Modell der ischämischen Herzkrankheit und videobasierter Vergleich der Kardiomyozytenkontraktion mit hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten
5. Mai 2020
Wir präsentieren ein Modell der ischämischen Herzkrankheit mit Kardiomyozyten aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen, zusammen mit einer Methode zur quantitativen Bewertung von Gewebeschäden, die durch Ischämie verursacht werden. Dieses Modell kann eine nützliche Plattform für das Screening von Arzneimitteln und weitere Forschung endemische Herzkrankheiten bieten.
Die Erforschung von Herzerkrankungen wird oft bei kleinen und Säugetieren wie Nagetieren durchgeführt. Die Physiologie des menschlichen Herzens unterscheidet sich jedoch deutlich von der des Nagetierherzens. Unser Protokoll verwendet Kardiomyozyten, die von menschlichen iPS-Zellen unterschieden werden, um ischämische Herzerkrankungen zu modellieren und die Schäden und funktionellen Beeinträchtigungen von imischen Kardiomyozyten zu quantifizieren.
Dieses Protokoll kann eine praktische Methode für personalisierte sdrug screening mit iPS-Zellen von einzelnen Patienten abgeleitet bieten, die angemessene Handhabung der iPS-Zellen, wie bei der Verwendung von frischem Medium, und das Mittel langsam und pünktlich zu wechseln ist entscheidend, um eine erfolgreiche Differenzierung in funktionelle Kardiomyozyten zu gewährleisten. Das Verfahren mit Yun Liu, Yin Liang und Mengxue Wang demonstriert Chen Wang, ein Doktorand aus einem Labor. Um die vom Menschen induzierte pluripotente Stammzelldifferenzierung in Herzzellen zu induzieren, beschichten Sie zunächst die Brunnen einer 96-Well-Kulturplatte mit 100 Mikrolitern von 1,675 Mikrogramm pro Milliliter Laminin in PBS.
Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius, sehen Sie dreimal 10 bis die vierten Stammzellen in 200 Mikroliter IPS-Wartungsmedium mit 10 Mikromolaren Y27632 in jedem Brunnen ergänzt, und geben Sie die Platte an den Cell Culture Inkubator zurück. Ersetzen Sie nach 24 Stunden die Supermittel durch 200 Mikroliter IPS-Wachstumsmedium pro Brunnen und geben Sie die Platte für weitere zwei bis drei Tage an den Cell Culture Inkubator zurück. Wenn die Zellen 70 bis 80% Konfluenz erreichen.
Ersetzen Sie das Medium in jedem Brunnen durch 200 Mikroliter vorgewärmten Differenzierungsmedium A und geben Sie die Platte für weitere 48 Stunden an den Cell Culture Inkubator zurück. Am Ende der Inkubation ersetzte langsam der Überstand in jedem Brunnen mit 200 Mikrolitern vorgewärmtem Differenzierungsmedium B und gab die Platte an den Zellkultur-Inkubator zurück. Ersetzen Sie nach zwei Tagen die Überwältstoffe durch 200 Mikroliter vorgewärmtes Kardiomyozyten-Pflegemedium pro Brunnen und bringen Sie die Platte für bis zu 30 Tage an den Cell Culture Inkubator zurück.
Um die Kontraktilität der Kardiomyozyten zu beurteilen, installieren Sie das Partikelbild-Velocimetrie-Bild-j-Plugin und verwenden Sie ein Phasenkontrastmikroskop und das Gabelziel, um Videobilder der Zellen mit etwa 20 Bildern pro Sekunde für etwa 10 Sekunden aufzunehmen. Speichern Sie dann die Videodatei wie unsere API analysiert und erstellen Sie eine Ordnerstruktur wie angegeben. Um diskrete zweidimensionale Vektorfelder der Zellverschiebung zu analysieren, starten Sie VG und wählen Sie Plugins, Makros und bearbeiten, um Vektoranalysen zu öffnen.
ijm, dann klicken Sie auf Ausführen der Analyse wird automatisch durchgeführt. Für die ischämische Behandlung den Überstand in jedem Brunnen durch 200 Mikroliter dmem ohne Glukose und Serum ersetzen, dann die Platte in eine Hypoxische Kammer geben und dann Stickstoffgas in die Kammer einfließen lassen, wobei die interne Sauerstoffkonzentration bei 2% und die Kohlendioxidkonzentration 24 Stunden lang bei 5% bleiben. Erfolgreich differenzierte Zellen, zeigt spontane Kontraktion, wie unter dem Mikroskop beobachtet mit 50% der Kulturbrunnen in der Regel zeigt spontane Kontraktion in weniger als 20 Tagen.
