Rekonstruktion von einzelligen angeborenen Fluoreszenzsignaturen durch konfokale Mikroskopie

Diese Technik bietet eine einzigartige Forschung, um die Identität oder die physiologischen Eigenschaften Ihrer Zelle auf Einzelzellebene nachzuweisen, ohne dass eine invasive Markierung erforderlich ist. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie die räumliche Auflösung auf Einzelzellebene für Ihre Analyse ermöglicht und dass sie die Unterscheidung zwischen und Hintergrundprozess ermöglicht. Diese Technik kann also potenziell zur Identifizierung und phänotypischen Analyse pathogener Mikroben beitragen.

Diese Technik kann auch zur Untersuchung der phänotypischen Heterogenität oder zur Überwachung des physiologischen Status der interessierenden mikrobiellen Population angewendet werden. Kyosuke Takabe, ein Assistenzprofessor aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Der Aufbau der konfokalen Reflexionsmikroskopie und der konfokalen Mehrkanal-Mikrospektroskopie.

Schließen Sie das konfokale Mikroskop mit degescannten Spektralkanälen an eine Photomultiplier-Röhre an. Statten Sie das Mikroskop mit einem Objektiv mit hoher numerischer Apertur und ausreichender Vergrößerung aus. Und statten Sie das Mikroskop mit einem Halbreflexionsspiegel aus, um die konfokale Reflexionsmikroskopie zu ermöglichen, die auf der zellulären Streuung des einfallenden Lichts beruht, um die Zellmorphologie sichtbar zu machen.

Für die konfokale Mehrkanal-Mikrospektroskopie statten Sie das Mikroskop mit dichroitischen Spiegeln aus und verwenden Sie ein Laserleistungsmesser, um die Beleuchtungsintensität für jede Anregungswellenlänge einzustellen. Stellen Sie dann die Ausgabe unter dem Mikroskop so ein, dass sie über die Anregungswellenlängen konstant ist. Um die Bakterien durch das Mikroskop abzubilden, stellen Sie die Lochblendengröße in der Mikroskopsoftware auf 1,0 Flächeneinheit ein und stellen Sie die Pixelverweilzeit für jede Anregungswellenlänge ein.

Stellen Sie die Scanauflösung ein. Verwenden Sie für kleine Zellen wie Bakterien einen Scanbereich von 1024 x 1024. Stellen Sie den Z-Scanning-Bereich so ein, dass der Interessenbereich abgedeckt ist.

Und mit einem Spektralfenster von acht bis 10 Nanometern stellen Sie den D-Scan-Detektor so ein, dass er den sichtbaren Wellenlängenbereich erfasst. Erfassen Sie dann Mehrkanal-Konfokal-Mikrospektroskopie-Bilder in einer Sequenz von der längsten bis zur kürzesten Anregungswellenlänge, um Z-Stacks von Fluoreszenzbildern und konfokalen Reflexionsmikroskopiebildern zu erstellen, und speichern Sie die Bilder im 16-Bit-TIFF-Format. Um eine Zellsegmentierung und die Rekonstruktion von einzelzelleigenen Fluoreszenzsignaturen durchzuführen, öffnen Sie eine entsprechende Bildanalysesoftware und doppelklicken Sie, um eines der bereitgestellten Skripte zu öffnen.

Klicken Sie auf der Registerkarte Editor auf Ausführen. Ein Fenster zur Ordnerauswahl wird angezeigt. Wählen Sie das Verzeichnis aus, in dem die Z-Stack-Bilder gespeichert wurden, und klicken Sie auf Öffnen.

Es erscheint automatisch ein Dialogfeld, in dem Sie zur Eingabe des Segmentierungsparameters aufgefordert werden. Legen Sie den Schwellenwert für die Bildbinarisierung auf 0-1, die Bildbinarisierung auf 0,45, den oberen Schwellenwert für einen Zellbereich auf 200, den unteren Schwellenwert für einen Zellbereich auf 10 und die Anzahl der Detektoren auf 32 fest. Es erscheint ein Dialogfeld, in dem Sie aufgefordert werden, die Anzahl der Anregungswellenlängen einzugeben.

