Vektorkompetenzanalysen an Aedes aegypti Mücken mit Zika-Virus

Bei von Arboviren verursachten Ausbrüchen beschränken sich Gegenmaßnahmen weitgehend auf die Bekämpfung von Mücken. Daher sind Analysen zur Vektorfähigkeit entscheidende Präventionsstrategien, da sie bestimmen, welche Populationen und Arten von Mücken als Vektoren für ein bestimmtes Arbovirus fungieren können und deshalb gezielt bekämpft werden sollten. Eine der wichtigsten Komponenten in unserem Instrumentarium zur Beurteilung der Rolle von Mücken und anderen Vektoren bei der Übertragung infektiöser Krankheiten ist daher die Untersuchung der Vektorfähigkeit. Dabei handelt es sich um Experimente, bei denen wir nicht nur die Mückenart oder beispielsweise Zeckenart, sondern auch geografische Stämme sowie sehr spezifische Stämme unterschiedlicher Viren oder anderer infektiöser Organismen präzise kontrollieren können, um äußerst genaue und gut kontrollierte Daten über das Übertragungsrisiko verschiedener Arten für unterschiedliche Erreger in ganz bestimmten Weltregionen zu erhalten. Die Arbeit mit infizierten Mücken erfordert spezielle Einrichtungen, Schulungen, Erfahrung und sorgfältige Planung, um die Risiken für den Experimentator sowie die Gefahr entkommender, infizierter Mücken zu minimieren. Es ist daher für neue Mitarbeiter in solchen Einrichtungen äußerst wichtig, sich zunächst mit nicht infizierten Blutmücken vertraut zu machen, um die Techniken und Arbeitsabläufe zu erlernen.

Am Tag der Exposition schalten Sie die Stromquelle in einer Arthropoden-Containment-Einrichtung ein, um die Fütterungseinheiten vorzuwärmen. Mischen Sie frisch gewonnenes zitronensäurehaltiges oder heparinisierter menschliches Blut im Volumenverhältnis 1:1 mit einer Virusstammlösung und befüllen Sie ein standardmäßiges Drei-Milliliter-Reservoir mit der Haut einer naiven, nicht infizierten Maus. Stellen Sie das abgedeckte Reservoir auf weiße Papiertücher und geben Sie etwa zwei Milliliter infektiöses Blut portionsweise je ein Milliliter in das Reservoir.

Danach mit Papiertüchern überprüfen, um sicherzustellen, dass keine Undichtigkeiten vorliegen. 24 Stunden vor der Durchführung des Infektionsassays 24-Loch-Zellkulturplatten mit Vero-Zellen vorbereiten und jedes Loch mit der Identität der jeweiligen Mücke und Probe beschriften. Am Morgen, an dem die Mücken der infektiösen Blutmahlzeit ausgesetzt werden, die wassergesättigten Wattebäusche entfernen und die Reservoirs mit den künstlichen Blutmahlzeiten mithilfe einer durchsichtigen plastischen Schutzhaube an die Zuführungen der Fütterungseinheit anschließen.

Stellen Sie den Pappkarton mit den verhungerten Mücken in die Handschuhbox unterhalb der Fütterungseinheit. Entfernen Sie nach Beendigung der Fütterung das Reservoir und tauchen Sie es in frisch zubereitete 10 %ige Bleichlösung. Gießen Sie innerhalb der Handschuhbox die kalt betäubten Mücken in eine Petrischale auf Eis und sortieren Sie die vollgesogenen von den nicht vollgesogenen Mücken.

Geben Sie die aufgefüllten Mücken zurück in den Pappkarton und decken Sie diesen schnell mit einem Sieb und einem Deckel ab. Schneiden Sie das überschüssige Siebgewebe am Karton ab und befestigen Sie den Deckel mit Klebeband. Fügen Sie einen mit steriler, filtrierter 10%iger Saccharose gesättigten Wattebausch auf das Sieb hinzu und stellen Sie den Karton in einen großen sekundären Kunststoffbehälter mit einem feuchten Schwamm, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.

