Name: In Vitro Mikrofluidic Disease Model zur Untersuchung von Blut-Endothel-Wechselwirkungen und Blutgerinnsungsdynamik in Echtzeit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Erfahren Sie ein mikrofluidisches In-vitro-Krankheitsmodell zur Untersuchung von Blut-Endothel-Wechselwirkungen und Thrombogenität. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Analyse von Gerinnungsdynamik und die Bewertung antikoagulativer Therapien.

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Wir danken Jan Voorberg vom Department of Plasma Proteins, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, Amsterdam UMC, Academic Medical Center, Amsterdam, Niederlande, für seinen Beitrag zu diesem Manuskript. Diese Arbeit wurde von der Niederländischen CardioVascular Alliance (DCVA) [2012-08, 2014-11] unterstützt, die an das Phaedra- und das Reconnect-Konsortium vergeben wurde, sowie vom Impulse-Stipendium 2018, das dem Phaedra IMPACT-Konsortium gewährt wurde. Diese Stipendien umfassen die kollektive Finanzierung durch die Niederländische Herzstiftung, die Niederländische Föderation der Universitätskliniken, die niederländische Organisation für Gesundheitsforschung und -entwicklung und die Königlich Niederländische Akademie der Wissenschaften. Darüber hinaus wurde diese Arbeit vom Europäischen Forschungsrat im Rahmen des Advanced Grant 'VESCEL'-Programms (Grant-Nummer: 669768) finanziert. XDM wird durch ein Forschungsstipendium des Instituts für Kardiovaskuläre Forschung (ICaR-VU) am VU University Medical Center, Amsterdam, Niederlande, gefördert.

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Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Die Gerinnung ist das Ergebnis des komplexen und zeitlich gesteuerten Zusammenspiels zwischen Endothel und Blutbestandteilen. Dieser In-vitro-Test stellt eine Methode zur Untersuchung der thrombogenen Eigenschaften von Endothelzellen in Echtzeit dar. Es können verschiedene Arten von primären menschlichen Endothelzellen verwendet werden, die eine In-situ-Thrombose in einer Organ- und patientenspezifischen Weise erleichtern. In dieser Studie haben wir die Verwendung dieses Protokolls veranschaulicht, in dem die thrombogenen Eigenschaften von PAECs verglichen werden, die von gesunden Spendern isoliert wurden, mit CTEPH-Patienten. Die Bildung von Live Thrombus wurde durch Perfusion von Vollblut von gesunden Probanden über Histamin-aktiviertes Endothel untersucht, während die Wirkung eines DOAC als Antithrombotikum getestet wurde.
Neben der Verwendung kommerziell erhältlicher Mikrokanäle, wie in den repräsentativen Ergebnissen dargestellt, ermöglicht die Einführung der maßgeschneiderten mikrofluidischen Kanäle die Untersuchung des Einflusses von Gefäßgeometrieveränderungen auf die Thrombusbildung. Beispielsweise nimmt der Durchfluss an einem Astpunkt ab, oder die Stenose führt zu einer Erhöhung der Scherspannung und mehr Thrombozytenaktivierung36. Eine wesentliche Einschränkung dieser maßgeschneiderten mikrofluidischen Kanäle ist jedoch die Anforderung hoher Zellzahlen, eine stabile Monoschicht von ECs zu bilden, wie in Schritt 2.3.2 beschrieben. Dies kann einen begrenzenden Faktor darstellen, wenn patientenabgeleitete Zellen knapp sind. Die Stärken der kommerziell erhältlichen Mikrorutschen bestehen darin, dass die Oberflächenflächen für die Zellkultur modifiziert werden und Wachstumsbereiche größer sind, wodurch ECs eine konfluente und stabile Monoschicht bilden können. Auf der anderen Seite wird eine größere Fläche zu einem größeren Lumen führen. Gemäß Gleichung 1erfordert dies höhere Blutmengen, um ähnliche Durchflussraten wie in der maßgeschneiderten Mikrofluidik zu erreichen.
Eine Verbesserung dieses Protokolls könnte darin bestehen, lebende EG-Verluste oder Änderungen der Barriereintegrität zu untersuchen. DER EG-Schaden in diesem Protokoll wird erst am Ende des Experiments gemessen. Für Live-Tracking können ECs mit mCherry VE-cadherin markiert werden, z.B.37. Da dies jedoch ein hochoptimiertes Protokoll mit effizienter Virustransfektion benötigen würde, könnte Electric Cell-Substrat Impedanz-Sensing (ECIS) als Alternative zur Untersuchung der endotheliaalen Integrität und Barrierefunktion38verwendet werden. Die Perfusion über spezielle ECIS-Durchflusskanäle ermöglicht die Längsüberwachung der Endothelbarriereintegrität unter Strömung. Diese spezifischen ECIS-Eigenschaften ermöglichen parallele Messungen der Endothelbarriereeigenschaften und der Thrombusbildung. Alternative Möglichkeiten für parallele EC-Barrieremessungen, insbesondere in den kundenspezifischen Arrays, sind die Verwendung von fluoreszierender Dextrans im Perfusaten, die je nach EG-Barriereeigenschaften aus dem Lumen diffundieren.
Eine Einschränkung des beschriebenen Protokolls ist, dass ECs aus dem menschlichen Körper entfernt und auf Gewebekultur Kunststoff kultiviert werden, die ein steifes, künstliches Substrat ist. Zellen passen sich ihrer biophysikalischen Umgebung an. Dies könnte möglicherweise die endotheliale Reaktion auf die Thrombozytenaktivierung beeinflussen, da es einen Zusammenhang zwischen Thrombozytenaktivierung und Wandsteifigkeit39gibt. Trotz dieser Anpassungen an Kulturkunststoffe behalten Zellen krankheitsspezifische Eigenschaften bei, die im direkten Vergleich mit ECs identifiziert werden können, die von gesunden Spendern abgeleitet wurden, wie mit Kontrolle, CTEPH-PAEC und HUVEC gezeigt, die nach 5 min Blutdurchblutung unterschiedliche Muster der Thrombozytenhaftung und Fibrinablagerung ausübten.
Im Gegensatz zu anderen Protokollen verwendet dieses System Vollblut, während andere die EG-Interaktion mit einer einzigen Blutkomponente wie Blutplättchen und Leukozyten19,20,21untersuchen. Es wurden fortschrittlichere mikrofluidische Modelle entwickelt, die die Untersuchung der endotheliaalen Funktion in einem Gefäßmodell mit einer runden Gefäßgeometrie und weicher extrazellulärer Matrix ermöglichen. Diese sind jedoch mit HUVECs40,41,42optimiert. Die Neuheit des beschriebenen Protokolls ist die Verwendung von primären ECs in Kombination mit Vollblut, die die Modellierung der In-situ-Thrombose einen Schritt näher an in vivo-Bedingungen bringt. Das Protokoll für den Einsatz von patientenabgeleiteten ECs und patientenabgeleitetem Blut optimiert die Krankheitsmodellierung in vitround ermöglicht die Beurteilung der personalisierten Thrombusbildung und medikamentösen Behandlung.
Das beschriebene Protokoll kann angewendet werden, um die Wirkung von Antikoagulationstherapien auf patientenabgeleitete Zellen zu untersuchen. Während wir Dabigatran verwendet haben, um die Thrombusbildung zu hemmen, ist es möglich, andere Antikoagulanzien wie Rivaroxaban zu verwenden, das den Faktor Xa in der Gerinnungskaskade direkt hemmt. Auch Direktplättchenhemmer wie Clopidogrel oder Aspirin können untersucht werden, da diese auf die primäre Phase der Hämostase wirken, in der Thrombozyten an ECs binden. Letztlich können die thrombogenen Kapazitäten patientenspezifischer ECs in Wechselwirkung mit dem eigenen Blut des Patienten genutzt werden, um die persönliche Wirkung der Antikoagulationstherapie auf den einzelnen Patienten vorherzusagen. Darüber hinaus kann ein Knockdown spezifischer Proteine zusätzliche funktionelle Informationen liefern.
Es gibt einige Schritte im beschriebenen Protokoll, die für ein erfolgreiches Perfusionsexperiment entscheidend sind. Erstens ist es bei der Isolierung von Primärzellen notwendig, eine hochreine EG-Kultur zu erhalten. Zweitens ist es wichtig, dass die ECs eine stabile konfluente Monoschicht bilden. Ist dies nicht der Fall, kann eine leichte Änderung der Scherspannung zu Endothelschäden und Aktivierung der Gerinnungskaskade führen, oder Thrombozyten können mit der Bindung an die Kellermembran beginnen, was zu falschen positiven Ergebnissen führt. Drittens ist es wichtig, Luftblasen zu verhindern, da diese das Endothel schädigen und dadurch die Ergebnisse beeinflussen können.
Nach der Verkalkung des citrated Blutes mit Calciumchlorid und Magnesiumchlorid ist es wichtig, sofort mit dem Perfusionsexperiment zu beginnen. Die Verkalkung induziert eine schnelle Reaktion bei der Thrombozytenaktivierung und Thrombusbildung, was zu einer schnellen Gerinnung in der Probe führt.
Abschließend beschreiben wir ein sehr vielseitiges Protokoll zur Untersuchung von Wechselwirkungen mit Blut-endotheliaalen Zellen während der Thrombose.

