Flypub zur Untersuchung von Ethanol induzierte Verhaltenshemmung und Sensibilisierung
18. Mai 2020
Der Flypub-Assay misst das Verhalten, das die Fruchtfliege Drosophila melanogaster unter dem Einfluss von Ethanol zeigt. Der Assay kann leicht von Experimentatoren auf allen Ebenen gemeistert und auf verschiedene verdampfte Reize angewendet werden, was Substanzmissbrauch und Suchtstudien erleichtert.
Der Flypub-Assay misst hemmungsloses Verhalten unter Alkoholeinfluss. Dadurch wird die mechanistische Untersuchung der Alkoholkonsumstörung erleichtert. Alkohol ist eine der am leichtesten erhältlichen und am häufigsten missbrauchten Drogen der Welt.
Der neurobiologische Mechanismus, der einer Alkoholnutzungsstörung zugrunde liegt, ist jedoch unvollständig verstanden. Die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, wurde ausgiebig verwendet, um die Auswirkungen von Ethanol auf Euphorie, Fortbewegung, Hemmung und Sedierung zu untersuchen. Es wird auch verwendet, um seine langen und dauerhaften Veränderungen im Verhalten relevant für Sucht wie Toleranz zu studieren, Sensibilisierung, und Ethanol-Suche.
Viele Studien in Drosophila und anderen Tiermodellen konzentrieren sich auf die motorisamotorische Aktivierungswirkung von Ethanol. Die deutliche Wirkung von Ethanol ist die Verhaltenshemmung. Allerdings ist seine Studie eher unterrepräsentiert.
Um dieses Schlüsselproblem anzugehen, haben wir den Flypub-Assay entwickelt, um hemmungsloses Verhalten unter dem Einfluss von Ethanol zu messen. Um die Flypub-Kammer zu montieren, nehmen Sie eine runde Flasche und schneiden Sie den unteren Teil einer 25-Milliliter-Marke mit einer Rasierklinge ab. Erstellen Sie ein Loch an der 50-Milliliter-Marke mit einem heißen Lötkolben.
Dies ist der Zugangspunkt, an dem Fliegen eingeführt werden. Legen Sie ein rundes Netz mit einem Durchmesser von 54 Millimetern auf die 75-Milliliter-Marke und sichern Sie es mit Heißkleber. Positionieren Sie eine klare Kunststofffolie mit einem Durchmesser von 70 Millimetern am offenen Ende und sichern Sie sie mit Heißkleber.
Um sicherzustellen, dass die Kunststoffrunde fest am Boden befestigt ist, Drücken Sie mit Gewichten nach unten. Sammeln Sie männliche Fliegen in einer Gruppe von 33. Legen Sie sie auf die Seite einer Lebensmittel-Durchstechflasche.
Platzieren Sie sie in einem 25 Grad Celsius Inkubator mit mindestens 50% relativer Luftfeuchtigkeit und einem 12-Stündigen Licht, 12 Stunden dunklem Zyklus für 2 Tage vor der Ethanol-Exposition. Bereiten Sie die Flypub-Assay-Station vor, indem Sie Lichter, einen Computer und eine Kamera für Videoaufnahmen einschalten. Bereiten Sie sechs Kneipen für eine Reihe von Experimenten vor.
Beschriften Sie sie mit den Nummern eins bis sechs. Bringen Sie die Fliegen vorsichtig mit einem kleinen Trichter in die Kneipe. Schließen Sie die Kneipe mit einem Band.
Akklimatisieren Sie die Fliegen für 10 Minuten. Passen Sie während der Akklimatisierung den Kamerafokus an und zeichnen Sie die letzten fünf Minuten der Akklimatisierung auf. Während der Akklimatisierung bereiten Baumwollpads für die Ethanol-Lieferung.
Schneiden Sie ein Wattepad in vier gleiche Quadranten und trimmen Sie dann die Ecken, damit es in eine Petrischale passt. Fügen Sie ein Wattepad zu einer Petrischale hinzu. Fügen Sie dem Wattestäbchen einen Milliliter 95% Ethanol hinzu.
