Name: Vektorkompetenzanalysen an Aedes aegypti Mücken mit Zika-Virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Erfahren Sie die Methodik zur Analyse der Vektorkompetenz von Aedes aegypti für Zika-Virus-Übertragung. Dieses Protokoll ermöglicht präzise Risikobewertungen für gezielte Bekämpfungsstrategien.

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Wir danken den Mitarbeitern des World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton und Divya Mirchandani, für ihre unermüdliche Arbeit bei der Kuratierung und Bereitstellung vieler der Virusstämme, die für die Vektorkompetenzexperimente unserer und anderer Gruppen verwendet werden. Die vorgestellten Arbeiten wurden durch den McLaughlin Fellowship Fund (SRA) und die NIH-Zuschüsse AI120942 und AI121452 finanziert.

Alle in diesen Protokollen durchgeführten Verfahren wurden in voller Übereinstimmung mit den Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Biosafety Committee und dem Institutional Animal Care and Use Committee der University of Texas Medical Branch in Galveston genehmigt wurden.
1. ZIKV in Vero-Zellen verstärken
<ol><li>Züchten Sie Vero-Zellen (CCL-81 oder VeroE6) in Dulbeccos Modifikation von Eagles minimal essentiellem Medium (DMEM), ergänzt mit 10% v/v hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS) und 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin (100 U/ml bzw. 100 μg/ml) in einem befeuchteten 37 °C-Inkubator mit 5%CO2 bis 80−90% Konfluenz in einem 150 cm2 Gewebekulturkolben.</li>
	<li>Entfernen Sie in einer Biosicherheitswerkbank (BSC) das Medium und entsorgen Sie es entweder in 10% Bleichmittel oder einer Arbeitsverdünnung von dualem quartärem Ammonium (Materialtabelle). Impfen Sie die Monoschicht sofort mit 1 ml Virusbestand, mit dem Ziel, 0,1−1 infektiöse Viruspartikel pro Zelle zu erhalten. Den Kolben sofort so rühren, dass das Inokulum die Monoschicht in seiner Gesamtheit berührt.</li>
	<li>Füllen Sie das Medium auf ein Volumen von 5 ml mit DMEM auf, das mit 2% v / v wärmeinaktiviertem FBS und 1% (v / v) Penicillin-Streptomycin ergänzt wird. Dann den Kolben für 60 min in den befeuchteten 37 °C Inkubator mit5% CO2 geben.</li>
	<li>Nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und bringen Sie ihn in ein BSC. Fügen Sie zusätzliches Medium zu einem Gesamtvolumen von 15 ml hinzu, indem Sie DMEM verwenden, das mit 2% v / v wärmeinaktiviertem FBS und 1% (v / v) Penicillin-Streptomycin ergänzt wird. Den Kolben in einen befeuchteten 37 °C Inkubator mit 5 %CO2 stellen.</li>
	<li>Untersuchen Sie den Kolben täglich unter Phasenkontrastmikroskopie auf Hinweise auf zytopathische Wirkungen (CPE). Fahren Sie mit der Virusernte (Schritt 1.7) fort, wenn nur etwa 40-50% der Zellen in der Monoschicht verbleiben, in der Regel 3-5 Tage nach der Infektion, abhängig vom verwendeten ZIKV-Stamm.</li>
	<li>Den Überstand ansaugen und in eine konische Durchstechflasche mit 50 ml geben. Klären Sie den Überstand von Zelltrümmern durch Zentrifugation (3.500 x g für 20 min). HINWEIS: Wenn mehrere Kolben identisch infiziert waren, können Überstände aus mehreren Kolben zu konischen 50-ml-Röhrchen kombiniert werden.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand aus dem konischen 50-ml-Rohr zu einem frischen und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Ergänzen Sie den Überstand mit wärmeinaktiviertem FBS bis zu einer Endkonzentration von 30% (v/v). Aliquotieren Sie diese Mischung in einzelne Schraubverschlussrohre und frieren Sie bei -80 °C bis zum Gebrauch ein.</li>
</ol>2. Herstellung von künstlichen Blutmehlen
<ol><li>An dem Tag, an dem Moskitos infektiösen Blutmehlen ausgesetzt werden sollen, schalten Sie die Stromquelle ( Table of Materials ) in einer Arthropoden-Eindämmungseinrichtung so ein, dass die Fütterungseinheiten (Table of Materials) vorgewärmt sind, wenn die Moskitos für die Exposition vorbereitet sind.</li>
	<li>Bereiten Sie künstliche Blutmehle mit einer der unten beschriebenen Methoden vor.<ol>
<li>Methode 1: Frisch geerntetes (innerhalb einer Woche) zitriertes oder heparinisiertes menschliches Blut, das im Handel gekauft wurde, 1:1 v/v mit Virusmaterial (hergestellt wie in Abschnitt 1 beschrieben) kombinieren. HINWEIS: Diese Methode ist davon abhängig, dass im Blut keine Antikörper gegen das Virus/die Virusfamilie vorhanden sind.</li>
		<li>Wenn das Fehlen von Antikörpern nicht bestätigt werden kann oder bekannt ist, dass die Blutquelle zuvor flavivirusexpositioniert ist, waschen und verpacken Sie die Erythrozyten manuell.<ol>
<li>In einem BSC 30 ml menschliches Vollblut in ein 50 mL konisches Rohr geben und bis zu 50 ml mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auffüllen.</li>
			<li>Zentrifuge bei 3.500 x g für 20 min.</li>
			<li>Aspirieren Sie den Überstand entweder durch vorsichtiges Gießen in eine Schalenpfanne, die entweder 10% Bleichmittel enthält, oder durch Arbeitsverdünnung von dualem quartärem Ammonium, wobei darauf zu achten ist, dass das Erythrozytenpellet nicht verworfen wird.</li>
			<li>Fügen Sie 10 ml PBS hinzu und klopfen Sie vorsichtig auf den Boden des konischen Röhrchens gegen den Boden des BSC, so dass das Erythrozytenpellet rekonstituiert wurde. Bringen Sie das Volumen der Suspension mit PBS auf bis zu 50 ml. Durch sanfte Inversion mischen.</li>
			<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2.1−2.2.2.4 insgesamt 4−6x. Bestätigen Sie, dass der Überstand klar oder nur leicht rosa und nicht mehr undurchsichtig ist. Entfernen Sie den gesamten Überstand mit einer serologischen Pipette. Resuspendieren Sie das Erythrozytenpellet in 1−2 ml PBS.</li>