Das Endothel bildet die innere Zellschicht der Blutgefäße und trennt Blut vom umgebenden Gewebe. Es wurde als dynamisches Organ beschrieben, das seine Mikroumgebung aktiv reguliert und auf äußere Reize reagiert1. Aufgrund seines direkten Kontakts mit fließendem Blut ist das Endothel bei der Kontrolle von Hämostase und Thrombose von entscheidender Bedeutung und ist die primäre Quelle vieler der wichtigsten regulatorischen Moleküle, die Thrombozytenaggregation, Gerinnung und Fibrinolyse steuern2. Gesunde, nicht aktivierte Endothelzellen (EC) produzieren mehrere Moleküle, die der Thrombozytenaktivierung entgegenwirken und die Gerinnung und Thrombusbildung verhindern, um den Blutfluss aufrechtzuerhalten, wie Prostacyclin, Thrombomodulin oder Gewebefaktor-Signalweg-Inhibitor (TFPI)2,3. Dies verhindert die Haftung von Thrombozyten, Thrombozytenaggregation und Thrombusbildung. Die Verletzung oder Aktivierung der Gefäßwand führt zu einem prokoagulanen endothelialen Phänotyp, der lokalisierte Thrombozytenhaftung und Gerinnselbildung2,4initiiert. Bei endotheliale Aktivierungsplättchen haften sie an von Willebrand Factor (VWF), einem multimerischen Protein, das aus ECs freigesetzt wird, oder an exponierten Bindungsstellen der zugrunde liegenden subendotheliaalen Matrix. Anschließend initiieren molekulare Veränderungen in Thrombozyten und die Exposition gegenüber dem Gewebefaktor (TF) die Aktivierung des Gerinnungssystems, das die Thrombusbildung durch Fibrinpolymerisation5,6induziert. Zusammen bildet das resultierende Gerinnsel die Grundlage für den Wundverschluss durch Reendothelialisierung7. Störungen des Gerinnungssystems können zu Blutungsstörungen wie der von Willebrand-Krankheit, Hämophilie oder Thrombose führen, die oft aus einem dysregulierten pro- und antithrombotischen Gleichgewicht des endotheliaalen hämostatischen Weges2,3resultieren.
Der Prozess der Hämostase tritt sowohl in der arteriellen als auch in der venösen Zirkulation auf. Die Mechanismen, die der arteriellen und venösen Thrombose zugrunde liegen, unterscheiden sich jedoch grundlegend. Während die arterielle Thrombose, wie sie bei ischämischen Herzerkrankungen zu beobachten ist, hauptsächlich durch den Bruch einer atherosklerotischen Plaque unter Bedingungen hoher Scherspannung angetrieben wird, entwickelt sich venöse Thrombose meist in Abwesenheit einer endotheliale Verletzung in einem Zustand der Stasi8,9,10. Ein tiefer Venenthrombus kann sich verminnen und in Richtung der Lungenarterien reisen, wo er eine Lungenembolie verursacht. Dies kann zu chronischen gefäßvaskulären Obstruktionen führen, die zu signifikanten Beeinträchtigungen der funktionellen Fähigkeiten führen, die die Entwicklung von chonischen Lungenerkrankungen, einschließlich der Entwicklung von chronischer thromboembolischer pulmonaler Hypertonie (CTEPH)11,12,13,14. CTEPH zeichnet sich durch erhöhten Lungendruck aufgrund von Verstopfungen der Lungenarterien durch thromboembolisches Material nach mindestens drei Monaten Antikoagulationstherapie15aus. Neben Lungenemboli wird postuliert, dass das lungene Endothel eine prothrombotische Umgebung in CTEPH bietet, die in situ Thrombose und chronische Obstruktionen der Lungenarterien erleichtert, was zu einem Anstieg des Blutdrucks führt, der letztlich zu Herzinsuffizienz führen kann, wenn es unbehandelt16,17.
In den letzten Jahren haben verschiedene Studien zur Entwicklung von Assays zur Untersuchung der Thrombusbildung durch Messung der Thrombozytenfunktion und Gerinnung18geführt. Die meisten von ihnen untersuchen jedoch entweder die Wechselwirkung von Vollblut mit einzelnen extrazellulären Matrixkomponenten wie Kollagenoder oder Fibrasen oder die endotheliale Funktion in Wechselwirkung mit einzelnen Blutbestandteilen, wie Endothel-Thrombolet oder Endothel-Leukozyten-Wechselwirkung19,20,21,22. Diese Assays werden am häufigsten mit menschlichen Nabelvenenen-Endothelzellen (HUVEC) durchgeführt, da diese Zellen leicht erhalten werden können. Hämostatische Gene werden jedoch differenziell über den Gefäßbaum, Gefäßtypen und Organsysteme23,24, exprimiert, was die Verwendung von HUVECs zur Darstellung von Endothelzellen, die an arterieller Thrombose oder Lungenembolien beteiligt sind, problematisch macht23.
Neben der EC-Plastizität können krankheitsspezifische hämodynamische Veränderungen und Veränderungen in der Gefäßmorphologie die Thrombusbildung am normalen Endothel25fördern. Höhere Scherraten, z. B. aufgrund lokaler Vasokonstriktionen oder Veränderungen der Gefäßgeometrie, können zu einer akuten Thrombusbildung führen, was zu einer Stenose führt, die die Einstellung des Blutflusses beschleunigt26. Die Verwendung von maßgeschneiderten mikrotechnischen Durchflusskanälen ermöglicht es, speziell Gefäßgeometrien zu entwerfen, die repräsentativ für die (Patho-)Biologie sind. Auf diese Weise ist es möglich, die Wirkung lokaler biomechanischer Kräfte auf gesunde oder erkrankte EC27zu untersuchen.