Herzmarker-Protein kann auch verwendet werden, um eine erfolgreiche Differenzierung zu bestätigen Zellen aus der ischämischen Gruppe zeigen in der Regel eine geringere Lebensfähigkeit in MTT-Assays, und eine geringere Kontraktilität als diejenigen aus der normoxischen Kontrollgruppe. Das Verhältnis der Propidiumjodid-positiven Zellen ist auch in der ischämischen Gruppe höher als in der Kontrollgruppe, was auf eine höhere Inzidenz von Zellschäden hindeutet. Es ist wichtig, dass Sie die Relevanten Bereiche in der Erfassungsplatte genau lokalisieren, um einen Vergleich der Kontraktilität der Kardiomyozyten zu ermöglichen.
Diese Technik kann für das Arzneimittelscreening verwendet werden, mit Patienten abgeleiteten iPS-Zellen. Es bietet auch eine einzigartige Plattform für die weitere Aufklärung der Mechanismen, die ischämischen Herzkrankheiten zugrunde liegen
Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Modellierung von ischämischen Herzerkrankungen unter Verwendung von aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen differenzierten Kardiomyozyten (hiPS-CMs) vor. Die Methode ermöglicht die Quantifizierung zellulärer Schäden und funktioneller Beeinträchtigungen unter ischämischen Bedingungen und bietet damit eine klinisch relevante Plattform für die Herzforschung sowie für personalisierte Wirkstofftests.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Kardiovaskuläre Forschung
- Stammzellbiologie
- Zellphysiologie
Hintergrund
- Die ischämische Herzkrankheit ist weltweit eine der häufigsten Todesursachen.
- Rodentienmodelle werden häufig verwendet, weisen jedoch erhebliche Unterschiede zur menschlichen Herzfunktion auf.
- Humanen iPS-Zellen abgeleitete Kardiomyozyten bieten ein aussagekräftigeres Modell zur Untersuchung von Herzerkrankungen beim Menschen.
- Es besteht Bedarf an Plattformen, die sowohl die Modellierung von Erkrankungen als auch das Wirkstoffscreening im menschlichen Kontext ermöglichen.
Zweck der Studie
- Ein Protokoll zur Differenzierung menschlicher iPS-Zellen in Kardiomyozyten etablieren.
- Modellierung der ischämischen Herzkrankheit in vitro unter Verwendung von hiPS-Kardiomyozyten.
- Zur Quantifizierung zellulärer Schäden und funktioneller Beeinträchtigungen unter ischämischen Bedingungen.
Verwendete Methoden
- Differenzierung menschlicher iPS-Zellen in Kardiomyozyten unter Verwendung von sequenziellen Kulturmedien und mit Laminin beschichteten Platten.
- Induktion einer Ischämie durch Exposition der hiPS-KM gegenüber 2 % Sauerstoff und einem glucose- und serumfreien Medium für 24 Stunden in einer hypoxischen Kammer.
- Beurteilung der Zellviabilität mittels MTT-Assays und Propidiumiodid-Färbung.
- Bestimmung der Kontraktilität durch Analyse des Verschiebungsvektorfeldes mittels Phasenkontrastmikroskopie und Particle-Image-Velocimetry-Software.
Hauptergebnisse
- Ischämische Bedingungen erhöhten den Anteil an verletzten Zellen, was durch eine stärkere Propidiumiodid-Färbung angezeigt wurde.
- Die Zellviabilität nahm in der ischämischen Gruppe im Vergleich zu den Kontrollen ab.
- Die Kontraktilität von hiPS-Kardiomyozyten war unter ischämischen Bedingungen verringert.
- Etwa 50 % der Kulturmulden zeigten innerhalb von 20 Tagen nach Differenzierung eine spontane Kontraktion.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet ein robustes In-vitro-Modell für die ischämische Herzkrankheit unter Verwendung von menschlichen Kardiomyozyten.
- Dieses System ermöglicht die Quantifizierung sowohl zellulärer Schäden als auch funktioneller Beeinträchtigungen.