			<li>Setzen Sie das Blutmehl zusammen: 350 μL gepackte Erythrozyten, 100 μL 10% Saccharose, 200 μL hitzeinaktiviertes FBS, 900 μM rekombinantes ATP und 2 ml entsprechend verdünntes Virusmaterial unter Verwendung von DMEM, ergänzt mit 2% v/v hitzeinaktiviertem FBS und 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Überlagern Sie eine Standard-3-ml-Reservoireinheit(Materialtabelle)mit der Haut einer nicht infizierten Maus (andere Optionen umfassen Paraffinfilm, kollagene Membranen oder Wursthülle).</li>
	<li>Legen Sie den überdachten Behälter auf weiße Papiertücher. Fügen Sie ~ 2 ml infektiöses Blutmehl zu dem Reservoir 1 ml auf einmal hinzu. Untersuchen Sie das Handtuch unter dem Feeder auf Anzeichen von Leckagen. Wenn Leckagen vorhanden sind, holen Sie das Blutmehl aus den Feedern zurück und entsorgen Sie die Abdeckungen. Verschließen Sie die Feeder mit Stopfen. Bestätigen Sie erneut, dass keine Lecks vorhanden sind.</li>
</ol>3. Backtitration von Blutmehl/Plaque-Assay
<ol><li>Unter Verwendung des verbleibenden Volumens des vorbereiteten Blutmehls wird eine 10-fache serielle Verdünnungsreihe (d. h. 6 Verdünnungen, die von 10x bis 1.000.000x verdünnt sind) unter Verwendung von DMEM, ergänzt mit 2% v/v wärmeinaktiviertem FBS und 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin, durchgeführt.</li>
	<li>Aliquot 100 μL der Verdünnungen in die Vertiefungen von 24 oder 12 Well Platten von den am meisten verdünnten bis zu den konzentriertesten.</li>
	<li>Inkubieren Sie für 1 h in einem 37 °C, 5% CO2 Inkubator.</li>
	<li>Am Ende der 1-stündigen Inkubationszeit werden die Platten wieder in das BSC gebracht und 1 ml oder 2 ml Methylcellulose-Overlay entsprechend in die 24 Well- oder 12 Well-Platten gegeben.</li>
	<li>Legen Sie die überlagerten Platten wieder in einen 37 °C, 5%CO2-Inkubator und inkubieren Sie für 3-7 Tage (virusstammabhängig).</li>
	<li>Nach der Inkubation die Platten aus dem Inkubator entfernen und in den BSC bringen. Entsorgen Sie das Methylcellulose-Overlay in eine Schalenpfanne, die 10% Bleichmittel oder duales quartäres Ammoniumdesinfektionsmittel enthält.</li>
	<li>Waschen Sie jede Vertiefung 2x mit PBS und entsorgen Sie die Wäsche in eine Schalenpfanne mit 10% Bleichmittel oder dualem quartärem Ammonium.</li>
	<li>Fügen Sie ~ 1 ml Methanol: Aceton (1: 1 v: v) hinzu und lassen Sie die Zellen mindestens 30 minuten lang im BSC bei Raumtemperatur (RT) auf der Platte fixieren. Entsorgung von Methanol:Aceton gemäß der institutionellen Politik für organische Abfälle.</li>
	<li>Visualisieren Sie ZIKV mit einer von zwei unten beschriebenen Methoden.<ol>
<li>Nach der Entfernung von Methanol:Aceton sofort mit einer kristallvioletten Lösung (0,25% w/v in 30% Methanol) für 5 min einfärben. 2x in Leitungswasser abspülen und trocknen lassen, dann direkt mit dem Auge sichtbar machen, um Hinweise auf Plaques oder Zerstörung der Monoschicht zu erhalten.</li>
		<li>Alternativ können Sie einen Fokusformungsassay durchführen.<ol>
<li>Lassen Sie die Platten an der Luft trocknen, bis kein organisches Fixiermittel mehr übrig ist. HINWEIS: Dies sollte ~ 2−3 h außerhalb des BSC dauern, kann aber durch Lufttrocknung in einem BSC oder chemischen Abzug beschleunigt werden.</li>
			<li>Jede Vertiefung 3x für jeweils 15 min in nichtsterilem PBS(Mg2+ und Ca2+ frei) auf einer Orbitalplattenwippe waschen. Entfernen Sie PBS und geben Sie 1 ml Blockierungslösung (PBS + 3% FBS) zu jeder Vertiefung und gestein für 15 min bei RT.</li>
			<li>100 μL pro Vertiefung α-ZIKV- oder α-Flavivirus-Primärantikörper (z. B. Flavivirus-Gruppenhybrioma D1-4G2-4-15 [4G2]) in einer Verdünnung von 1:2.000 in Blocklösung zugeben. Inkubieren mit Schaukeln für mindestens 4 h (vorzugsweise über Nacht, nicht mehr als 18 h) bei RT.</li>
			<li>Den primären Antikörper entfernen und 3x für jeweils 15 min mit PBS(Mg2+ und Ca2+ frei) auf einer Orbitalplattenwippe waschen.</li>
			<li>Fügen Sie 100 μL pro Vertiefung des sekundären Antikörpers (Ziegen- α Maus-HRP-markiert) hinzu, der 1:2.000 in blocking buffer verdünnt ist. Inkubieren Sie mit Schaukeln für 1 h bei RT.</li>
			<li>3x für je 15 min mit PBS (Mg2+ und Ca2+ frei) auf einer Orbitalplattenwippe waschen.</li>
			<li>Aliquot 100 μL Substratentwicklungsreagenz (Materialtabelle) pro Vertiefung. Gesteinsplatten bei RT für 15 min.</li>
			<li>Stoppen Sie die Reaktion bei der Entwicklung von Herden / Plaques, indem Sie das Substrat entfernen und die Platten 2x mit Leitungswasser spülen. Gießen Sie Leitungswasser ab und lassen Sie die Platten vor der Quantifizierung an der Luft trocknen.</li>
			<li>Zählen Sie virale Herde, um die Anzahl der in der gegebenen Probe vorhandenen FFU zu bestimmen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Verabreichung von Blutmehl
<ol><li>Verwenden Sie Ae. aegypti Moskitos 2-4 Tage nach der Eklosion. Sortieren Sie weibliche Moskitos in 0,5-Liter-Kartons mit abgeschirmten Deckeln und entziehen Sie ihnen Zucker (im Allgemeinen 36-48 h vor dem infektiösen Blutmehl). Geben Sie ad libitum Wasser über wassergesättigte Wattebällchen.</li>
	<li>Entfernen Sie die wassergesättigten Wattebällchen an dem Morgen, an dem die Moskitos dem infektiösen Blutmehl ausgesetzt sind.</li>
	<li>Befestigen Sie Behälter mit künstlichen Blutmehlen an den Leitungen der Fütterungseinheit in einem durchsichtigen Kunststoffhandschuhfach.</li>
	<li>Legen Sie im Handschuhfach einen 0,5-Liter-Karton mit einem abgeschirmten Deckel mit 50−100 ausgehungerten Ae. aegypti-Mücken unter die am Reservoir befestigte Futtereinheit. HINWEIS: Entsprechend ausgehungerte Moskitos fressen in der Regel innerhalb von 20 Minuten. Die Fütterung kann bei Bedarf verlängert werden, um die Stichprobengröße in langsameren Populationen zu erhöhen, obwohl dies nicht über 60 minuten hinausgehen sollte, da der (ZIKV) Virustiter nach ~ 60 minuten im Feeder abnehmen kann.</li>