Es gibt Antikoagulationstherapien für die Ausrichtung auf verschiedene Phasen und Moleküle in der Gerinnungskaskade, die alle besondere Risiken und Vorteile darstellen, die für bestimmte Störungen spezifisch sein können. Der in diesem Papier beschriebene Ansatz der Krankheitsmodellierung eignet sich besonders, um die Auswirkungen verschiedener Antikoagulations- und Thrombozytentherapien auf die Thrombusdynamik zu testen.
Ziel ist es, ein Thrombosemodell zu präsentieren, das primäre ECs umfasst und ein vielseitiges Modell liefert, das für die Analyse verschiedener Formen der Thrombose geeignet ist, abhängig von der Art der verwendeten primären ECs. Zur Veranschaulichung verwendeten wir pulmonale Arterien-Endothelzellen von CTEPH-Patienten in Wechselwirkung mit ganzem menschlichen Blut, das alle an der Thrombusbildung beteiligten Komponenten (Thrombozyten, Leukozyten, Erythrozyten, Gerinnungsproteine und Kofaktoren) enthält. Dieser Ansatz kann in kommerziellen Parallelflusskanälen oder in kundenspezifischen mikrofluidischen Durchflusskanälen mit einem spezifischen vaskulären Design angewendet werden. Als solches kann das Modell schließlich in der Untersuchung der Thrombusbildung und -auflösung, für die Beurteilung von Entzündungsreaktionen bei der Krankheitsmodellierung, für die Thrombozyten- oder Antikoagulationstherapie und letztlich für die personalisierte Medizin verwendet werden.
Diese Studie beschreibt die Isolierung der primären menschlichen Lungenarterieen-Endothelzellen. Für die Isolierung anderer primärer menschlicher Endothelzelltypen beziehen wir uns auf zuvor veröffentlichte Methoden, einschließlich pulmonaler mikrovaskulärer Endothelzellen25, menschlicher Nabelvenenenenen-Endothelzellen28und blutzirkulierender endothelialer Koloniebildender Zellen Abbildung 1A29.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>20 mL Spritze</td><td>BD</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>20X Objektiv</td><td>Olympus</td><td>N1492900</td><td>LUCPLFLN20XPH/0,45</td></tr><tr><td>2-Propanol (IPA)</td><td>Boom</td><td>760514555000</td><td></td></tr><tr><td>Aladdin Spritzenpumpe</td><td>Word Precision Instruments</td><td>AL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488-Fibrinogen</td><td>Invitrogen</td><td>F13191</td><td>15 ug/mL</td></tr><tr><td>Alexa647-Ziege Anti Kaninchen</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Biopsie-Stanze 1 mm Durchmesser</td><td>Ted Pella</td><td>15110-10</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM-Rot</td><td>Invitrogen</td><td>C3099</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>CD42b-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-208</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Merck</td><td>100244</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen Typ I, Rattenschwanz</td><td>Corning</td><td>354249</td><td>0,1 mg/mL</td></tr><tr><td>Corning CellBIND Surface 60 mm Kulturschale</td><td>Corning</td><td>3295</td><td></td></tr><tr><td>Cross-Flow-Haube</td><td>Basan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Exsikkator</td><td>Duran</td><td>2478269</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Merck</td><td>14431-43-7</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Endothelzellmedium (ECM)</td><td>ScienCell</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin Menschliches Plasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>Durchflussschlauch</td><td>ibidi</td><td>10831, 10841</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Merck</td><td>104070</td><td>0,1%</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>micron-Slide VI 0,4 Durchflusskammern</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v1.49</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Laborofen</td><td>Quincy</td><td>10GC</td><td></td></tr><tr><td>LS720 Fluoreszenzmikroskop</td><td>Etaluma</td><td>LS720</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Anschluss</td><td>ibidi</td><td>10802, 10825</td><td>Winkelstecker, Weibliche Schlauchverbinder</td></tr><tr><td>MACS magnetische Kügelchen (anti-CD144)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-857</td><td>1:5</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger für Mikroskopie, 76 x 26 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAAA000001##12E</td><td></td></tr><tr><td>Negativ Fotolack, SU-8</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA)</td><td>Lonza</td><td>13-114E</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Merck</td><td>818715</td><td>4% PFA in PBS</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (P/S)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>1%</td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>ohne Calcium oder</td></tr><tr><td>Magnesium Plasma Kammer, CUTE</td><td>Femto Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxan (PDMS), Sylgard 184</td><td>Dow</td><td>101697</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat Blutentnahmeröhrchen</td><td>BD</td><td>363048</td><td></td></tr><tr><td>Trinatriumcitrat</td><td>Merck</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot</td><td>Gibco</td><td>25300-045</td><td></td></tr><tr><td>VE-Cadherin (D87F2)-XP</td><td>Zellsignalisierung</td><td>2500</td><td>1:300</td></tr></tbody></table>