Brüten Sie den sekundären Behälter bei 27 Grad Celsius aus und gewähren Sie den Mücken bis zum Abschluss der Experimente ad libitum-Zugang zum Saccharose. Verwenden Sie einen mechanischen Aspirator, um eine vorbestimmte Anzahl inkubierter Mücken aus der Schachtel zu entnehmen, und verschließen Sie das Sammelröhrchen nach Beendigung mit einem Wattebausch. Arbeiten Sie innerhalb des Handschuhkastens und geben Sie die kaltnarkotisierten Mücken in eine auf Eis liegende Petrischale.

Entfernen Sie alle sechs Beine jedes Moskitos und geben Sie sie in ein vorab beschriftetes zwei Milliliter fassendes Mikrozentrifugenröhrchen mit einer sterilisierten Edelstahlkugel und 500 Mikrolitern Moskito-Sammelmedium (MCM). Legen Sie das Moskito vorsichtig auf einen Tropfen Mineralöl, wobei darauf geachtet werden muss, dass das Öl nicht mit dem Kopf oder dem Saugrüssel des Moskitos in Kontakt kommt. Führen Sie den Saugrüssel in eine Mikropipettenspitze, die mit 10 Mikrolitern hitzeinaktiviertem FBS gefüllt ist, und lassen Sie das Moskito 30 Minuten lang speicheln.

Entfernen Sie die Pipettenspitze mit dem Speichel in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 Mikrolitern MCM und geben Sie den Kadaver in ein separates 2-Millimeter-Röhrchen mit der sterilisierten Stahlkugel und 500 Mikrolitern MCM. Transportieren Sie die Röhrchen in ein Kugelmühlen-Gewebehomogenisierungsgerät innerhalb eines Biosicherheitswerks, und zerkleinern Sie alle Körper- und Beinproben bei 26 Hertz für fünf Minuten, um virale Partikel in den Überstand übergehen zu lassen. Klären Sie alle Proben durch Zentrifugation bei 200 × g für fünf Minuten, um zelluläre Trümmer im Pellet abzutrennen.

Entfernen Sie unmittelbar vor der Inokulation mit den Proben das Medium von den zuvor vorbereiteten Vero-Zellen. Pipettieren Sie vorsichtig 100 Mikroliter klare Überstände aus den Körpern oder Beinen in jede Vertiefung, wobei darauf geachtet werden muss, dass das Mückenzelltrümmermaterial aus dem Pellet nicht aufgewirbelt wird. Anschließend inkubieren Sie die Platten eine Stunde lang.

Nach der Inkubation ein Milliliter Methylcellulose-Überzug zu jeder Vertiefung geben und die Platten für drei bis sieben Tage erneut in den Inkubator stellen. Die Überzugplatten aus dem Inkubator nehmen und in einen Biosicherheitswerkbank bringen. Den Methylcellulose-Überzug in eine Auffangschale mit 10 % Bleiche entsorgen und jede Vertiefung zweimal mit PBS waschen, wobei jede Waschflüssigkeit in die Auffangschale gegeben wird.

Entfernen Sie das PBS und geben Sie je Vertiefung ein Milliliter Methanol-Aceton hinzu. Lassen Sie die Zellen 30 Minuten lang auf der Platte fixieren. Danach entsorgen Sie das Fixierungsmittel und lassen die Platten trocknen. Waschen Sie jede Vertiefung dreimal mit nicht steriler PBS auf einem orbitalen Plattenrührer, wobei jeder Waschschritt 15 Minuten dauert. Fügen Sie anschließend je Vertiefung ein Milliliter Blockierungslösung hinzu und schwenken Sie die Platte weitere 15 Minuten lang.

Fügen Sie 100 Mikroliter Anti-Zika-Virus- oder Anti-Flavivirus-Primärantikörper zu jedem Well hinzu und inkubieren Sie die Platte über Nacht unter Schütteln. Am nächsten Tag entfernen Sie den Primärantikörper und wiederholen Sie die Waschungen mit PBS. Nach der letzten Waschung geben Sie 100 Mikroliter Sekundärantikörper hinzu und inkubieren die Platte eine Stunde lang unter Schütteln.