	<li>Nach Abschluss der Fütterung entfernen Sie das Reservoir und tauchen Sie es in frisch hergestelltes 10% Bleichmittel ein.</li>
	<li>Kaltanästhesieren Sie Moskitos durch Inkubation für 30 s bei -20 ° C oder für 5 minuten im Kühlschrank.</li>
	<li>Gießen Sie die Moskitos im Handschuhfach in eine Petrischale auf Eis. Zählen und sortieren Sie die geschwollenen Weibchen von ungeschmiedeten Moskitos. Entsorgen Sie die ungefederten Moskitos durch Eintauchen in ein 50 ml langes konisches Röhrchen, das mit 70% Ethanol gefüllt ist. Während die Moskitos noch betäubt sind, gießen Sie sie zurück in den 0,5 L Karton und decken Sie sie schnell mit dem Bildschirm und dem Deckel ab. Schneiden Sie überschüssiges Siebnetz vom Karton ab und sichern Sie das Netz mit Klebeband.</li>
	<li>Fügen Sie einen Wattebausch hinzu, der mit steriler gefilterter 10% wässriger Saccharose gesättigt ist, zum Sieb jedes Kartons. Legen Sie alle Mückenkartons in einen großen Sekundärbehälter aus Kunststoff mit einem feuchten Schwamm, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Stellen Sie einen sekundären Behälter mit Kartons mit Moskitos in einen Inkubator mit einer Temperatur von 27 ± 1 ° C (oder je nach Bedarf zur Simulation von Bedingungen in der Region von Interesse) mit 80% ± 10% relativer Luftfeuchtigkeit und einem 16: 8 Hell: Dunkel-Zyklus). Halten Sie die Moskitos mit Ad-libitum-Zugang zu 10% Saccharose bis zum Abschluss der Experimente aufrecht.</li>
</ol>5. Probenentnahme und -verarbeitung
<ol><li>An bestimmten Tagen nach der Fütterung saugen Sie eine vorbestimmte Anzahl von Moskitos aus den entsprechenden Kartons mit einem mechanischen Aspirator in einem Handschuhfach ab. Schließen Sie das Auffangrohr mit einer Baumwollrunde ab, nachdem die erforderliche Anzahl von Moskitos erworben wurde.</li>
	<li>Kaltanästhesie von Moskitos durch Inkubation für 30 Sekunden bei -20 ° C oder für 5 Minuten bei 4 ° C.</li>
	<li>Gießen Sie die Moskitos im Handschuhfach in eine Petrischale auf Eis. Entfernen Sie mit zwei Pinzettenpaaren alle sechs Beine jeder Mücke und legen Sie sie in ein voretikettiertes 2 ml rundes Mikrozentrifugenrohr mit einem sterilisierten Edelstahlkugellager (7/32 ") und 500 μL Mückensammelmedium (MCM), bestehend aus DMEM, 2% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin und 2,5 μg / ml Amphotericin.</li>
	<li>Legen Sie die Mücke vorsichtig auf einen Tropfen Mineralöl, um sie zurückzuhalten, und achten Sie darauf, dass kein Kontakt zwischen dem Öl und dem Kopf und dem Rüssel der Mücke zulässt.</li>
	<li>Führen Sie den Mückenboss in eine 10 μL Pipettenspitze ein, die mit 10 μL wärmeinaktiviertem FBS gefüllt ist. HINWEIS: Alternativ kann die Pipette mit Saccharose, Blut oder Mineralöl gefüllt werden. Das Öl ermöglicht die direkte Visualisierung von Speichelblasen mittels Lichtmikroskopie.</li>
	<li>Lassen Sie die Mücke 30 Minuten lang speicheln. Werfen Sie die Mikropipettenspitze, die FBS + Speichel enthält, in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 μL MCM aus und legen Sie dann den Korpus in ein separates 2 ml rundes Mikrozentrifugenrohr mit einem sterilisierten Stahlkugellager und 500 μL MCM. Stellen Sie sicher, dass die für Körper, Beine und Speichel verwendeten Röhrchen so gekennzeichnet sind, dass klar ist, dass alle drei Proben von derselben Mücke stammen.</li>
	<li>Während die Mücken speicheln, führen Sie die Schritte 5,3-5,5 bei den verbleibenden Moskitos durch.</li>
	<li>Transportieren Sie die Röhrchen, die die Körper und Beine enthalten, zu einer Homogenisierungsvorrichtung für das Perlenmahlgewebe, die in einem BSC enthalten ist. Alle Körper- und Beinproben bei 26 Hz für 5 min verdrieren, um virale Partikel in den Überstand freizusetzen. Klären Sie alle Proben durch Zentrifugation bei 200 x g für 5 min, um Zelltrümmer zu pelletieren. HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Proben bei -80 °C eingefroren oder sofort untersucht werden.</li>
</ol>6. Nachweis von ZIKV durch Infektiologie-Assay
<ol><li>Bereiten Sie in einem BSC 24 h vor Beginn des infektiösen Assays 24 Well-Gewebekulturplatten mit Vero-Zellen (105 Zellen pro Well) vor. Beschriften Sie jede Vertiefung mit der Identität einer einzelnen Mücke / Probe.</li>
	<li>Wenn die Proben bei -80 °C eingefroren wurden, lassen Sie sie auftauen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium vor der Impfung mit Proben eine Platte nach der anderen von den Vero-Zellplatten.</li>
	<li>Bei Proben, die Körper oder Beine enthalten, vorsichtig 100 μL geklärten Überstand in jede Vertiefung aliquotieren, wobei darauf zu achten ist, dass die Mückenzellablagerungen aus dem Pellet nicht gestört werden. HINWEIS: Speichelproben können vor der Impfung auf Zellen 1:1 (v/v) mit MCM verdünnt werden, um die Proben für eine spätere Titration zu konservieren, falls erforderlich.</li>
	<li>Die Platten in einen 37 °C, 5%CO2-Inkubator geben und 1 h inkubieren.</li>
	<li>Bringen Sie die Platten zum BSC zurück und fügen Sie ~ 1 ml Methylcellulose-Overlay zu jeder Vertiefung hinzu. Legen Sie die überlagerten Platten wieder in einen 37 °C, 5%CO2-Inkubator und inkubieren Sie sie für 3−7 Tage (virus-/stammabhängig).</li>
	<li>Führen Sie die Fixierung und Visualisierung wie in den Schritten 3.6 bis 3.9 beschrieben durch.</li>
	<li>Quantifizieren Sie in Bezug auf das Scoring über einen Fokusformungsassay die positiven Vertiefungen durch Untersuchung unter einem Lichtmikroskop. Der Nachweis einer intrazytoplasmatischen Färbung von Zellen in einem Brunnen weist auf das Vorhandensein eines Virus hin. Stichproben werden ausschließlich als Fokus-positiv oder -negativ bewertet.</li>
</ol>