in vitro mikrofluidic disease model zur untersuchung von blut-endothel-wechselwirkungen und blutgerinnsungsdynamik in echtzeit

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

Die Bildung von Blutgerinnseln beinhaltet komplexe Wechselwirkungen zwischen Endothelzellen, ihrer zugrunde liegenden Matrix, verschiedenen Blutzellen und Proteinen. Das Endothel ist die primäre Quelle vieler der wichtigsten hämostatischen Moleküle, die Thrombozytenaggregation, Gerinnung und Fibrinolyse steuern. Obwohl der Mechanismus der Thrombose seit Jahrzehnten untersucht wird, konzentrieren sich In-vitro-Studien hauptsächlich auf Situationen von Gefäßschäden, in denen die subendotheliale Matrix exponiert wird, oder auf Wechselwirkungen zwischen Zellen mit einzelnen Blutbestandteilen. Unsere Methode ermöglicht die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Vollblut und einem intakten, konfluenten Vaskulärenzellnetzwerk.
Durch die Verwendung primärer menschlicher Endothelzellen bietet dieses Protokoll die einzigartige Möglichkeit, den Einfluss von Endothelzellen auf die Thrombusdynamik zu untersuchen und gibt wertvolle Einblicke in die Pathophysiologie thrombotischer Erkrankungen. Die Verwendung von kundenspezifischen mikrofluidischen Strömungskanälen ermöglicht die Anwendung krankheitsspezifischer Gefäßgeometrien und modellspezifische morphologische Gefäßveränderungen. Die Entwicklung eines Thrombus wird in Echtzeit und quantitativ durch Thrombozytenhaftung und Fibrinablagerung charakterisiert. Die Wirkung der Endothelfunktion in der veränderten Thrombusdynamik wird durch Postanalyse durch Immunfluoreszenzfärbung bestimmter Moleküle bestimmt.
Die repräsentativen Ergebnisse beschreiben den Versuchsaufbau, die Datenerfassung und die Datenanalyse. Je nach Forschungsfrage können die Parameter für jeden Abschnitt angepasst werden, einschließlich Zelltyp, Scherraten, Kanalgeometrie, Medikamenttherapie und Postanalyseverfahren. Das Protokoll wird durch Quantifizierung der Thrombusbildung an der Lungenarterieendothel von Patienten mit chronischer thromboembolischer Erkrankung validiert.