- Das Modell eignet sich für personalisierte Wirkstofftests und weitere mechanistische Untersuchungen der ischämischen Herzkrankheit.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Menschliche, aus iPSCs abgeleitete Kardiomyozytenmodelle schließen die Übersetzungs-Lücke zwischen Nagetierstudien und menschlichen Herzerkrankungen und ermöglichen eine präzisere Entdeckung in frühen Entwicklungsstadien bei ischämischen Herzerkrankungen. Die quantitative, videobasierte Kontraktilitätsanalyse und Vitalitätsassays liefern handlungsrelevante Daten für die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominimierung. Diese Plattform unterstützt risikoadjustierte Portfolioentscheidungen und personalisierte Arzneimittelscreening-Strategien in der kardiovaskulären Forschung und Entwicklung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen ischämischer Verletzungen in einem für den Menschen relevanten System.
- Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch quantitative Aussagen zur Kontraktilität und Zellviabilität.
- Unterstützt die mechanistische Risikominderung durch Modellierung zellulärer Reaktionen, die für die Krankheit relevant sind.
- Verbessert die Vorhersagesicherheit für die frühe Selektion von Wirkstoffkandidaten in kardiovaskulären Programmen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet eine standardisierte Plattform mit hiPSC-Kardiomyozyten für die reproduzierbare Evaluierung von Wirkstoffen.
- Liefert quantitative Kontraktilitätsparameter durch Analyse von Verschiebungsvektorfeldern.
- Ermöglicht eine skalierbare, videobasierte Untersuchung funktioneller Beeinträchtigungen unter ischämischen Bedingungen.
- Unterstützt die Bereitschaft des Assays für nachgeschaltete Wirkstofftests und mechanistische Studien.
Translationale und präklinische Forschung
- Stellt die Übereinstimmung zwischen In-vitro-Befunden und der Biologie menschlicher Erkrankungen für eine translationale Kontinuität sicher.
- Ermöglicht die Verwendung patientenabgeleiteter Zellen für die personalisierte Profilierung der Arzneimittelwirkung.
- Verringert die Abhängigkeit von nicht-menschlichen Modellen und erhöht damit die Krankheitsrelevanz präklinischer Daten.
- Unterstützt die Entdeckung und Validierung von Biomarkern in einem klinisch relevanten Kontext.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses hiPSC-Kardiomyozyten-Ischämie-Modell verbindet die frühe Forschung, die Identifizierung von Wirkstoffkandidaten und die translationale Forschung, indem es funktionelle und vitalitätsbezogene Endpunkte auf menschlicher Basis bereitstellt.
- Entdeckungsbiochemie: Quantifiziert ischämische Schäden und kontraktile Dysfunktionen zur Hypothesenprüfung und Pfadanalyse.
- Screening: Bietet reproduzierbare, quantitative Aussagen zur Kontraktilität und Vitalität für die Substanztriage.
- Analytik: Integriert videobasierte Verschiebungsanalyse und Vitalitätsassays für robuste statistische Vergleiche.
- Translationale Forschung: Ermöglicht patientenspezifische Modellierung und unterstützt die Abstimmung von Biomarkern mit klinischen Endpunkten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare, skalierbare Plattform für die kardiovaskuläre Arzneimittelforschung und mechanistische Studien.
Operationelle und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Target-Validierung.
- Operationaler Wert: Standardisiert funktionelle Assays und unterstützt skalierbare, reproduzierbare Arbeitsabläufe.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen und verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem spät auftretendes biologisches Risiko reduziert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung kardiovaskulärer Assets.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur von hiPSCs, der Differenzierung und der Validierung von kardialen Markern.
- Benötigt Zugang zu hypoxischen Kammern, der Phasenkontrastmikroskopie und Software zur Videoanalyse.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg voraus, um die Reproduzierbarkeit des Assays und den Vergleich der Daten zu gewährleisten.
- Kann je nach patientenabstammenden iPSC-Linien oder Krankheitsuntertypen Anpassungen erfordern.
- Eine sorgfältige Auswahl des Untersuchungsbereichs (Region of Interest) ist entscheidend für einen genauen Vergleich der Kontraktilität.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:05
Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC) Cardiac Differentiation Induction
2:30
Induced Pluripotent Stem Cell-Cardiomyocyte (iPS-CM) Contractility Assessment
3:15
Ischemia Exposure
3:42
Results: Representative Cardiac Cell Differentiation
4:27
Conclusion