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<li>Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fever+from+the+forest%3A+prospects+for+the+continued+emergence+of+sylvatic+dengue+virus+and+its+impact+on+public+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).</li>
<li>Vasilakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+ancestral+sylvatic+dengue-2+viruses+to+re-emerge%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge.</a> Virology. 358 (2), 402-412 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Die hier beschriebenen Methoden bieten einen verallgemeinerten Workflow zur Durchführung von Vektorkompetenzanalysen. Als allgemeiner Rahmen sind viele dieser Methoden in der Literatur erhalten. Es gibt jedoch erheblichen Spielraum für Änderungen (überprüft in Azar und Weaver1). Virus (z. B. virale Abstammung, Speicherung des Challenge-Virus, virale Passage-Geschichte), Entomologie (z. B. Laborbesiedlung von Mückenpopulationen, angeborene Immunität, das Mückenmikrobiom / -virom) und experimentelle...

Vektorkompetenz ist definiert als die Fähigkeit auf der Ebene der Art, der Population und sogar eines Individuums eines bestimmten Arthropoden wie einer Mücke, Zecke oder Phlebotin-Sandfliege, einen Wirkstoff biologisch mit Replikation oder Entwicklung im Arthropoden zu erwerben und zu übertragen1,2. In Bezug auf Moskitos und durch Arthropoden übertragene Viren (dh Arboviren) wird das Mittel von einem virämischen Wirt von einer weiblichen Mücke aufgenommen. Nach der Einnahme muss das Virus produktiv eine aus einer kleinen Population von Mitteldarmepithelzellen infizieren3und verschiedene physiologische Hindernisse wie den proteolytischen Abbau durch Verdauungsenzyme, das Vorhandensein der Mikrobiota (Mitteldarminfektionsbarriere oder MIB) und die sezernierte peritrophe Matrix überwinden. Auf die Infektion des Mitteldarmepithels muss eine Replikation des Virus und ein eventueller Austritt aus dem Mitteldarm in das offene Kreislaufsystem der Mücke oder Hämolymphe folgen, was den Beginn einer disseminierten Infektion darstellt, die die Mitteldarmfluchtbarriere (MEB) überwindet. Zu diesem Zeitpunkt kann das Virus Infektionen von sekundärem Gewebe (z. B. Nerven, Muskeln und Fettkörper) aufbauen und sich weiter replizieren, obwohl eine solche sekundäre Replikation möglicherweise nicht unbedingt notwendig ist, damit das Virus die Azinuszellen der Speicheldrüsen infizieren kann (Überwindung der Speicheldrüseninfektionsbarriere). Der Austritt aus den Acinarzellen der Speicheldrüse in ihre apikalen Hohlräume und die anschließende Bewegung in den Speichelgang ermöglicht die Impfung des Virus in nachfolgende Wirte beim Beißen und schließt den Übertragungszyklus1,2,4,5,6,7ab .
Angesichts dieses gut charakterisierten und allgemein erhaltenen Ausbreitungsmechanismus innerhalb eines Mückenvektors sind Laborvektor-Kompetenzbewertungen oft methodisch ähnlich, obwohl Unterschiede in den Protokollen bestehen1,2. Im Allgemeinen werden Moskitos nach oraler Virusexposition so seziert, dass einzelne Gewebe wie Mitteldarm, Beine, Eierstöcke oder Speicheldrüsen auf Virusinfektion, disseminierte Infektion, disseminierte Infektion / potenzielle transovariale Übertragung bzw. disseminierte Infektion / potenzielle Übertragungskompetenz untersucht werden können8. Das bloße Vorhandensein eines Virus in den Speicheldrüsen ist jedoch kein endgültiger Beweis für die Übertragungsfähigkeit, da hinweise auf eine Speicheldrüsen-Flucht-/Austrittsbarriere (SGEB) in einigen Vektor/Virus-Kombinationen1,2,4,5,7,9. Die Standardmethode zum Nachweis der Übertragungskompetenz bleibt die Mückenübertragung auf ein anfälliges Tier10,11,12. Da dies jedoch für viele Arboviren die Verwendung von immungeschwächten murinen Modellen13,14,15,16erfordert , ist diese Methode oft unerschwinglich. Eine häufig verwendete Alternative ist die Sammlung des Mückenspeichels, der durch reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) oder einen infektiösen Assay analysiert werden kann, um das Vorhandensein des viralen Genoms bzw. infektiöser Partikel nachzuweisen. Es ist erwähnenswert, dass solche In-vitro-Speichelentnahmemethoden12 oder 17 der während der In-vivo-Fütterung abgelagerten Virusmenge überschätzen oder unterschätzen können, was darauf hindeutet, dass solche Daten mit Vorsicht interpretiert werden müssen. Nichtsdestotrotz ist die In-vitro-Methode sehr wertvoll, wenn sie aus der Perspektive des bloßen Vorhandenseins von Viren im Speichel analysiert wird, was auf ein Übertragungspotenzial hinweist.
Es gibt zwei Hauptansätze, um die Rolle von Mückenvektoren bei arboviralen Krankheitsausbrüchen zu bestimmen. Die erste Methode beinhaltet die Feldüberwachung, bei der Moskitos im Rahmen der aktiven Übertragung18,19, 20,21,22,23,24gesammelt werden . Angesichts der Tatsache, dass die Infektionsraten jedoch in der Regel recht niedrig sind (z. B. die geschätzte Infektionsrate von Moskitos von 0,061% in Gebieten mit aktiver Zirkulation des Zika-Virus (ZIKV) in den Vereinigten Staaten21),kann die Belastung potenzieller Vektorarten durch die Fangmethodik25,26 und den Zufall (z. B. Probenahme einer infizierten Person von 1.600 nicht infizierten Personen) stark verzerrt sein21 . Unter Berücksichtigung dieser Tatsache kann eine bestimmte Studie nicht genügend Moskitos sowohl in der Rohzahl als auch in der Artenvielfalt erfassen, um Mücken, die an der Übertragung beteiligt sind, genau zu beproben. Im Gegensatz dazu werden Vektorkompetenzanalysen in einem Labor durchgeführt, was eine strenge Kontrolle von Parametern wie der oralen Dosis ermöglicht. Obwohl diese Laborbewertungen nicht vollständig in der Lage sind, die wahre Komplexität der Mückeninfektion und -übertragungsfähigkeit in einer Feldumgebung darzustellen, bleiben diese Laborbewertungen leistungsstarke Werkzeuge auf dem Gebiet der Arbovirologie.
Basierend auf verschiedenen Vektorkompetenzanalysen mit ZIKV in mehreren Mückenarten, Populationen und Methoden27,28,29,30,31,32, sowie einer aktuellen Überprüfung von Vektorkompetenzbewertungen 1 beschreiben wir hier einige der Protokolle, die miteinemtypischen Vektorkompetenz-Workflow verbunden sind. In diesen Experimenten wurden drei Ae. aegypti-Populationen aus Amerika (der Stadt Salvador, Brasilien; der Dominikanischen Republik; und dem unteren Rio Grande Valley, TX, USA) einem einzigen Stamm von ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) bei 4, 5 oder 6 log10 focus-forming units (FFU) / ml Dosen durch künstliche Blutmehle ausgesetzt. Anschließend wurden sie nach verschiedenen Zeiten extrinsischer Inkubation (2, 4, 7, 10 und 14 Tage) mittels Dissektion und einem zellkulturbasierten Infektionstest auf Hinweise auf Infektion, disseminierte Infektion und Übertragungskompetenz analysiert. Obwohl die derzeitigen Arbeitsabläufe/Protokolle für ZIKV optimiert sind, sind viele Elemente in den Arthropoden-Eindämmungs- und Biosicherheitsstufen 2 und 3 (ACL/BSL2 oder ACL/BSL3) direkt auf andere durch Mücken übertragene Arboviren übertragbar.