Die repräsentativen Ergebnisse können in drei Teile unterteilt werden, die jeweils die jeweiligen Schritte des Versuchsaufbaus, der Datenerfassung und der Datenanalyse darstellen. Je nach Forschungsfrage können die Parameter für jeden Schritt geändert werden. Die vorgestellten Daten werden angewendet, um den Einfluss des Endothels auf die Thrombusbildung zu untersuchen.
Experimentelle Einrichtung Es ist allgemein bekannt, dass Endothelzellen in Struktur und Funktion, je nach Ort und Zeit, während Gesundheit und Krankheit sehr heterogen sind23. Verschiedene Quellen von Endothelzellen können verwendet werden, um die Endothel-Blut-Wechselwirkung zu untersuchen, die in diesem Fall kommerziell erhältliche HUVECs und PAECs waren (Abbildung 1A). HUVECs wurden am häufigsten in Labormodellen verwendet, während PAECs von Patienten abgeleitete isolierte Zellen aus den Lungenarterien sind. Darüber hinaus gibt es etablierte Protokolle zur Isolierung mikrovaskulärer Endothelzellen (MVEC) aus der Lungenzirkulation oder blutzirkulierenden endothelialen koloniebildenden Zellen (ECFC)25,28,29.
Nach der Isolierung wurden Endothelzellen durch VE-Cadherin-, CD31- und TIE2-Färbung charakterisiert, um einen endotheliaalen Phänotyp zu bestätigen. Die Charakterisierung des Vorhandenseins von SMA und Cytokeratin deutete auf das Fehlen eines Fibroblasten oder epitheliaalähnlichen Phänotyps hin (Abbildung 1B). Nach dem Erhalt einer hochreinen Population von ECs wurden Durchgangszellen 3–5 verwendet, um entweder einen kommerziellen Mikrorutsch oder maßgeschneiderte mikrofluidische Durchflusskanäle auszusäen (Abbildung 1C). Während es sich bei den handelsüblichen Mikrorutschen in erster Linie um parallele Strömungskammern oder Y-förmige Kanäle mit speziell definierten Parametern in Höhe oder Bifurkationswinkel handelt, ermöglicht der Einsatz mikrofluidischer Dias die Anpassung der experimentellen Parameter an die In-vivo-Gefäßgeometrie und die Durchblutungsdynamik31. Jedoch, maßgeschneiderte mikrofluidische Größen sind kleiner und neigen dazu, Zellausbreitung zu begrenzen und mehr Zelltodinduzieren 32,33. Die Verwendung eines Überschusses an Zellen kompensiert die Tatsache, dass nur ein kleiner Prozentsatz der Zellen haftet. Dies wurde beobachtet, wenn eine Stenose eingeführt wurde, wo Endothelzellen einen längeren Phänotyp im Vergleich zu einem parallelen mikrofluidischen Kanal zeigten (Abbildung 1D). Kommerzielle Strömungskammern haben eine größere Oberfläche, an die Zellen binden können. Dies erfordert weniger Zellennummern für die Aussaat.
Um die Endothelzell-Blut-Interaktion zu untersuchen, wurde Vollblut über eine endotheliale Monoschicht durchdrushandelt. Citriertes Blut wurde am Tag des Experiments und unmittelbar vor perfusion recalcified gesammelt. Die Zellen wurden mit Histamin stimuliert, um die FREISETZUNG von VWF und die Thrombozytenhaftung 30 min vor der Perfusion zu induzieren (Abbildung 1E)34,35. Aufgrund der geringen Abmessungen erlaubten die maßgeschneiderten mikrofluidischen Kanäle die Verwendung kleinerer Blutmengen.
Datenerfassung Zur Untersuchung der Thrombusbildung auf PAECs wurden Calcein AM-Red fluoreszierend blutzellen und Alexa488-konjugiertes Fibrin 5 min bei 2,5 Dyne/cm2 durchdrungen (Abbildung 2A–C). Anhaftete Blutzellen und abgelagertes Fibrin wurden quantifiziert. Die Bilder wurden alle 30 s aufgenommen und mit ImageJ quantifiziert. Es war wichtig, den Hintergrund zu subtrahieren, um die Autofluoreszenz von nicht haftenden Thrombozyten zu beseitigen. Der Dreiecksalgorithmus für schwellenwertende Schwellenwerte wurde verwendet, um minimalen Hintergrund zu definieren. Es ermöglichte die Messung von kleinen Thrombozytenaggregaten (Abbildung 2D).
Voraussichtlich gab es unter nicht stimulierten Bedingungen keine Bindung von Thrombozyten und Fibrin an das Endothel. Um die Freisetzung und Thrombozytenbindung von VWF zu fördern, wurden PAECs mit Histamin stimuliert, was zu einer sofortigen Erhöhung der Thrombozytenhaftung führte, die nach 2,5 min ein Plateau erreichte. Zu dieser Zeit begannen Thrombozyten, autokrine Faktoren zu sezernieren, die Thrombozytenaggregation und fibrinogene Spaltung in Fibrin induzierten. Fibrin wurde nach 3 min abgelagert und bildete nach 4 min ein stabiles Aggregat mit Thrombozyten(Abbildung 2E).
Um zu untersuchen, ob dieser Effekt durch ein direktes orales Antikoagulans (DOAC) gehemmt werden könnte, wurde Blut mit 10 nM Dabigatran behandelt. Dabigatran wurde der Blutverdünnung zugesetzt, wo es Faktor IIa im Gerinnungsweg hemmt und die Spaltung von Fibrinogen verhindert, um Fibrinfasern zu bilden. Wenn dabigatran-behandeltes Blut über stimulierten PAECs durchdrungen wurde, konnte die Gerinnselbildung direkt durch verzögerungsende Fibrinablagerungen gehemmt werden (Abbildung 2F).