Geben Sie die Anzahl der Wellenlängen ein, die für die Bildaufnahme verwendet wurden, und klicken Sie auf OK. Es erscheint ein Dialogfeld, in dem Sie nach Eingabe der Anregungswellenlängen gefragt werden. Geben Sie die Anregungswellenlängen in der Reihenfolge von der kürzesten bis zur längsten ein und klicken Sie auf OK.

Es erscheint ein neues Bildfenster mit einem konfokalen Reflexionsmikroskopiebild. Wählen Sie einen beliebigen Hintergrundbereich aus, der für die Hintergrundsubtraktion verwendet werden soll, und zeichnen Sie ein Rechteck innerhalb des konfokalen Reflexionsmikroskopiebildes. Doppelklicken Sie in den ausgewählten Bereich, um die Auswahl zu bestätigen und ein neues Verzeichnis mit dem Namen signature zu suchen.

Um Techniken zur Dimensionsreduzierung durchzuführen, erstellen Sie ein leeres Verzeichnis, und nennen Sie das Verzeichnis parent_directory. Speichern Sie die Fluoreszenzsignaturen jeder der beiden Zellpopulationen in zwei separaten Verzeichnissen und öffnen Sie die Befehlszeilenschnittstelle der Workstation. Geben Sie den Befehl ein.

Wenn "Zielverzeichnis auswählen" angezeigt wird, wählen Sie das parent_directory aus. Suchen Sie dann im Ordner parent_directory den PCA. PNG-Datei, die das resultierende Diagramm der Hauptkomponentenanalyse enthält.

Hier wird eine typische Einzelzell-Fluoreszenzsignatur einer Bakterienzelle gezeigt, die als traditionelles Spektrumdiagramm und als Heatmap dargestellt wird. In dieser Abbildung ist eine ungenaue 2D-Zellsegmentierung zu sehen, die sich über das ursprüngliche konfokale Reflexionsmikroskopiebild einer Population von Bodenbakterien legt. Die daraus resultierenden angeborenen Fluoreszenzsignaturen für die Bevölkerung werden als Heatmap dargestellt.

Es ist zu beachten, dass die Variabilität innerhalb der Population nach erfolgreicher Zellsegmentierung relativ gering war. Hier wird ein Beispiel für eine ungenaue Zellsegmentierung gezeigt, das über die gleiche Population von P.putida gelegt wurde, wie zuvor gezeigt. Welchen Einfluss die ungenaue Zellsegmentierung auf die angeborenen Fluoreszenzsignaturen der Population hat, lässt sich leicht an der beträchtlichen Anzahl von Ausreißern ablesen, die in der entsprechenden Heatmap beobachtet wurden.

Eine ungenaue Zellsegmentierung führt nach der Analyse der Hauptkomponenten zu einem lockereren Cluster im Vergleich zu dem Typcluster, der nach einer genauen Zellsegmentierung erhalten wurde. Trotz der geringen Variabilitäten der angeborenen Fluoreszenzsignatur, die innerhalb der einzelnen Bakterienstämme beobachtet werden, bildet jede Population einen eigenen Cluster auf dem Diagramm der Hauptkomponentenanalyse. In dieser Abbildung ist eine ungenaue 3D-Zellsegmentierung zu sehen, die sich über das ursprüngliche konfokale Reflexionsmikroskopiebild einer Population von knospenden Hefepilzen (Saccharomyces cerevisiae YM4271) legt.

Beachten Sie das Fehlen von Ausreißern und die daraus resultierenden angeborenen Fluoreszenzsignaturen für die Population. Es ist wichtig, ein möglichst sauberes Bild durch konfokale Mikroskopie zu erhalten und eine Sättigung der Signalintensität zu vermeiden, da Rauschen die Genauigkeit der nachfolgenden Analyse beeinträchtigen kann. Sie können Machine-Learning-Modelle mit dem angeborenen Western-Signatur-Datensatz für die Verwendung in Klassifizierungs- oder Vorhersageaufgaben trainieren und so eine tag-freie Populationsanalyse und phänotypische Vorhersage bieten.