<table><tbody><tr><td>3mL Standard Reservoir</td><td>R37P30</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insektenausrüstung</td></tr><tr><td>7/32" Edelstahl 440 Grad C Kugeln</td><td>4RJH9</td><td>Grainger</td><td>Schleifkörper</td></tr><tr><td>Aceton, histologische Qualität, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Karton</td><td>A16-P4</td><td>FisherScientific</td><td>Fixiermittel</td></tr><tr><td>Adenosin 5'-triphospat Dinatriumsalzhydrat, mikrobiell, BioReagenz, geeignet für Zellen Kultur</td><td>A6419-1G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Anti-Flavivirus-Gruppe Antigen Antikörper, Klon D1-4G2-4-15</td><td>MAB10216</td><td>MilliporeSigma</td><td>Primärer Antikörper für fokusbildenden Assay</td></tr><tr><td>Anti-Maus IgG (H+L) Antikörper, humanes Serum adsorbiert und peroxidase-markiert, 1,0 ml/Flasche</td><td>5450-0011</td><td>KPL/Seracare</td><td>Sekundärer Antikörper für fokusbildenden</td></tr><tr><td>Assay Bleiche</td><td>NC0427256</td><td>FisherScientific</td><td>Dekontamination</td></tr><tr><td>Corning, mit Zellkulturen behandelte Kolben, 150 cm2, belüfteter Deckel, Karton mit 50</td> Stück <td>10-126-34</td><td>FisherScientific</td><td>Verbrauchsmaterial für Zellkulturen</td></tr><tr><td>Costar Zellkulturplatten, 24 Wells, 5/Beutel, 100/Karton, Corning</td><td>07-200-740</td><td>FisherScientific</td><td>Zellkultur-Verbrauchsmaterial</td></tr><tr><td>Costar Zellkulturplatten, 96 Wells, 5/Beutel, 100/Karton, Corning</td><td>07-200-91</td><td>FisherScientific</td><td>Verbrauchsmaterial für Zellkulturen</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>C0775-100G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Stain</td></tr><tr><td>Eppendorf Snap Cap Mikrozentrifuge Safe-Lock 2 ml-Röhrchen, 500/Karton</td><td>05-402-7</td><td>FisherScientific</td><td>Kunststoff-Verbrauchsmaterial</td></tr><tr><td>Falcon 15 ml konische Zentrigue-Röhrchen</td><td>14-959-70C</td><td>FisherScientific</td><td>Kunststoff-Verbrauchsmaterial</td></tr><tr><td>Falcon 50 ml konische Zentrigue-Röhrchen</td><td>14-959-49A</td><td>FisherScientific</td><td>Kunststoff-Verbrauchsmaterial</td></tr><tr><td>Falcon Serologische Einwegpipetten aus Polystyrol 10 ml, 200/Karton</td><td>13-675-20</td><td>FisherScientific</td><td>Kunststoff-Verbrauchsmaterial</td></tr><tr><td>Falcon Serologische Einwegpipetten aus Polystyrol 1 ml, 1000/Karton</td><td>13-675-15B</td><td>FisherScientific</td><td>Kunststoff-Verbrauchsmaterial</td></tr><tr><td>Falcon Serologische Einwegpipetten aus Polystyrol 25 ml, 200/Karton</td><td>13-675-30</td><td>FisherScientific</td><td>Kunststoff-Verbrauchsmaterial</td></tr><tr><td>Falcon Serologische Einwegpipetten aus Polystyrol, 5 ml, 200/Karton</td><td>13-675-22</td><td>FisherScientific</td><td>Kunststoff-Verbrauchsmaterial</td></tr><tr><td>Falcon Standard-Gewebekulturschalen</td><td>08-772B</td><td>FisherScientific</td><td>Kunststoff-Verbrauchsmaterial</td></tr> für <tr><td>fötales Rinderserum-Premium, 500 ml</td><td>S11150</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>Zellkultur-Reagenz</td></tr><tr><td>Fisherbrand Economy Mikroskopobjektträger aus Glas</td><td>12-550-A3</td><td>FisherScientific</td><td>Immobilisierung von Mücken</td></tr><tr><td>FU1 Feeder</td><td>FU1-0</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insektenausrüstung; Fütterungseinheiten</td></tr><tr><td>Gibco DPBS mit Calcium und Magnesium, 10 x 500 mL Flaschen</td><td>140-040-182</td><td>FisherScientific</td><td>Zellkulturreagenz</td></tr><tr><td>Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250 μm; g/ml, 50 ml/Flasche</td><td>15-290-026</td><td>Fisher Scientific</td><td>Zellkulturreagenz</td></tr><tr><td>Gibco Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml), 100 ml/Flasche, 20 Flaschen/Karton</td><td>15-140-163</td><td>FisherScientific</td><td>Zellkulturreagenz</td></tr><tr><td>Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenolrot, 20 x 100 ml Flaschen</td><td>25-200-114</td><td>FisherScientific</td><td>Zellkulturreagenz</td></tr><tr><td>Gibcom DMEM, hoher Glukosegehalt, 10 x 500 ml Flaschen</td><td>11-965-118</td><td>FisherScientific</td><td>Zellkultur-Reagenz</td></tr><tr><td>Menschliches Blut, nicht näher bezeichnetes Geschlecht, Na-Citrat, 1 Einheit</td><td>7203706</td><td>Lampire</td><td>Bloodmeal Zubereitung</td></tr><tr><td>InsectaVac Aspirator</td><td>2809B</td><td>Bioquip</td><td>Insektenausrüstung</td></tr><tr><td>Methanol, zertifiziertes ACS, Fisher Chemicals, Braunglasflasche, 4L, 4/Karton</td><td>A412-4</td><td>FisherScientific</td><td>Fixiermittel</td></tr><tr><td>Methylcellulose, Viskosität: 3.500-5.600 cP, 2 % in Wasser (20 &de; C), 250g/Flasche</td><td>M0512-250G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Zellkultur-Reagenz</td></tr><tr><td>Micro-chem Plus Desinfektionsmittel Reinigungsmittel</td><td>C849T34</td><td>Thomas Scientific</td><td>Dekontamination; Arbeitsverdünnung von dualem quartärem Ammonium</td></tr><tr><td>Mineralöl, BioReagenz, für die Molekularbiologie</td><td>M5904-5X5ML</td><td>MilliporeSigma</td><td>Immobilisierung von Moskitos</td></tr><tr><td>O-Ringe</td><td>OR37-25</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insektenausrüstung</td></tr><tr><td>Kunststoffstopfen</td><td>PP5-250</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insektenausrüstung</td></tr><tr><td>PS6 Netzteil (110-120V)</td><td>PS6120</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insektenausrüstung; Stromquelle</td></tr><tr><td>Rubis Pinzette, Offset-Klingen, superfeine Spitzen</td><td>4525</td><td>Bioquip</td><td>Insektenausrüstung</td></tr><tr><td>Sarstedt Inc., 2 ml Mikroröhrchen mit Schraubverschluss, konischer Boden, O-Ring-Kappe, steril, 1000/Karton</td><td>50-809-242</td><td>FisherScientific</td><td>Kunststoff-Verbrauchsmaterial</td></tr><tr><td>Saccharose, BioUltra, für die Molekularbiologie</td><td>84097-250G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barriere Niedrige Retention 1000 μm; L Pipettenspitzen, 100 Spitzen/Rack, 8 Racks/Packung, 4 Packungen/Karton</td><td>21-402-487</td><td>FisherScientific</td><td>Kunststoff-Verbrauchsmaterial</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200&mu; L Pipettenspitzen, 96 Spitzen/Rack, 10 Racks/Packung, 5 Packungen/Karton</td><td>21-402-486</td><td>FisherScientific</td><td>Kunststoff-Verbrauchsmaterial</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20&mu; L Pipettenspitzen, 96 Spitzen/Rack, 10 Racks/Packung, 5 Packungen/Karton</td><td>21-402-484</td><td>FisherScientific</td><td>Kunststoff-Verbrauchsmaterial</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10&mu; L Pipettenspitzen, 96 Spitzen/Rack, 10 Racks/Packung, 5 Packungen/Karton</td><td>21-402-482</td><td>FisherScientific</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>85300</td><td>QIAGEN</td><td>Homogenisierung</td></tr><tr><td>TrueBlue Peroxidase Substrat Kit, 200 ml</td><td>5510-0030</td><td>Seracare</td><td>Entwicklungslösung für fokusbildende Assays</td></tr><tr><td>Vero</td><td>CCL-81</td><td>American Type Culture Collection</td><td>Säugetierzelllinie zur Amplifikation des Virus und zur Durchführung eines infektiösen Assays</td></tr><tr><td>Vero C1008 [Vero 76, Klon E6, Vero E6]</td><td>CRL-1586</td><td>Amerikanische Kultursammlung</td><td>Säugetierzelllinie zur Amplifikation des Virus und zur Durchführung eines infektiösen Assays</td></tr></tbody></table>

