren23 und mehrere verschiedene miRNAs können denselben molekularen Signalweg gemeinsam modulieren24,25. Diese Eigenschaften machen es schwierig, die Funktion einer bestimmten miRNA oder einer miRNA-Familie zu charakterisieren.
Ein Großteil der funktionalen Analyse von miRNAs stützt sich stark auf Ansatzmöglichkeiten mit Funktionsverstärkung, die offensichtliche Einschränkungen aufweisen. Die künstliche miRNA (amiRNA)-Methode nutzt die endogenen primären Transkripte (pri-miRNAs), um miRNAs auf hohem Niveau zu produzieren, was zu einer Hemmung der Zielgenexpression führt26,27,28,29. Aktivierungsmarkierung und miRNA-Überexpression unter Verwendung eines starken konstitutiven 35S-Promotors führen jedoch häufig zu einer erhöhten Expression von miRNAs, die nicht repräsentativ für In-vivo-Bedingungen sind und daher möglicherweise nicht die endogene Funktion von miRNAs widerspiegeln30. Es wurde ein alternativer Ansatz entwickelt, der die Expression von miRNA-resistenten Formen von Zielgenen beinhaltet, die unreibbare Mutationen in den Bindungs- und/oder Spaltungsstellen enthalten31,32,33. Dieser Ansatz kann jedoch auch zu einer Fehlinterpretation des Phänotyps führen, der vom miRNA-resistenten Zieltransgen aufgrund transgener Artefakte abgeleitet wurde. Daher sollten Schlussfolgerungen aus diesen Untersuchungen zum Funktionsgewinn mit Vorsicht gezogen werden34. Eine weitere große Einschränkung der oben beschriebenen Ansätze besteht darin, dass sie eine Transformation erfordern, die arbeitsintensiv und zeitaufwendig ist. Darüber hinaus sind die transgenabhängigen Ansätze für transform-widerspenstige Pflanzenarten kaum anwendbar. Daher ist es wichtig, einen schnellen und effizienten Loss-of-Function-Ansatz zu entwickeln, um die Funktion von miRNAs zu entschlüsseln.
Um die Voraussetzung des Transformationsverfahrens zu umgehen, wurde ein virusbasiertes microRNA-Silencing (VbMS) etabliert, indem die Target-Mimic-Strategien (TM) mit virus-abgeleiteten Vektoren kombiniert werden. Im VbMS-System werden künstlich konstruierte TM-Moleküle vorübergehend von einem Virus-Backbone exprimiert und bieten ein leistungsfähiges, hochdurchsatzreiches und zeitsparendes Werkzeug, um die Funktion von pflanzlichen endogenen miRNAs zu sezieren35,36. VbMS wurde ursprünglich in N. benthamiana und Tomaten mit dem Tabakrasselvirus (TRV)35,36,37 entwickelt und unter Verwendung verschiedener anderer Virusexpressionssysteme auf Arabidopsis, Baumwolle, Weizen und Mais ausgedehnt, darunter Kartoffelvirus X (PVX)38, Baumwollblattknautschvirus (ClCrV)39, Gurkenmosaikvirus (CMV)40,41,42, Chinesisches Weizenmosaikvirus (CWMV)43 , und Gerstenstreifenmosaikvirus (BSMV)44,45.
Die Kartoffel (Solanum tuberosum) ist die viertwichtigste Nahrungspflanze und die am weitesten verbreitete Noncerealpflanze der Welt, vor allem wegen ihres hohen Nährwerts, ihrer hohen Energieproduktion und ihres relativ geringen Inputbedarfs46. Mehrere Eigenschaften der Kartoffel machen sie zu einer attraktiven zweikeimblättrigen Modellpflanze. Es ist eine vegetativ vermehrte polyploide Pflanze mit hoher Auskreuzungsrate, Heterozygotie und genetischer Vielfalt. Bis heute gibt es jedoch keinen Bericht, der die Funktion von miRNAs in Kartoffeln mit VbMS charakterisiert. Hier stellen wir einen ligationsunabhängigen Klonierungs-(LIC)-angepassten Kartoffel-PVX-basierten VbMS-Ansatz vor, um die Funktion von miRNAs in Kartoffelpflanzen zu bewerten38. Wir haben die miR165/166-Familie ausgewählt, um den VbMS-Assay zu veranschaulichen, da die miR165/166-Familie und ihre Ziel-mRNAs und Transkriptionsfaktoren der Klasse III Homöodomänen/Leu-Reißverschluss (HD-ZIP III) umfassend charakterisiert wurden22,47,48. Die HD-ZIP III-Gene sind Schlüsselregulatoren der Meristementwicklung und Organpolarität, und die Unterdrückung der miR165/166-Funktion führt zu einer erhöhten Expression der HD-ZIP III-Gene, was zu pleotropen Entwicklungsdefekten wie reduzierter apikaler Dominanz und abweichenden Mustern der Blattpolarität führt22,35,38,41 . Die leicht scorablen Entwicklungsphänotypen, die mit dem Silencing von miRNA165/166 korrelieren, ermöglichen eine genaue Bewertung der Wirksamkeit des PVX-basierten VbMS-Assays.