Datenanalyse Um den Einfluss verschiedener Endothelquellen auf die Thrombusbildung zu untersuchen, wurden die zellulären Veränderungen bei 5 min Blutperfusion analysiert. Das Endothel wurde fixiert und die anhaftenden Thrombozyten mit CD42b beschriftet, bevor es unter einem konfokalen Mikroskop gezwickt wurde. Dies lieferte eine detaillierte Analyse für die Kolokalisierung von Blutplättchen und Fibrin, die dysfunktionale Gerinnungsfaktoren im Blut anzeigen könnte. Der Einfluss der EG bei der Gerinnselbildung wurde durch standardimmunfluoreszierende Färbung bestimmt. Endotheliale Zell-Zell-Kontakte wurden aufrechterhalten, wie durch VE-Cadherin-Färbung bestätigt,was darauf hindeutet, dass die Blutgerinnsel auf der Oberseite der endotheliale Monoschicht und nicht auf der zugrunde liegenden Matrix zwischen endotheliaalen Lücken gebildet wurden (Abbildung 3). Darüber hinaus führte die Verwendung verschiedener Zellquellen zu unterschiedlichen Thrombenmustern, die sich auf dem Endothel bildeten. HUVECs sind venöse Endothelzellen und zeigten eine begrenzte Thrombozytenhaftung und Fibrinabscheidung, während kranke primäre PAEC von CTEPH-Patienten eine reichliche Thrombozytenhaftung und mehr Fibrinablagerung bei Histaminstimulation im Vergleich zu gesunder PAEC zeigten. Dies deutet darauf hin, dass das Endothel von CTEPH-Patienten eine höhere Reaktionsfähigkeit auf Vasoaktivierung aufweist, die zu einer erhöhten Thrombusbildung führt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Übersicht des Protokolls. (A) Verschiedene Quellen und verschiedene Arten von Endothelzellen wurden isoliert und für den Einsatz in einem mikrofluidischen Durchflusskanal für Perfusionsexperimente kultiviert. Repräsentative Hellfeldbilder verschiedener Arten von Endothelzellen. Skala bar = 50 m. (B) Isolierte Zellen wurden durch immunfluoreszierende Färbung gekennzeichnet, um einen endothelialen Phänotyp zu bestätigen. Scale bar = 50 m. (C) Zellen können entweder in kommerziellen Strömungsschlitten oder in kundenspezifischen mikrofluidischen Kanälen gesät werden. (D) Repräsentative Hellfeldbilder von HUVEC, die in verschiedenen Kanalgeometrien angebaut werden. Scale bar = 50 m . (E) Experimentelle Einrichtung von Blutperfusionsexperimenten. Citriertes Blut wurde gesammelt, mit Einem Salinepuffer verdünnt und mit einer Spritzenpumpe über Endothelzellen durchsetzt. Die Lunge und Nabelvene in dieser Abbildung wurden von Servier Medical Art modifiziert, lizenziert unter einer Creative Common Attribution 3.0 Generic Licence. http://smart.servier.com/ <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig2.jpg"> Abbildung 2: Bildaufnahme und Quantifizierung der Thrombusbildung. (A) Repräsentative Zeitraffer-Bildgebung von aufhaftenden Calcein AM-Red-gekennzeichneten Blutplättchen und abgelagertem Alexa488-konjugiertem Fibrin bei 1, 3 und 5 min nach Vollblutdurchblutung über nicht stimulierten PAECs (B) und über Histamin stimulierten PAECs. (C) Repräsentative Zeitrafferbilder der Thrombozytenhaftung und Der Fibrinablagerung bei 1, 3 und 5 min Perfusion mit Vollblut, inkubiert mit Dabigatran, die über histaminstimulierten PAECs durchdrungen sind. Maßstabsleiste = 50 m (D) Schematische Übersicht der Bildquantifizierung in ImageJ. (E) Quantifizierung der Thrombozytenhaftung und Fibrinablagerung für alle 30 s auf einem stimulierten und histaminstimulierten Endothel. (F) Quantifizierung der Wirkung von Dabigatran auf die Thrombusbildung quantifiziert durch Thrombozytenhaftung und Fibrinablagerung. Daten werden als Mittelwert ± SD, n = 3 dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61068/61068fig3.jpg"> Abbildung 3: Repräsentative konfokale Bilder von Strömungsexperimenten zur Charakterisierung der Thrombusbildung bei Thrombozytenhaftung und Fibrinabscheidung auf Endothelzellen. Endotheliale Zell-Zell-Kontakte wurden durch VE-Cadherin charakterisiert und in Kontroll-PAECs, patientenabgeleiteten CTEPH-PAECs und HUVEC gemessen. Maßstabsleiste = 50 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61068/61068fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Wir präsentieren ein In-vitro-Modell für Gefäßerkrankungen, um Vollblut-Wechselwirkungen mit patientenabgeleitetem Endothel zu untersuchen. Dieses System ermöglicht die Untersuchung der thrombogenen Eigenschaften der primären Endothelzellen unter verschiedenen Umständen. Das Verfahren eignet sich besonders zur Beurteilung der Thrombogenität und Antikoagulationstherapie in verschiedenen Phasen der Gerinnung.