vektorkompetenzanalysen an aedes aegypti mücken mit zika-virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Die vorgestellten Verfahren beschreiben eine verallgemeinerte Methodik zur Infektion von Aedes aegypti-Mücken mit dem Zika-Virus unter Laborbedingungen, um die Infektionsrate, die disseminierte Infektion und die mögliche Übertragung des Virus in der betreffenden Mückenpopulation zu bestimmen. Diese Verfahren werden weltweit mit verschiedenen Modifikationen in der Vektorkompetenzbewertung eingesetzt. Sie sind wichtig für die Bestimmung der potenziellen Rolle, die eine bestimmte Mücke (dh Art, Population, Individuum) bei der Übertragung eines bestimmten Erregers spielen kann.

Drei Populationen von Ae. aegypti aus Amerika (Salvador, Brasilien; die Dominikanische Republik; und das Rio Grande Valley, TX, USA) wurden einem Ausbruchsstamm von ZIKV aus Amerika (ZIKV Mex 1-7, Chiapas State, Mexiko, 2015) über eine Reihe von Blutmehltitern (4, 5 und 6 log10 FFU / ml) ausgesetzt, die in einem gewaschenen künstlichen Blutmehl auf der Basis von menschlichen Erythrozyten präsentiert wurden. An den Tagen 2, 4, 7, 10 und 14 nach der Infektion wurden Untergruppen von Moskitos verarbeitet...

Das vorgestellte Protokoll kann die Vektorkompetenz von Aedes aegypti-Mückenpopulationen für ein bestimmtes Virus, wie Zika, in einer Containment-Umgebung bestimmen.