In dieser Studie zeigen wir, dass das PVX-basierte VbMS-System die Funktion von miRNAs in Kartoffeln effektiv blockieren kann. Da das PVX-basierte virusinduzierte Gen-Silencing-System (VIGS) in einer Reihe von Kartoffelsorten etabliert wurde49,50,51,52, kann dieser PVX-basierte VbMS-Ansatz wahrscheinlich auf eine breite Palette von diploiden und tetraploiden Kartoffelarten angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>100 &Mikro; M dATP und 100 &micro; M dTTP</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA</td><td>TQAC136</td><td></td></tr><tr><td>3 M Natriumacetat, pH 4,0.</td><td>Teknova, Hollister, CA 95023, USA</td><td></td><td></td></tr>#S0297 <tr><td>Acetosyringon</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>D2666-25G</td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens Stämme: GV3101, GV2260 oder EHA105.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0757-950ML</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid, DMSO</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>D0798-25G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DB3.1</td><td></td><td></td><td>zur Aufrechterhaltung von PVX-LIC und pTRV2e, die das ccdB-Gen enthalten</td></tr><tr><td>E. coli DH5&alpha;</td><td></td><td></td><td>für die Zielkonstrukte, die durch LIC-Klonierung erzeugt</td></tr> wurden <tr><td>Düngemittel: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed</td><td>ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA</td><td>G99260</td><td></td></tr><tr><td>High-Fidelity-PCR-Reagenzien: KAPA HiFi-DNA-Polymerase mit dNTPs</td><td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA, USA</td><td>7958960001</td><td></td></tr><tr><td>Isoamylalkohol</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0944-1L</td><td></td></tr><tr><td>Koptec Pure Ethanol &ndash; 200 Proof</td><td>Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA</td><td>V1005M</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>M0606-250G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>MFCD00149781</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV Reverse Transkriptase</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0253L</td><td></td></tr><tr><td>Nano-Tropfen-Spektrometer: NanoDrop OneC Mikrovolumen-UV-Vis-Spektralphotometer mit Wi-Fi</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Gerät: Bio-Rad MyCycler PCR-System</td><td>Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA</td><td>170-9703</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Gerät: Eppendorf Mastercycler pro</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA</td><td>950030010 pH-Messgerät</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA</td><td>Tischgerät pH / mV Messgerät - 860031</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1), pH 6,7/8,0.</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0883-400ML</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel: Gellan</td><td>Gum Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA</td><td>J63423-A1</td><td></td></tr><tr><td>PVX VIGS Vektor: PVX-LIC</td><td></td><td></td><td>Zhao et al., 2016</td></tr><tr><td>Echtzeit-PCR-Gerät: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>Real-time PCR-Reagenz: KAPA SYBR&reg; FAST qPCR Master Mix (2x) Kit</td><td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA 01887, USA</td><td>7959389001</td><td></td></tr><tr><td>Restriktionsenzym: SmaI</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>R0141S Reagenzien</td><td></td></tr><tr><td>für reverse Transkription: qScript cDNA SuperMix</td><td>Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877, USA</td><td>95107-100</td><td></td></tr><tr><td>RNA-Extraktionskit: E.Z.N.A. Pflanzen-RNA Kit</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA</td><td>Artikelnummer: D3485-01</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Inhibitor Maus</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0314L</td><td></td></tr><tr><td>RNAzol RT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA</td><td>R4533</td><td></td></tr><tr><td>Boden: Metro-Mix 360</td><td>Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA</td><td>Metro-Mix 360</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-Polymerase und Puffer</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0203S</td><td></td></tr></tbody></table>

