Bewertung von oxidativem Stress in biologischen Proben mit dem Thiobarbitursäure-Reaktivsubstanz-Assay

Daher wird der TBARS-Assay am besten für die allgemeine Beurteilung von oxidativem Stress in biologischen Proben im Labor verwendet, bei der die relativen TBARS-Spiegel direkt zwischen Proben verglichen werden, die zusammen gelagert und verarbeitet wurden. Diese Assays haben extrem niedrige Kosten von etwa 3 für die Prüfung von 96 Proben im Vergleich zu kommerziell erhältlichen Kits, die etwa 400 kosten, und erlauben nur die Analyse einer einzigen Charge. Die hier beschriebene Methode kann weiter für spezifische Anwendungen angepasst werden, einschließlich Stabilitätsstudien von Bioproben und solchen, für die die Zugabe von Antioxidantien oder anderen Arten von Probenkonservierungsmitteln vor der Analyse angemessen oder vorgeschrieben ist.

Um stark schwankende Ergebnisse zu vermeiden, bereiten Sie frische Reagenzien vor, stellen Sie sicher, dass der pH-Wert für die Farbreagenzien nicht mehr als vier beträgt, und entfernen Sie alle Blasen in der Nidese-Quellplatte, bevor Sie die Absorption messen. Beginnen Sie mit der Zubereitung einer 0,8%igen wässrigen Lösung von Thiobarbitursäure. Bereiten Sie eine fünfmolare Natronlauge vor, indem Sie vier Gramm Natronlauge in 20 Millilitern Wasser auflösen.

Bewahren Sie die Lösung in einem Plastikbehälter auf. Er sollte für jede Charge frisch zubereitet werden. Geben Sie vier Gramm Thiobarbitursäure in 450 Milliliter entionisiertes Wasser und lösen Sie es mit einem magnetischen Rührstab vorsichtig auf.

Geben Sie langsam etwa vier Milliliter der Natronlauge in Schritten von 100 Mikrolitern hinzu und überprüfen Sie den pH-Wert, während sich die Thiobarbitursäurepartikel auflösen. Fügen Sie das Natriumhydroxid so lange hinzu, bis sich alle Partikel aufgelöst haben. Vergewissern Sie sich, dass der pH-Wert der Lösung mit einem pH-Streifen nicht höher als vier ist, bringen Sie dann das endgültige Volumen mit entionisiertem Wasser auf 500 Milliliter und lagern Sie die wässrige Thiobarbitursäurelösung bei Raumtemperatur.

Bereiten Sie MDA-bis-Dimethylacetal-Standardkurvenlösungen in zwei Milliliter-Polypropylen-Röhrchen mit Schnappverschluss vor. Durch Verdünnung der 200 μmolaren Stammlösung in Wasser, wie im Textmanuskript beschrieben. Wirbeln Sie die Proben.

Beschriften Sie die Glasröhrchen für die zu analysierenden Proben und geben Sie dann 100 Mikroliter der vorbereiteten Probe in jedes Röhrchen. Geben Sie 200 Mikroliter 8,1 % SDS zu jeder Probe und schwenken Sie das Glasröhrchen vorsichtig in kreisenden Bewegungen, um es zu mischen. Geben Sie 1,5 Milliliter 3,5 molaren Natriumacetatpuffer zu jeder Probe und fügen Sie dann 1,5 Milliliter der wässrigen 0,8%igen Thiobadarbitursäurelösung hinzu.

Bringen Sie das Finale in jedem Röhrchen auf vier Milliliter, indem Sie 700 Mikroliter entionisiertes Wasser hinzufügen. Verschließen Sie die Glasröhren fest und inkubieren Sie sie eine Stunde lang in einem Heizblock mit einer Temperatur von 95 Grad Celsius. Decken Sie die Röhrchen mit Alufolie ab, um Kondensation zu vermeiden, nehmen Sie dann die Röhrchen aus dem Block und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang auf Eis.

Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Proben und Standards bei 1.500 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie 150 Mikroliter Überstand aus jedem Röhrchen in eine Vertiefung in einer 96-Well-Platte, wobei Sie mit der Pipettenspitze alle Luftblasen entfernen. Messen Sie die Absorption der Proben bei 532 Nanometern und subtrahieren Sie dann den durchschnittlichen Absorptionsmittelwert der Blindproben von allen anderen Absorptionsmittelwerten.

Erstellen Sie eine Standardkurve und verwenden Sie sie, um unbekannte Probenkonzentrationen zu berechnen. MDA-Bis-Dimethylacetol-Standardkurven wurden erstellt, um die Nachweisgrenzen und die Sensitivität des Assays sowie die Oxidationsgrade in drei verschiedenen biologischen Proben zu bestimmen. Insgesamt wurden an den drei Proben an verschiedenen Tagen 9 TBARS-Assays durchgeführt.

Um die Nachweisgrenzen zu bestimmen, wurde die Extinktion von Blindproben an drei verschiedenen Tagen gemessen. Die Mindestkonzentration der TBARS-Substanz, die erforderlich ist, um ein nachweisbares, nicht schallabsorbierendes Signal zu erzeugen, beträgt 1,1 Mikromolar. Und die Sensitivität des Assays beträgt etwa 0,0016 Absorptionsmitteleinheiten pro mikromolarer Konzentrationszunahme.

Der TBARS-Assay kann verwendet werden, um Veränderungen in der Lipidperoxidation verschiedener biologischer Matrices zu detektieren. Um dies zu demonstrieren, wurde Kupfer-Zwei-Chlorid verwendet, um die In-vitro-Oxidation von humanem Serum, HEPG2-Zelllysaten und Lipoproteinen niedriger Dichte zu induzieren. Ein TBARS-Assay wurde an LDL-Proben durchgeführt, die EDTA enthielten, und die TBARS-Spiegel änderten sich nicht zwischen den beiden behandelten und den unbehandelten LDL-Proben.

Nachdem EDTA jedoch durch Spinfiltration entfernt wurde, erfuhr LDL eine Kupfer-Zwei-vermittelte Oxidation. Um den dynamischen Bereich des TBARS-Assays im menschlichen Serum zu veranschaulichen, wurde den Proben eine Konzentration von zwei Millimolaren Kupfer und zwei Ionen zugesetzt, was zu einer sechs- bis siebenfachen Erhöhung der TBARS führte. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, lassen Sie die Proben nicht länger als 10 Minuten auf Eis und lassen Sie sie nach der Zentrifugation bei Raumtemperatur.

Für Chargen oder Teilmengen von Bioproben, die ursprünglich nicht zusammen gesammelt, verarbeitet und gelagert wurden, sollte man die Daten statistisch auf Chargeneffekte auswerten, um sicherzustellen, dass keine künstliche Oxidation zu den Ergebnissen beigetragen hat. Die absichtlich quantifizierbare In-vitro-Oxidation von Lipoproteinen niedriger Dichte ermöglicht es zu verstehen, wie sich die Oxidation auf die funktionierende Biologie auswirkt.