Wiederholen Sie die Waschschritte mit PBS, dann geben Sie 100 Mikroliter Substratentwicklungsreagenz pro Mulde hinzu und schwenken Sie die Platte 15 Minuten lang. Sobald sich die Foki oder Plaques entwickelt haben, beenden Sie die Reaktion, indem Sie die Platte mit Leitungswasser spülen. Gießen Sie das Leitungswasser ab und lassen Sie die Platten an der Luft trocknen. Anschließend quantifizieren Sie die viralen Foki, um die Anzahl an fokusbildenden Einheiten in der gegebenen Probe zu bestimmen.

Drei Mückenpopulationen wurden über einen Bereich von Blutmahl-Titern hinweg einem Ausbruchsstamm des Zika-Virus ausgesetzt. In den folgenden zwei Wochen wurden Teilmengen der Mücken untersucht, um Infektions-, Disseminations- und potenzielle Übertragungsraten zu bestimmen. Bei niedrigeren Blutmahl-Titern waren die Mücken aus Salvador, Brasilien, nach 4, 10 und 14 Tagen extrinsischer Inkubation infiziert, wobei keine Hinweise auf eine disseminierte Infektion in den analysierten Beinen festgestellt wurden.

Bei der höchsten Titerkonzentration wurde das Virus in den Beinen der Mücken nachgewiesen, jedoch nicht im Speichel. Die Mücken aus der Dominikanischen Republik erwiesen sich als am anfälligsten für eine Infektion und besaßen bei allen getesteten Viruskonzentrationen der Blutmahlzeit die höchste Übertragungskompetenz. Mücken, die alle drei Dosen verabreicht bekamen, zeigten eine Virusverbreitung innerhalb von sieben Tagen sowie Übertragungskompetenz am 14. Tag nach der Infektion.

Mücken aus dem Rio Grande Valley in Texas, die niedrigeren Titern in der Blutmahlzeit ausgesetzt waren, wurden bereits vier Tage post infection infiziert, während disseminierte Infektionen nach 14 Tagen nachgewiesen wurden. In der Kohorte, die dem höchsten Titer ausgesetzt war, wurde die Infektion ab dem zweiten Tag post infection beobachtet und erreichte Spitzenwerte am 4., 10. und 14. Tag. Disseminierte Infektionen wurden am siebten Tag festgestellt, und lediglich eine einzige Mücke war am 10. Tag übertragungsfähig.

Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig, sicher und nicht schnell zu arbeiten. Infizierte oder potenziell infizierte Mücken sollten daher stets innerhalb eines Handschuhkastens oder eines Biosicherheitswerkbanks gehandhabt werden, bis ihre Beine oder Flügel entfernt wurden. Der grundlegende Workflow zur Vektorkompetenz kann angepasst werden, um infizierte Mücken für nachgeschaltete Analysen wie Übertragungsstudien zu erzeugen, sowie um die Wechselwirkungen zwischen Mücken, dem Virus und dem Mikrobiom zu untersuchen.

Die Vektorfähigkeit war bereits über viele Jahrzehnte hinweg ein äußerst wichtiges Instrument, um die Rolle von Mücken bei der Übertragung von Viren während Epidemien viraler Erkrankungen zu verstehen. Gleichzeitig ist es aber auch eine Methode, die sich im Laufe der Jahre weiterentwickelt hat, um neue Erkenntnisse über die Wechselwirkungen zwischen diesen Viren und den Mückenvektoren einzubeziehen, sobald sie verfügbar wurden. Nur zwei Beispiele hierfür: Die genetische Zusammensetzung der Viruspopulation sowie die Komplexität der Population innerhalb der Mücke erweisen sich als entscheidend für deren Übertragungsfähigkeit. Mithilfe neuer Sequenziermethoden für die Viruspopulation können wir diese Faktoren heute in Untersuchungen zur Vektorfähigkeit einbeziehen.

Wir wissen heute auch, dass die Population von Bakterien und anderen Organismen, die im Magen-Darm-Trakt der Mücke leben, einen erheblichen Einfluss auf deren Fähigkeit zur Übertragung haben kann, und wir können diese Population nun mit neuen Sequenziermethoden bewerten. Die Vektorkompetenz ist daher ein Verfahren, das sich weiterentwickelt hat und sich weiterentwickelt, während wir mehr über diese komplexen Wechselwirkungen erfahren.