potato virus x-based microrna silencing (vbms) in kartoffeln.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

Virus-basiertes microRNA-Silencing (VbMS) ist ein schnelles und effizientes Werkzeug zur funktionellen Charakterisierung von microRNAs (miRNAs) in Pflanzen. Das VbMS-System wurde für verschiedene Pflanzenarten entwickelt und angewendet, darunter Nicotiana benthamiana, Tomaten, Arabidopsis, Baumwolle und Monokotyledonen wie Weizen und Mais. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll, das PVX-basierte VbMS-Vektoren verwendet, um endogene miRNAs in Kartoffeln zum Schweigen zu bringen. Um die Expression einer spezifischen miRNA zu unterdrücken, werden Target-Mimic-Moleküle (TM) von miRNA von Interesse entworfen, in pflanzliche Virusvektoren integriert und in Kartoffeln durch Agrobacterium-Infiltration exprimiert, um direkt an die endogene miRNA von Interesse zu binden und ihre Funktion zu blockieren.

Abbildung 2 zeigt die PVX-STTM165/166 Kartoffelpflanzen (Katahdin) mit ektopischem Wachstum von Blattgeweben von der Abaxialseite der Blattlamina entlang der Venen. Schwerere Phänotypen wie trompetenförmige Blattbildung wurden ebenfalls beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde in den PVX-Kontrollanlagen keine phänotypische Anomalie beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass das VbMS-System die endogene miRNA-Funktion in tetraploiden Kartoffelpflanzen wirksam unterdrückte und das PVX-VbMS-System ei...

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll für das auf Kartoffelvirus X (PVX) basierende microRNA-Silencing-System (VbMS) zur funktionellen Charakterisierung endogener microRNAs (miRNAs) in Kartoffeln. Target Mimic (TM) Moleküle von miRNA von Interesse werden in den PVX-Vektor integriert und vorübergehend in Kartoffeln exprimiert, um die Ziel-miRNA oder miRNA-Familie zum Schweigen zu bringen.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) in Kartoffeln.

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...