Achten Sie darauf, dass die Ethanollösung gleichmäßig auf den gesamten Bereich des Pads verteilt wird. Bedecken Sie die Petrischale schnell mit Labortüchern. Legen Sie vorsichtig eine Ethanol-haltige Petrischale unter jede Kneipe.
Richten Sie die Kneipen auf der Bühne aus. Beginnen Sie mit der Aufnahme und starten Sie gleichzeitig einen Timer. Zeichnen Sie auf, bis fliegen aufhören zu hofieren oder sich zu bewegen.
Entfernen Sie das Ethanol enthaltende Petrischale, wenn über 90% der Fliegen sediert sind. Übertragen Sie die sedierten Fliegen vorsichtig zurück in Lebensmittelfläschchen. Legen Sie sie wieder in den Inkubator.
Wiederholen Sie die vorherigen Schritte alle 24 Stunden an sechs aufeinanderfolgenden Tagen. Öffnen Sie das Video mit einem Mediaplayer. Dann punkten Sie die Anzahl der Männer in Balz Aktivitäten alle 10 Sekunden beschäftigt.
Zu den zu punktenden Maßnahmen gehören: einseitige Flügelverlängerung, Balzkette, Balzkreis, Bauchbeugung und Montage. Gezeigt werden repräsentative Aufzeichnungen des Flugverhaltens. Während der Akklimatisierung, wo Männchen zeigen nicht viel Aktivität.
Bei der ersten Exposition, bei der Männchen sporadische Balz aufweisen. Und während der sechsten Exposition, wo Männchen zeigen Aktivität Balz. Geben Sie die Anzahl der Männer, die Balz anzeigen, in einem zehnsekunden-Zeitblock ein.
Verwenden Sie die maximale Anzahl von courting Männchen in drei aufeinander folgenden 10 Sekunden Zeitblöcke als repräsentativen Datenpunkt. Der Durchschnitt von 10 aufeinanderfolgenden Datenpunkten mit dem höchsten Wert stellt den prozentualen Anteil der zwischenmenschlichen Höflichkeit pro Kneipe dar. Der wilde Typ Canton-S zeigt nach und nach verstärkte Aktivitäten der hemmungslosen Balz bei wiederholter Ethanol-Exposition.
Dies stellt eine Verhaltenssensibilisierung für die Hemmungswirkung von Ethanol dar. Wir untersuchten die Rolle von Octopamin bei der Sensibilisierung, indem wir die Fliegen testeten, denen Tyramin-Beta-Hydroxylase, T beta H, fehlen, also einen Mangel an Oktopamin. Wie Canton-S zeigten die T beta H-Mutationen eskalierte Reaktionen auf wiederholte Ethanol-Exposition, jedoch auf einem reduzierten Niveau.
Wenn wir T beta H und Canton-S verglichen, stellten wir fest, dass die T beta H mutierten Männchen weniger hemmungslose Balz zeigten als Canton-S-Männchen in jeder Exposition, was darauf hindeutet, dass Octopamin für die Sensibilisierung wichtig sein kann. Jetzt können Sie Verhaltensweisen, die durch Ethanol induziert werden, mit dem Flypub-Assay einrichten, dirigieren und analysieren. Zu den wichtigsten Punkten, die sie beachten sollten, gehören eine ordnungsgemäße Montage der Kneipe.
Zwei, konsistente Ethanol-Lieferung und drei, präzise und unvoreingenommene Verhaltens-Score. Der Flypub Assay hat viele Vorteile. Es ist einfach, kostengünstig einzurichten und leicht zu erlernen.