Vektorkompetenzanalysen an Aedes aegypti Mücken mit Zika-Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Bei von Arboviren verursachten Ausbrüchen beschränken sich Gegenmaßnahmen weitgehend auf die Bekämpfung von Mücken. Daher sind Analysen zur Vektorfähigkeit entscheidende Präventionsstrategien, da sie bestimmen, welche Populationen und Arten von Mücken als Vektoren für ein bestimmtes Arbovirus fungieren können und deshalb gezielt bekämpft werden sollten. Eine der wichtigsten Komponenten in unserem Instrumentarium zur Beurteilung der Rolle von Mücken und anderen Vektoren bei der Übertragung infektiöser Krankheiten ist daher die Untersuchung der Vektorfähigkeit. Dabei handelt es sich um Experimente, bei denen wir nicht nur die Mückenart oder beispielsweise Zeckenart, sondern auch geografische Stämme sowie sehr spezifische Stämme unterschiedlicher Viren oder anderer infektiöser Organismen präzise kontrollieren können, um äußerst genaue und gut kontrollierte Daten über das Übertragungsrisiko verschiedener Arten für unterschiedliche Erreger in ganz bestimmten Weltregionen zu erhalten. Die Arbeit mit infizierten Mücken erfordert spezielle Einrichtungen, Schulungen, Erfahrung und sorgfältige Planung, um die Risiken für den Experimentator sowie die Gefahr entkommender, infizierter Mücken zu minimieren. Es ist daher für neue Mitarbeiter in solchen Einrichtungen äußerst wichtig, sich zunächst mit nicht infizierten Blutmücken vertraut zu machen, um die Techniken und Arbeitsabläufe zu erlernen.Am Tag der Exposition schalten Sie die Stromquelle in einer Arthropoden-Containment-Einrichtung ein, um die Fütterungseinheiten vorzuwärmen. Mischen Sie frisch gewonnenes zitronensäurehaltiges oder heparinisierter menschliches Blut im Volumenverhältnis 1:1 mit einer Virusstammlösung und befüllen Sie ein standardmäßiges Drei-Milliliter-Reservoir mit der Haut einer naiven, nicht infizierten Maus. Stellen Sie das abgedeckte Reservoir auf weiße Papiertücher und geben Sie etwa zwei Milliliter infektiöses Blut portionsweise je ein Milliliter in das Reservoir.Danach mit Papiertüchern überprüfen, um sicherzustellen, dass keine Undichtigkeiten vorliegen. 24 Stunden vor der Durchführung des Infektionsassays 24-Loch-Zellkulturplatten mit Vero-Zellen vorbereiten und jedes Loch mit der Identität der jeweiligen Mücke und Probe beschriften. Am Morgen, an dem die Mücken der infektiösen Blutmahlzeit ausgesetzt werden, die wassergesättigten Wattebäusche entfernen und die Reservoirs mit den künstlichen Blutmahlzeiten mithilfe einer durchsichtigen plastischen Schutzhaube an die Zuführungen der Fütterungseinheit anschließen.Stellen Sie den Pappkarton mit den verhungerten Mücken in die Handschuhbox unterhalb der Fütterungseinheit. Entfernen Sie nach Beendigung der Fütterung das Reservoir und tauchen Sie es in frisch zubereitete 10 %ige Bleichlösung. Gießen Sie innerhalb der Handschuhbox die kalt betäubten Mücken in eine Petrischale auf Eis und sortieren Sie die vollgesogenen von den nicht vollgesogenen Mücken.Geben Sie die aufgefüllten Mücken zurück in den Pappkarton und decken Sie diesen schnell mit einem Sieb und einem Deckel ab. Schneiden Sie das überschüssige Siebgewebe am Karton ab und befestigen Sie den Deckel mit Klebeband. Fügen Sie einen mit steriler, filtrierter 10%iger Saccharose gesättigten Wattebausch auf das Sieb hinzu und stellen Sie den Karton in einen großen sekundären Kunststoffbehälter mit einem feuchten Schwamm, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.Brüten Sie den sekundären Behälter bei 27 Grad Celsius aus und gewähren Sie den Mücken bis zum Abschluss der Experimente ad libitum-Zugang zum Saccharose. Verwenden Sie einen mechanischen Aspirator, um eine vorbestimmte Anzahl inkubierter Mücken aus der Schachtel zu entnehmen, und verschließen Sie das Sammelröhrchen nach Beendigung mit einem Wattebausch. Arbeiten Sie innerhalb des Handschuhkastens und geben Sie die kaltnarkotisierten Mücken in eine auf Eis liegende Petrischale. Entfernen Sie alle sechs Beine jedes Moskitos und geben Sie sie in ein vorab beschriftetes zwei Milliliter fassendes Mikrozentrifugenröhrchen mit einer sterilisierten Edelstahlkugel und 500 Mikrolitern Moskito-Sammelmedium (MCM). Legen Sie das Moskito vorsichtig auf einen Tropfen Mineralöl, wobei darauf geachtet werden muss, dass das Öl nicht mit dem Kopf oder dem Saugrüssel des Moskitos in Kontakt kommt. Führen Sie den Saugrüssel in eine Mikropipettenspitze, die mit 10 Mikrolitern hitzeinaktiviertem FBS gefüllt ist, und lassen Sie das Moskito 30 Minuten lang speicheln.Entfernen Sie die Pipettenspitze mit dem Speichel in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 Mikrolitern MCM und geben Sie den Kadaver in ein separates 2-Millimeter-Röhrchen mit der sterilisierten Stahlkugel und 500 Mikrolitern MCM. Transportieren Sie die Röhrchen in ein Kugelmühlen-Gewebehomogenisierungsgerät innerhalb eines Biosicherheitswerks, und zerkleinern Sie alle Körper- und Beinproben bei 26 Hertz für fünf Minuten, um virale Partikel in den Überstand übergehen zu lassen. Klären Sie alle Proben durch Zentrifugation bei 200 × g für fünf Minuten, um zelluläre Trümmer im Pellet abzutrennen.Entfernen Sie unmittelbar vor der Inokulation mit den Proben das Medium von den zuvor vorbereiteten Vero-Zellen. Pipettieren Sie vorsichtig 100 Mikroliter klare Überstände aus den Körpern oder Beinen in jede Vertiefung, wobei darauf geachtet werden muss, dass das Mückenzelltrümmermaterial aus dem Pellet nicht aufgewirbelt wird. Anschließend inkubieren Sie die Platten eine Stunde lang.Nach der Inkubation ein Milliliter Methylcellulose-Überzug zu jeder Vertiefung geben und die Platten für drei bis sieben Tage erneut in den Inkubator stellen. Die Überzugplatten aus dem Inkubator nehmen und in einen Biosicherheitswerkbank bringen. Den Methylcellulose-Überzug in eine Auffangschale mit 10 % Bleiche entsorgen und jede Vertiefung zweimal mit PBS waschen, wobei jede Waschflüssigkeit in die Auffangschale gegeben wird.Entfernen Sie das PBS und geben Sie je Vertiefung ein Milliliter Methanol-Aceton hinzu. Lassen Sie die Zellen 30 Minuten lang auf der Platte fixieren. Danach entsorgen Sie das Fixierungsmittel und lassen die Platten trocknen. Waschen Sie jede Vertiefung dreimal mit nicht steriler PBS auf einem orbitalen Plattenrührer, wobei jeder Waschschritt 15 Minuten dauert. Fügen Sie anschließend je Vertiefung ein Milliliter Blockierungslösung hinzu und schwenken Sie die Platte weitere 15 Minuten lang. Fügen Sie 100 Mikroliter Anti-Zika-Virus- oder Anti-Flavivirus-Primärantikörper zu jedem Well hinzu und inkubieren Sie die Platte über Nacht unter Schütteln. Am nächsten Tag entfernen Sie den Primärantikörper und wiederholen Sie die Waschungen mit PBS. Nach der letzten Waschung geben Sie 100 Mikroliter Sekundärantikörper hinzu und inkubieren die Platte eine Stunde lang unter Schütteln.Wiederholen Sie die Waschschritte mit PBS, dann geben Sie 100 Mikroliter Substratentwicklungsreagenz pro Mulde hinzu und schwenken Sie die Platte 15 Minuten lang. Sobald sich die Foki oder Plaques entwickelt haben, beenden Sie die Reaktion, indem Sie die Platte mit Leitungswasser spülen. Gießen Sie das Leitungswasser ab und lassen Sie die Platten an der Luft trocknen. Anschließend quantifizieren Sie die viralen Foki, um die Anzahl an fokusbildenden Einheiten in der gegebenen Probe zu bestimmen.Drei Mückenpopulationen wurden über einen Bereich von Blutmahl-Titern hinweg einem Ausbruchsstamm des Zika-Virus ausgesetzt. In den folgenden zwei Wochen wurden Teilmengen der Mücken untersucht, um Infektions-, Disseminations- und potenzielle Übertragungsraten zu bestimmen. Bei niedrigeren Blutmahl-Titern waren die Mücken aus Salvador, Brasilien, nach 4, 10 und 14 Tagen extrinsischer Inkubation infiziert, wobei keine Hinweise auf eine disseminierte Infektion in den analysierten Beinen festgestellt wurden.Bei der höchsten Titerkonzentration wurde das Virus in den Beinen der Mücken nachgewiesen, jedoch nicht im Speichel. Die Mücken aus der Dominikanischen Republik erwiesen sich als am anfälligsten für eine Infektion und besaßen bei allen getesteten Viruskonzentrationen der Blutmahlzeit die höchste Übertragungskompetenz. Mücken, die alle drei Dosen verabreicht bekamen, zeigten eine Virusverbreitung innerhalb von sieben Tagen sowie Übertragungskompetenz am 14. Tag nach der Infektion.Mücken aus dem Rio Grande Valley in Texas, die niedrigeren Titern in der Blutmahlzeit ausgesetzt waren, wurden bereits vier Tage post infection infiziert, während disseminierte Infektionen nach 14 Tagen nachgewiesen wurden. In der Kohorte, die dem höchsten Titer ausgesetzt war, wurde die Infektion ab dem zweiten Tag post infection beobachtet und erreichte Spitzenwerte am 4., 10. und 14. Tag. Disseminierte Infektionen wurden am siebten Tag festgestellt, und lediglich eine einzige Mücke war am 10. Tag übertragungsfähig.Bei der Durchführung dieses Protokolls ist es wichtig, sicher und nicht schnell zu arbeiten. Infizierte oder potenziell infizierte Mücken sollten daher stets innerhalb eines Handschuhkastens oder eines Biosicherheitswerkbanks gehandhabt werden, bis ihre Beine oder Flügel entfernt wurden. Der grundlegende Workflow zur Vektorkompetenz kann angepasst werden, um infizierte Mücken für nachgeschaltete Analysen wie Übertragungsstudien zu erzeugen, sowie um die Wechselwirkungen zwischen Mücken, dem Virus und dem Mikrobiom zu untersuchen.Die Vektorfähigkeit war bereits über viele Jahrzehnte hinweg ein äußerst wichtiges Instrument, um die Rolle von Mücken bei der Übertragung von Viren während Epidemien viraler Erkrankungen zu verstehen. Gleichzeitig ist es aber auch eine Methode, die sich im Laufe der Jahre weiterentwickelt hat, um neue Erkenntnisse über die Wechselwirkungen zwischen diesen Viren und den Mückenvektoren einzubeziehen, sobald sie verfügbar wurden. Nur zwei Beispiele hierfür: Die genetische Zusammensetzung der Viruspopulation sowie die Komplexität der Population innerhalb der Mücke erweisen sich als entscheidend für deren Übertragungsfähigkeit. Mithilfe neuer Sequenziermethoden für die Viruspopulation können wir diese Faktoren heute in Untersuchungen zur Vektorfähigkeit einbeziehen.Wir wissen heute auch, dass die Population von Bakterien und anderen Organismen, die im Magen-Darm-Trakt der Mücke leben, einen erheblichen Einfluss auf deren Fähigkeit zur Übertragung haben kann, und wir können diese Population nun mit neuen Sequenziermethoden bewerten. Die Vektorkompetenz ist daher ein Verfahren, das sich weiterentwickelt hat und sich weiterentwickelt, während wir mehr über diese komplexen Wechselwirkungen erfahren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Protokoll beschreibt die Wiederherstellung des infektiösen Zika-Virus aus einem zwei-Plasmid-infektiösen cDNA-Klon.