Der traditionelle Ansatz zur Analyse der Funktion von microRNAs in Pflanzen beruht in erster Linie auf der Erzeugung stabiler Knockdown-Pflanzen. Dieses virusbasierte microRNA-Silencing-System erfordert keine langwierige und zeitaufwändige Transformation. Das virusbasierte microRNA-Silencing ist ein schnelles und effizientes Werkzeug zur funktionellen Charakterisierung von microRNAs in Pflanzen, das auf ein breites Spektrum von diploiden und tetraploiden Kartoffelarten angewendet werden kann.Das Verfahren wird von Jinping Zhao, einem Postdoktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Um das Zielmimikmodul zu entwerfen, fügen Sie eine Mismatch-Sequenz in die umgekehrte Komplementsequenz der interessierenden microRNA an der Stelle ein, die den 10. bis 11. Nukleotiden der microRNA entspricht. Um das kurze Tandemziel-Mimikfragment zu amplifizieren, richten Sie eine PCR-Reaktion mit jedem Primer von Interesse, einem 48-Nukleotid-Raumoligo, einem 10-fachen PCR-Puffer, einer dNTP-Mischung, einer PCR-Polymerase mit hoher Genauigkeit und doppelt destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 50 Mikrolitern ein.Amplifizieren Sie dann die microRNA durch Standard-PCR unter Verwendung der angegebenen Parameter. Um die kurzen Tandemziel-Imitatoren zu reinigen, fügen Sie dem PCR-Produkt 2,5 Volumen Ethanol und ein 1/10 Volumen drei molare Natriumacetate hinzu. Kräftig mischen, bevor die Reaktion 10 Minuten lang bei 14.000 mal G zentrifugiert wird.Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, spülen Sie das Pellet mit einem Milliliter 70%igem Ethanol ab und lassen Sie das Pellet trocknen, dann lösen Sie das Pellet in 20 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser auf. Um eine T4-DNA-Polymerase-Reaktion in Gang zu setzen, mischen Sie das gereinigte PCR-Produkt mit kurzem Tandemziel-Imitat mit 10-fachem T4-DNA-Polymerase-Puffer, einem molaren Dithiothreitol, 100 Millimolar dATP, T4-DNA-Polymerase und doppelt destilliertem Wasser zu einem Endvolumen von fünf Mikrolitern auf Eis. Dann inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, gefolgt von einer 20-minütigen Inkubation bei 75 Grad Celsius, um die T4-DNA-Polymerase zu inaktivieren.Um das PVX-basierte VBMS-Konstrukt herzustellen, verdauen Sie fünf Mikrogramm PVX-ligationsunabhängige Klonierungsplasmide mit 2,5 Mikrolitern SMA1 in einem Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern. Geben Sie ein gleiches Volumen an Phenol zu Chloroform zu Isoamylalkohol, fügen Sie den verdauten PVX-ligationsunabhängigen Klonierungsprodukten ein Verhältnis von 25 zu 24 zu eins mit kräftigem Mischen hinzu und sammeln Sie das Produkt durch Zentrifugation. Es wird ein gleiches Volumen Chloroform zu Isoamylalkohol im Verhältnis 24 zu eins zum Überstand mit Vortexing gegeben, bevor der Röhrcheninhalt einer zweiten Zentrifugation unterzogen wird.Am Ende des Schleuderns wird der Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt und 2,5 Volumen Ethanol und ein 1/10 Volumen drei molare Natriumacetate unter kräftigem Mischen hinzugefügt. Zentrifugieren Sie das Röhrchen und spülen Sie das Pellet mit einem Milliliter 70%igem Ethanol und kräftigem Vortexen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen erneut und entfernen Sie den Überstand, damit das Pellet an der Luft trocknen kann.Lösen Sie dann das verdaute PVX-Ligations-unabhängige Klonierungsplasmid-Pellet in 100 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser auf. Um die T4-DNA-Polymerase-Reaktion in Gang zu setzen, mischen Sie die verdaute PVX-ligationsunabhängige Klonierungsvektor-DNA mit 10-fachem T4-DNA-Polymerase-Puffer, einem molaren Dithiothreitol, 100 millimolaren dTTP und T4-DNA-Polymerase zu einem Endvolumen von fünf Mikrolitern auf Eis. Dann inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, gefolgt von einer 20-minütigen Inkubation bei 75 Grad Celsius, um die T4-DNA-Polymerase zu inaktivieren.Um die mimische Sequenz des kurzen Tandemziels in den PVX-ligationsunabhängigen Klonierungsvektor zu klonen, mischen Sie fünf Mikroliter des mit T4-DNA-Polymerase behandelten PCR-Produkts mit dem kurzen Tandemziel-PCR-Produkt mit fünf Mikrolitern des mit T4-DNA-Polymerase behandelten PVX-Ligations-unabhängigen Klonierungsplasmids