Auch können mehrere Gruppen von Fliegen gleichzeitig untersucht werden, was diese Studie erleichtert, um die Auswirkungen genetischer oder experimenteller Manipulationen zu identifizieren. Der Flypub-Assay ist für Experimentatoren auf allen Ebenen hoch anziehend, einschließlich Grundschülern, Studenten und Absolventen, Post-Docs und Dozenten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Flypub-Assay es Ihnen ermöglicht, molekulare Akteure, zelluläre Bahnen, Gehirnkreise und Risikofaktoren zu identifizieren, die zur Alkoholkonsumstörung beitragen.
Übersicht
Der Flypub-Assay misst desinhibiertes Verhalten der Fruchtfliege Drosophila melanogaster unter dem Einfluss von Ethanol. Dieser Assay wurde entwickelt, um die Untersuchung alkoholbezogener Störungen zu erleichtern, und kann von Forschenden aller Erfahrungsstufen leicht erlernt werden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Verhaltensbiologie
- Forschung zur Alkoholgebrauchsstörung
Hintergrund
- Alkohol wird weithin missbraucht, doch seine neurobiologischen Wirkmechanismen sind noch nicht vollständig verstanden.
- Drosophila melanogaster dient als Modellorganismus zur Untersuchung der Wirkungen von Ethanol.
- Der Flypub-Assay befasst sich gezielt mit der bisher wenig erforschten Verhaltensenthemmung, die durch Ethanol verursacht wird.
- Bisherige Studien konzentrierten sich vorwiegend auf die Auswirkungen von Ethanol auf die Motorik statt auf die Enthemmung.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Messung von desinhibiertem Verhalten als Reaktion auf Ethanol.
- Untersuchung der Rolle von Octopamin bei der Verhaltenssensibilisierung im Zusammenhang mit Alkoholexposition.
- Bereitstellung eines einfachen und effektiven Assays für Forscher, um Suchtmechanismen zu untersuchen.
Verwendete Methoden
- Montage der Flypub-Kammer unter Verwendung einer modifizierten Flasche.
- Vorbereitung männlicher Drosophila für die Ethanolexposition.
- Videodokumentation des Flugverhaltens während Balzaktivitäten.
- Auswertung der Balzverhaltensweisen zur Beurteilung von Desinhibierungseffekten.
Hauptergebnisse
- Wildtyp-Canton-S-Fliegen zeigten eine zunehmende desinhibierte Paarungsbereitschaft bei wiederholter Exposition gegenüber Ethanol.
- T beta H-Mutanten wiesen eine verminderte Desinhibition im Vergleich zu Canton-S auf, was auf die Beteiligung von Octopamin hinweist.
- Mithilfe des Assays können mehrere Fliegen-Gruppen gleichzeitig getestet werden.
- Eine konsistente Applikation von Ethanol und eine präzise Bewertung sind entscheidend für zuverlässige Ergebnisse.
Schlussfolgerungen
- Der Flypub-Assay ist ein wertvolles Werkzeug, um die Wirkungen von Ethanol auf das Verhalten zu untersuchen.
- Er kann dabei helfen, molekulare und zelluläre Mechanismen zu identifizieren, die an einer Alkoholgebrauchsstörung beteiligt sind.
- Der Assay ist für Forschende auf verschiedenen Bildungsniveaus zugänglich.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Der Flypub-Assay schließt eine entscheidende Lücke in der Forschung zur Alkoholgebrauchsstörung, indem er sich auf die durch Ethanol hervorgerufene Verhaltensenthemmung konzentriert, eine zentrale adaptive Veränderung, die der Sucht zugrunde liegt. Indem der Assay die Messung einer verstärkten enthemmten Balz bei Drosophila melanogaster ermöglicht, unterstützt er die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominderung in der frühen Entdeckungsphase. Seine Einfachheit, Skalierbarkeit und Kompatibilität mit genetischen Werkzeugen erhöhen das Vorhersagevertrauen bei der Untersuchung von Wegen und Schaltkreisen in Suchtmechanismen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem eine verstärkte desinhibierte Verhaltensweise als Proxy für die Sensibilisierung gegenüber Ethanol gemessen wird.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung genetischer Zielstrukturen, wie beispielsweise Komponenten des Octopamin-Stoffwechselwegs, anhand reduzierter Desinhibierungsphänotypen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Selektion von Projektportfolios, indem die Verhaltenssensibilisierung über verschiedene Genotypen hinweg quantifiziert und somit die Priorisierung von Zielstrukturen erleichtert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Screening-Verfahren vor, indem Basis- und sensibilisierte Desinhibierungsreaktionen etabliert werden.