In Vitro Mikrofluidic Disease Model zur Untersuchung von Blut-Endothel-Wechselwirkungen und Blutgerinnsungsdynamik in Echtzeit

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

Dieses In-Vitro-Krankheitsmodell kann verwendet werden, um die Wechselwirkung von Vollblut und Patienten-abgeleiteten Zellen, insbesondere dem Endothel, zu untersuchen, um die Thrombogenität und die Wirksamkeit von Gerinnungsmitteln zu bewerten. Dies ist Endothelzellen kann unter verschiedenen Umständen verwendet werden und kann durch die Einführung von maßgeschneiderten Mikrofluidik oder durch die Anpassung der Blutflussparameter modifiziert werden. Darüber hinaus kann dieses Modell verwendet werden, um Thrombus-Dynamik bei entzündlichen Bedingungen zu untersuchen, oder um die Auswirkungen der Antikoagulans und Thrombozytentherapie zu bewerten.Letztlich können diese Ansätze in einer Methode der personalisierten Medizin verwendet werden. Nach Erhalt einer chirurgischen menschlichen Lungenarteriengewebeprobe, mantel Hochaffinität Zellbindung 60 Milliliter Zellkulturschale mit zwei Millilitern von fünf Mikroliter pro Milliliter Fiboronectin und inkubieren die Schale bei 37 Grad Celsius für mindestens 15 Minuten. Verwenden Sie am Ende der Inkubation sterile Zangen in einem laminaren Strömungsschrank unter sterilen Bedingungen, um das Gewebe in eine Petrischale von PBS zu übertragen.Wenn sich das Gewebe noch in einem Ring befindet, schneiden Sie die Arterie mit einer Schere auf, wobei Sie darauf achten, die innerste Schicht des Gefäßes nicht zu berühren, da das Endothel leicht beschädigt und entfernt wird. Nach dem Entfernen des Fibronectin, fügen Sie vier Milliliter komplette endotheliale Zellmedium in die Schale und verwenden Zangen, um die Gewebeprobe in das Medium zu übertragen, verwenden Sie ein Skalpell, um sorgfältig die innere Schicht des Gefäßes in das Medium zu kratzen, wobei darauf zu achten ist, dass Lipidansammlungen, die in der Gefäßwand beobachtet werden, vermieden werden. Nachdem die Zellen geerntet wurden, legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator.Wenn Fibroblasten die Kultur kontaminieren, verwenden Sie magnetische Affinitätszelltrennung für eine CD144, gemäß den Anweisungen des Herstellers, um die Zellen zu reinigen. Im Allgemeinen wird Kultur als rein definiert, wenn die Durchflusszytometrie 10 % oder weniger kontaminierende Zellen erkennt. Wenn die ausreichende Anzahl von Endothelzellen für den experimentellen Einsatz erhalten wurde, können die primären Endothelzellen für das Vorhandensein von endotheliale zellspezifischen Markern und für das Fehlen glatter Muskel- und Epithelzellmarker charakterisiert werden.Für die Strömungskammervorbereitung einen Kanal eines sechs Well-Flow-Schlittens mit 30 Mikrolitern 0,1% Gelatine kodieren und diese Folie mindestens 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Neben handelsüblichen Strömungskammern können kundenspezifische Strömungskammern mit spezifischen Abmessungen verwendet werden, um den Einfluss der Gefäßgeometrie auf die Gerinnseldynamik zu untersuchen. Während die Folie inkubiert, sammeln Sie die Zellen aus einer konfluenten pulmonalen Arterie Endothelzellkultur mit EDTA und Trypsin und Sediment, dass Zellen durch Zentrifugation, re suspendieren das Pellet in 600 Mikroliter von kompletten endothelialen Zellmedium und kräftig, aber sanft, fügen Sie 100 Mikroliter Zellen in jedem Kanal, fügen Sie weitere 50 Mikroliter der kompletten endothelialen , um ausreichend Medium für die nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid zur Verfügung zu stellen, das Medium am nächsten Tag zu ändern, um die ungebundenen Zellen wegzuwaschen.Nach sechs Tagen kulturbilden die Zellen eine stabile konfluente Monoschicht. Erwerben Sie am siebten Tag der Lungenarterien-Endothelzellkultur eine venöse Blutprobe von Probanden, die keine Antikoagulationsbehandlung in 109 Mononatriumcitrat-Gerinnungsmittelröhren erhalten, und übertragen Sie das Blut in eine 50-Milliliter-Röhre. Blut kann Viren und andere Infektionserreger enthalten.Daher ist es wichtig, immer Handschuhe zu tragen und die Sicherheitshinweise für die Arbeit mit menschlichem Material zu befolgen. Fluoreszierend beschriftet die Blutzellen mit 1 bis 10 000 Konzentration von Calcein AM Red und 50 Mikrogramm pro Milliliter und fügen Sie Alexa 488 Fibrinogen, dann inkubieren das Blut bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten, um eine vollständige Absorption zu ermöglichen. 30 Minuten vor der Perfusion die lungenarterienalen Endothelzellen mit 100 Mikrolitern eines Mikromolar-Histamins in Endothelzellmedium und 1%fetalem Rinderserum ohne weitere Zusatzstoffe behandeln.Und verwenden Sie eine 20-Milliliter-Spritze gefüllt mit Waschpuffer, um die Durchflusssystemrohre zu spülen, eine Dritte- bis 20-Milliliter-Spritze mit zwei Milliliter Waschpuffer zu laden und die Spritze auf eine Spritzenpumpe zu laden. Verwenden Sie eine zweite 20-Milliliter-Spritze, um die Durchflussrohre mit Hippies plus Puffer mit 1% Rinderserumalbumin zu füllen und verwenden Sie einen Ellenbogenform Laura-Stecker, um die Rohre sorgfältig mit dem Mikroschlitten zu verbinden, den Ausgang des Dias mit der Spritze zu verbinden, die Reparatur aus der Mikroskopie, indem Sie die Zelle mit Dia auf die Bühne legen und das Setup für das Experiment zusammenstellen , stellen Sie das Mikroskop ein und stellen Sie die Parameter für die Bildgebung ein. Verkalkung von emphatischem Blut.Und dies ist ein glücklicher Co-Sponsor der Gerinnung, darüber hinaus versuchen, die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, weil dies die Endothelzellschicht beschädigt und Ihre Ergebnisse beeinflussen wird. Unmittelbar vor der Perfusion das Blut zweimal mit dem Entkalkungspuffer verdünnen und das Einlassrohr des Mikroschlittens in die Blutröhre legen, auf die Spritzenpumpe drücken. Sobald das Blut über das Endothel fließt, drücken Sie den Druck auf das Mikroskop, um Bilder mit den vorgewählten aktiven Kanälen und Interessensbereichen alle 15 Sekunden für fünf Minuten zu erfassen.Beenden Sie am Ende der Analyse die Aufzeichnung und die Spritzenpumpe und reinigen Sie sie ordnungsgemäß. Die Kennzeichnung von Thrombozyten mit Calcein AM Red und die Zugabe von Alexa 488 konjugiertem Fibrinogen ermöglicht die Untersuchung der Thrombusbildung durch Thrombozytenhaftung und Faser- und Ablagerung. Unter nicht stimulierten Bedingungen gibt es keine Bindung von Thrombozyten oder Fibrin an das Endothel.Die Stimulation mit Histamin führt zu einer sofortigen Erhöhung der Thrombozytenhaftung, die nach 2,5 Minuten ein Plateau erreicht, zu diesem Zeitpunkt beginnen die Thrombozyten autokrine Faktoren zu sezernieren, die eine Thrombozytenaggregation und Fibrinogenspaltung zu Fibrin induzieren, was zu Ballaststoffen und Ablagerungen nach drei Minuten und der Bildung eines stabilen Aggregats mit den Thrombozyten nach vier Minuten führt. Die Behandlung mit einem direkten Gerinnungsmittel hemmt sowohl die Gerinnselbildung als auch die Thrombozytenhaftung im Vergleich zu unbehandeltem Blut. Immunfluoreszenzanalyse der pulmonalen Arterien-Endothelzellplättchen-Wechselwirkungen nach fünf Minuten Perfusion, zeigt die Aufrechterhaltung der Endothelzelle, Zellkontakte, wie durch vaskuläre endotheliale Cadherinfärbung bestätigt, was darauf hindeutet, dass sich die Blutgerinnsel auf endothelialen Modellschichten und nicht auf der zugrunde liegenden Matrix zwischen endothelialen Lücken bilden.Menschliche Nabelvenen-Endothelzellen zeigen weniger Thrombozytenhaftung und Fibrinablagerung im Vergleich zu Pulmonalen-Endothel. Insbesondere, kranke primäre lungenarterienarteriende Endothelzellen von chronischen thromboembolischen pulmonalen Hypertonie-Patienten, zeigen eine erhöhte Thrombozytenadhäsion und mehr Fibrin-Abscheidung im Vergleich zu gesunden Zellen. Die Thrombogenität des Endothels hängt von mehreren Faktoren wie dem Ursprung des Gefäßbettes oder den Teilen des biologischen Hintergrunds ab.Mit diesem Protokoll können intrinsische Funktionsstörungen in Gefäß- und Blutbestandteilen sowie die Wirksamkeit der antikoagulierten Therapie in verschiedenen Phasen der Thrombosehämostase getestet werden. Dieses Protokoll kann zum Verständnis von Blut- und Theo-Wechselwirkungen bei verschiedenen thromboembolischen Erkrankungen mit dem ultimativen Potenzial verwendet werden, patientenspezifische Reaktionen auf die Antikoagulationstherapie vorherzusagen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Verfahren zur Kultur von Endothelzellen eine Monoschicht der gesamten inneren Oberfläche des 3D einer Mikrofluidikvorrichtung mit mikrovaskulären großen Kanälen (&lt;30 um) beschrieben.