und inkubieren Sie das Gemisch fünf Minuten lang bei 70 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation kühlen Sie den Röhrcheninhalt in einer PCR-Maschine mit einer Geschwindigkeit von 0,1 Grad Celsius pro Sekunde auf 22 Grad Celsius ab und lassen Sie das Röhrchen 30 Minuten lang im Thermocycler, sobald die Zieltemperatur erreicht ist. Am Ende der Inkubation transformieren Sie fünf Mikroliter ligationsunabhängiges Klonierungsreaktionsprodukt in E.coli DH5 alpha unter Verwendung von Standardtransformationsprotokollen und züchten Sie die transformierten Bakterien auf einer LB-Platte, die 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin enthält.Nach der Verifizierung der Sequenzen der kurzen Tandem-Ziel-imitischen Fragmente durch Terminator-Zyklus-Sequenzierung isolieren Sie die PVX VBMS-Plasmide aus den validierten Klonen und transformieren sie in die entsprechenden Agrobacterium-Stämme. Um vier Wochen alte In-vitro-Kartoffelpflanzen mit Agrobacterium zu impfen, das die PVX VBMS-Plasmide enthält, wählen Sie positive Transformanten, die PVX VBMS-Vektoren enthalten, und inokulieren Sie die Transformanten in 50 Millilitern flüssigem LB, das 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin und 50 Mikrogramm pro Milliliter Rifampicin enthält, für 16 Stunden bei 28 Grad Celsius und 220 Umdrehungen pro Minute. Während der Inkubation werden positive Agrobacterium-Kolonien auf mindestens zwei neue LB-Platten mit Kanamycin und Rifampicin gestreift und die Kulturen einen Tag lang bei 28 Grad Celsius gezüchtet.Wenn die optische Dichte bei 600 Nanometern 1,0 erreicht, sammeln Sie die Agrobacterium-Flüssigkultur durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in einem ausreichenden Volumen Infiltrationspuffer, um die optische Dichte bei 600 Nanometern auf 1,0 einzustellen. Nach einer sechsstündigen Inkubation bei Raumtemperatur befüllen Sie eine nadellose Spritze von einem Milliliter mit der Agrobacterium-Suspension und drehen und halten Sie mit einer Hand ein expandiertes Blatt von einer Kartoffelpflanze. Stützen Sie die Blattlamina mit einem Finger von der adaxialen Seite an der gewünschten Infiltrationsstelle ab.Halten Sie die Spritze mit der anderen Hand senkrecht zur Blattoberfläche und infiltrieren Sie 100 bis 200 Mikroliter Agrobacterium-Kultur in die abaxiale Seite der Lamina. Als nächstes sammeln Sie mit einem Zahnstocher Kolonien von den Agrobacterium-Kulturplatten und kratzen die Stängeloberfläche der ersten ein oder zwei Internodien der infiltrierten Kartoffelpflanzen und die Epidermis des Stängels ab, dann züchten Sie die infiltrierten Pflanzen zwei bis vier Wochen lang im Gewächshaus. Wenn Phänotypen auftreten, entnehmen Sie mit einer Schere Proben mit Phänotypen aus dem VBMS und den Kontrollpflanzen.Isolieren Sie die Gesamt-RNA aus dem entnommenen Gewebe und verwenden Sie die reverse Transkriptase-PCR, um die microRNA und die Ziel-mRNA-Expression in jeder Probe zu analysieren. In diesen Bildern ist ein kurzes PVX-Tandemziel von 165/166 Kartoffelpflanzen mit ektopischem Wachstum des Blattgewebes von der abaxialen Seite der Blattlamina entlang der Adern zu sehen. Auch schwerere Phänotypen wie trompetenförmige Blattbildung wurden beobachtet.Im Gegensatz dazu werden bei PVX-Kontrollpflanzen keine phänotypischen Anomalien beobachtet, was zeigt, dass das VBSM-System die endogene microRNA-Funktion in tetraploiden Kartoffelpflanzen wirksam unterdrückt. PVX short tandem target amic 165/166 Kartoffelpflanzen zeigen ein ektopisches Blatt-zu-Gewebe-Wachstum von der abaxialen Seite der Blattlamina entlang der Laminadern, was zeigt, dass das PVX VBMS-System auf andere Kartoffelsorten, einschließlich der wichtigsten Kartoffelsorten, angewendet werden kann. Es ist wichtig, gleichzeitig die Blätter zu infiltrieren und den Stängel derselben Pflanze mit der gleichen Agrobacterium-Kultur zu impfen.Transgene Ansätze zur stabilen Einführung von Ziel-Mimikmolekülen in Kartoffelpflanzen werden empfohlen, wenn der Silencing-Zustand der Ziel-microRNAs in den Nachkommengenerationen aufrechterhalten werden muss.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Beschreibung eines Virus-induzierte Gen-Silencing (VIGS)-Methode für knock-down der Genexpression...