- Operativer Wert: Standardisiert die Ethanolapplikation und die Verhaltensbewertung und gewährleistet dadurch die Reproduzierbarkeit über verschiedene Experimentreihen und Labore hinweg.
- Skalierbarkeitswert: Ermöglicht das gleichzeitige Testen mehrerer Fliegengruppen und erleichtert so die parallele Beurteilung genetischer oder pharmakologischer Eingriffe.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationeller Wert: Verbindet die Desinhibitionsensibilisierung bei Fliegen mit Säugetiermodellen der Sucht und unterstützt so die zielgerichtete Validierung über Arten hinweg.
- Mechanistische Entlastung: Ermöglicht die Aufklärung der an ethanolbedingten Verhaltensänderungen beteiligten molekularen Faktoren, zellulären Signalwege und neuronalen Schaltkreise.
- Vorhersagbare Kontinuität: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem die Modulation von Zielstrukturen mit Desinhibitionsphänotypen bei wiederholter Exposition verknüpft wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Flypub-Assay fügt sich in die Entdeckungskette von der Testung von Zielhypothesen bis hin zur Identifizierung von Leitstrukturen ein, insbesondere für suchtrelevante Zielstrukturen, die die Verhaltensregulation beeinflussen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Genen und Wegen, die an der Ethanolantwort beteiligt sind, wie Tyramin-Beta-Hydroxylase und Octopamin-Signalgebung.
- Screening: Bietet Bereitschaft für Assays durch standardisierte Kammern, konsistente Ethanolherstellung und quantifizierbare Beurteilung der Balz alle 10 Sekunden.
- Analytik: Erzeugt quantitative Messungen der abhängigen Variablen – Anteil der männlichen Balz pro Pub – und ermöglicht Vergleiche zwischen verschiedenen Bedingungen und Genotypen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Sensibilisierung der Hemmungsaufhebung mit präklinischer Relevanz, indem sie verstärkte Reaktionen modelliert, die suchtablen Verhaltensweisen ähneln.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Plattform zur Bewertung genetischer, pharmakologischer oder umweltbedingter Modulatoren der Ethanolantwort über verschiedene Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem die mechanistische Uneindeutigkeit bezüglich der Desinhibitions-Sensibilisierung verringert wird.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Aufbauten der Versuchskammern, standardisierte Ethanolapplikation und verblindete Verhaltensbewertung.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem quantitative, auf Eskalation basierende Phänotypen bereitgestellt werden, die neuroadaptive Vorgänge widerspiegeln, die für die Sucht relevant sind.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Targets basierend auf deren Einfluss auf die Verläufe der Verhaltenssensibilisierung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Drosophila, in der Verhaltensbeobachtung und in der videobasierten Auswertung.
- Benötigt Instrumentierung zur Ethanoldosierung, zur Videoaufzeichnung sowie zur Umweltkontrolle (25 °C, 50 % Luftfeuchtigkeit, 12-Stunden-Licht-/Dunkelzyklus).
- Setzt eine standardisierte Definition der Balzkriterien und Auswertungsintervalle über mehrere Arbeitsgruppen hinweg voraus, um die Vergleichbarkeit der Daten sicherzustellen.
- Erfordert Anpassungen, wenn der Test zur Messung weiterer ethanolinduzierter Verhaltensweisen über die Hemmung der Balz hinaus erweitert wird.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen wie Auswerterbias und Variabilität in der Fliegenmotivation, die durch die Nutzung des maximalen Balzverhaltens über aufeinanderfolgende Zeitblöcke hinweg reduziert werden können.