Endothelialisierten Mikrofluidik für ein Studium Mikrovaskuläre Wechselwirkungen in Hämatologische Krankheiten

A Mikrokanälen-on-a-Chip-Plattform wurde durch die Kombination von photolithographischen reflowable Photolacktechnik, weiche Lithographie und Mikrofluidik entwickelt. Die endothelialisierten Mikrokanäle Plattform imitiert die dreidimensionale (3D) Geometrie in vivo Mikrogefäßen läuft unter kontrollierten kontinuierlichen Perfusionsfluss, ermöglicht qualitativ hochwertige und Echtzeit-Bildgebung und kann für mikrovaskuläre Forschung angewendet werden.

Verfahren für die Entwicklung von Multi-Tiefe rundem Querschnitt endothelialisierten Mikrokanäle-on-a-Chip

Die Zugänglichkeit zuverlässiger Modelle zur Untersuchung vaskulärer Blutinteraktionen beim Menschen fehlt. Wir präsentieren ein in vitro Modell von kultivierten primären humanen Endothelzellen, die mit menschlichem Vollblut kombiniert werden, um zelluläre Wechselwirkungen sowohl im Blut (ELISA) als auch im Gefäßkompartiment (Mikroskopie) zu untersuchen.

A Novel In vitro Modell für die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen humanem Vollblut und Endothel

Dieses Protokoll repliziert physiologische oder pathologische Blutfluss in vitro zur Bestimmung Zellantwort bei Krankheitspathologien unterstützen. Durch Einführung einer Druckdämpfungskammer stromabwärts von einer Blutpumpe, kann die Blutströmung durch die Vaskulatur rekapituliert und auf einer Monoschicht von Gefäßendothel oder eines Mimetikums Kokultur auferlegt.

In-vitro-Modell von physiologischen und pathologischen Blutfluss mit Anwendung auf Untersuchungen der Gefäßzell Remodeling

Die Thrombozytentransfusion und Hämostase wurde unter Verwendung von Blutrekonstitution und mikrofluidischen Flusskammern modelliert, um die Funktion von Blutbankplättchen zu untersuchen. Die Daten zeigen die Auswirkungen einer Thrombozytenspeicherung auf die Blutstillung in vitro.

Mikrofluidik-Strömungskammern Mit Rekonstituierte Blut Hämostaseologie und Transfusions Platelet zu Modell<em&gt; In Vitro</em

Primäre humane Nabelvenendothelzellen (HUVECs) wurden innerhalb eines mikrofluidischen Netzwerkgeräts zur Konfluenz gezüchtet. Die Endothelzellübergänge und F-Aktin-Verteilungen wurden dargestellt und die Veränderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration und der Stickoxidproduktion als Reaktion auf Adenosintriphosphat (ATP) wurden in Echtzeit auf Einzelzellebene quantifiziert.

Entwicklung und Charakterisierung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrogefäßnetz und quantitative Messungen von Endothelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Und die Produktion von Stickoxid

Dieses Dokument beschreibt ein experimentelles Modell der Hämostase, die Thrombozytenfunktion und Koagulation gleichzeitig misst. Blutplättchen- und Fibrin- Fluoreszenz wird in Echtzeit gemessen und die Plättchenadhäsion Rate, Gerinnungsrate und Einsetzen der Gerinnung bestimmt. Das Modell wird verwendet, um die Thrombozyten Prokoagulanz-Eigenschaften unter Strömung in Konzentraten für Transfusions bestimmen.

Ein Mikrofluidik-Flow-Kammer-Modell für Platelet Transfusions und Hämostase Maßnahmen Platelet Deposition und Fibrinbildung in Echtzeit

Wir präsentieren ein in Vitro -Modell ermöglicht die Untersuchung und Analyse der Koagulation im ganzen, nicht-Anticoagulated Blut. Antikoagulation im System hängt die natürliche antikoagulierende Wirkung des gesunden Endothelzellen und endothelialer Zellaktivierung führt zu gerinnen.

Bewertung der gerinnungshemmenden und entzündungshemmenden Eigenschaften von Endothelzellen mit 3D Zellkultur und nicht-Antikoagulanzien Vollblut

Hier wird ein Protokoll für ein standardisiertes in vitro hämodynamisches Schleifenmodell vorgestellt. Dieses Modell ermöglicht es, die Hämokompatibilität von Perfusionsröhren oder Gefäßstents zu testen, die der ISO-Norm 10993-4 (International Organization for Standardization) entsprechen.

Ein In-Vitro-Hämodynamik-Loop-Modell zur Untersuchung der Hämozytokompatibilität und Der hostcell-Aktivierung von Gefäßmedizingeräten

In-vitro-Thrombolyse-Assays haben oft Schwierigkeiten, In-vivo-Bedingungen zu replizieren, sei es im Modellthrombus, der verdaut wird, oder in der Umgebung, in der die Thrombolyse stattfindet. Im Folgenden untersuchen wir, wie die Kopplung des Chandler-Loops und des Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF) für eine hochgenaue Ex-vivo-Überwachung der Gerinnsellyse verwendet wird.

Verfolgung der Fibrinolyse von Chandler-Schleifen-gebildeten Vollblutgerinnseln unter Scherströmung in einem In-vitro-Thrombolysemodell

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein mikrofluidisches System herzustellen und zu betreiben, das Endothelzellen synchronisierter oszillatorischer Hyperglykämie und pulsatiler Scherspannung aussetzt. Dieser Ansatz bietet ein physiologisch relevantes In-vitro-Modell zur Untersuchung diabetischer Endotheldysfunktion. Dieses Protokoll ermöglicht die quantitative Messung von oxidativem Stress und den Antworten von Endothelzellen.

Ein mikrofluidisches System zur Modellierung der endothelialen Dysfunktion unter kombinierter physiologischer pulsatiler Scherspannung und oszillatorischer Hyperglykämie

Erfahren Sie ein mikrofluidisches In-vitro-Krankheitsmodell zur Untersuchung von Blut-Endothel-Wechselwirkungen und Thrombogenität. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Analyse von Gerinnungsdynamik und die Bewertung antikoagulativer Therapien.

In Vitro Mikrofluidic Disease Model zur Untersuchung von Blut-Endothel-Wechselwirkungen und Blutgerinnsungsdynamik in Echtzeit

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