Rettung und Charakterisierung des rekombinanten Virus aus einer neuen Welt Zika Virus Infectious Clone

Aedes Aegypti Moskitos mit Wolbachia infiziert werden in natürlichen Populationen zu unterdrücken, die Übertragung von Arboviren freigesetzt. Wir beschreiben Methoden nach hinten Ae. Aegypti mit Wolbachia Infektionen im Labor für Experimente und Feld Freigabe, Vorsichtsmaßnahmen zum Labor Anpassung und Auswahl zu minimieren.

Pflege, Aedes Aegypti Moskitos mit Wolbachia infizierte

Aktuellen Multiplex Diagnostik Zika, Chikungunya und Dengue-Viren erfordern komplexe Probenvorbereitung und teure Instrumentierung, und sind in geringen Ressourcen Umgebungen geeignet zu erkennen. Wir zeigen eine Diagnose, mit denen Isotherme Verstärkung mit zielgruppenspezifischer Strang verschieblich Sonden zu erkennen und diese Viren mit hoher Sensitivität und Spezifität zu unterscheiden.

Gemultiplexten isothermen Verstärkung basiert Diagnoseplattform zu erkennen, Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber 1

Für die effiziente Steuerung der Moskito Virusübertragung zu tragen ist die Kenntnis der Vektor Potential der jeweiligen Mücken von besonderem Interesse. Wir beschreiben erzwungene Speichelfluss als Methode zur vektorkompetenz von Aedes Albopictus und drei verschiedenen Culex Taxa für die Übertragung der Zika-Virus zu analysieren.

Gezwungen Speichelfluss als Methode zur Vektorkompetenz von Stechmücken Analyse

Wir beschreiben eine Methode zur Bewertung der Wirkung der vorbestehenden Immunität gegen Dengue-Virus auf der Zika-Virus-Infektion mit humanem Serum, primären humanen Zellen und Infektion Quantifizierung durch quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion.

Quantifizierung der Antikörper-abhängige Verstärkung der Zika-Virus in primären humanen Zellen

Dieses Protokoll beschreibt Mikroinjektionsverfahren für Culex quinquefasciatus-Embryonen, die für die Arbeit mit CRISPR/Cas9-Genbearbeitungswerkzeugen optimiert sind. Diese Technik kann effizient ortsspezifische, vererbbare Keimbahnmutationen erzeugen, die für den Aufbau genetischer Technologien in diesem wenig untersuchten Krankheitsvektor verwendet werden können.

Embryo-Mikroinjektionstechniken für eine effiziente ortsspezifische Mutagenese bei Culex quinquefasciatus

Ein Protokoll zur Kultur des mikrosporiden Parasiten Edhazardia aedis. Der Parasit wird von einer Generation von Aedes aegypti-Mücken zur nächsten durch horizontale Übertragung im Larvenstadium geleitet, gefolgt von vertikaler Übertragung im Erwachsenenstadium. Lebende Sporoplasmen überleben langfristig in infizierten Eiern.

Ausbreitung des mikrosporiden Parasiten Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Diese Methodik, die orale Ernährung und intrathorakale Injektionsinfektionen umfasste, konnte den Einfluss von Mitteldarm- und/oder Speicheldrüsenbarrieren auf die Arbovirusinfektion effektiv bewerten.

Experimentelle Virusinfektion bei adulten Stechmücken durch orale Fütterung und Mikroinjektion

Es werden Verfahren zur Untersuchung des Sondierungs- und Verschluckungsverhaltens von Culex tarsalis-Mücken an menschlichen Händen mittels AC-DC-Elektropenetrographie beschrieben.

AC-DC Elektropenetrographie zur Untersuchung des Sondierungs- und Verschluckungsverhaltens von Culex tarsalis Mücken an menschlichen Händen

Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die klonale-Zelllinie Auswahl und einem Calcium-Biolumineszenz-Assay, um die Struktur-Aktivitäts-Beziehungen von synthetisierten Arthropoden Neuropeptide auf ihren verwandten GPCRs zu analysieren. Dieser Test kann für die Rezeptor deorphanization und Struktur-Wirkungs-Beziehungen für synthetische Analog-Design-und Peptid-/ Drogen-Lead Discovery verwendet werden.

Ein Calcium Biolumineszenzassay für die funktionelle Analyse von Mosquito ( Aedes aegypti) Und Tick ( Rhipicephalus microplus) G-Protein gekoppelten Rezeptoren

Erfahren Sie die Methodik zur Analyse der Vektorkompetenz von Aedes aegypti für Zika-Virus-Übertragung. Dieses Protokoll ermöglicht präzise Risikobewertungen für gezielte Bekämpfungsstrategien.

Vektorkompetenzanalysen an Aedes aegypti Mücken mit Zika-Virus

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