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Agroinfiltration und PVX-Agroinfektion sind routinemäßige funktionelle Assays für die transiente ektopische Expression von Genen in Pflanzen. Diese Methoden sind effiziente Assays in Effektoromik-Strategien (schnelle Resistenz und Avirulenz-Gen-Entdeckung) und entscheidend für die moderne Forschung in der molekularen Pflanzenpathologie. Sie erfüllen die Nachfrage nach robuster Hochdurchsatz-Funktionsanalyse in Anlagen.

Agroinfiltration und PVX Agroinfektion in Kartoffel und Nicotiana benthamiana

Virus-induzierte Gen-Silencing ist ein nützliches Instrument zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz von Pflanzen beteiligt. Wir demonstrieren die Verwendung von bakteriellen Erregern exprimieren GFPuv identifizieren Gen stumm Pflanzen anfällig Nichtwirt Krankheitserreger. Dieser Ansatz ist einfach, schnell und erleichtert groß angelegte Screening und ähnliches Protokoll zu studieren verschiedene andere Pflanzen-Mikroben-Interaktionen angewendet werden kann.

VIGS-vermittelte Stürmer Genetics Screening zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz Beteiligte

Wir beschreiben hier eine Methode zur Regulierung des Picornavirus-Tropismus, indem Sequenzen, die zu spezifischen microRNAs komplementär sind, in das virale Genom eingebaut werden.  Dieses Protokoll kann an alle verschiedenen Klassen von Viren angepasst werden, wobei es je nach Länge und Art ihres Lebenszyklus modifiziert wird.

MicroRNA-basierten Regulation der Picornavirus Tropism

Hier präsentieren wir Ihnen zwei Protokolle, Kartoffelpflanzen zu verwandeln. Die Agrobacterium Tumefaciens Transformation führt zu einer kompletten transgenen Pflanze Agrobacterium Rhizogenes transgenen behaarte Wurzeln in einem Wildtyp-Shooting produziert, die selbst propagiert werden kann. Wir erkennen dann Promotoraktivität von GUS Färbung in den transformierten Wurzeln.

Agrobacterium Tumefaciens und Agrobacterium Rhizogenes-vermittelte Umwandlung der Kartoffel und die Promotoraktivität eines Suberin-Gens durch GUS Staining

Hier stellen wir ein modifiziertes Screening-Verfahren vor, das ausgiebig eingesetzt werden kann, um RNA-Silencing-Suppressoren bei Pflanzenpathogenen schnell zu überprüfen.

Screening und Identifizierung von RNA-Silencing Suppressoren von sezernierten Effektoren von Pflanzenpathogenen

Diese Methode demonstriert die Verwendung der nördlichen Hybridisierungstechnik, um miRNAs aus dem gesamten RNA-Extrakt zu detektieren.

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

Ein Agrobacterium-basiertes Injektionsprotokoll (Agroinjektion) wird für die Impfung von Fuchsschwanzmosaikvirus und Zuckerrohrmosaikvirusclone in Maissämlinge vorgestellt. Die Impfung auf diese Weise führt zu einer Virusinfektion, einem virusinduzierten Gen-Silencing von Markergenen und einer viralen Überexpression von GFP.

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In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Untersuchung der Rate der programmierten Zelltodinitiierung vor, indem wir inokulierte Blätter nach der Induktion des Zelltods kontinuierlich abbilden.

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Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) in Kartoffeln.

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