Hochauflösende Kartierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in Mausstammzell-abgeleiteten Neuronen mit Chromatin-Immunpräzipitation-Exonuklease (ChIP-Exo)
August 14th, 2020
Eine präzise Bestimmung von Proteinbindungsstellen im genomischen Ist wichtig für das Verständnis der Genregulation. Hier beschreiben wir eine genomische Kartierungsmethode, die chromatinimmunpräzipierte DNA mit Exonukleaseverdauung (ChIP-exo) behandelt, gefolgt von hochdurchsatzhoher Sequenzierung. Diese Methode erkennt Protein-DNA-Wechselwirkungen mit nahezu Base-Pair-Mapping-Auflösung und einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis in Säugetierneuronen.
Der Hauptvorteil unserer ChIP-exo-Methode ist die verbesserte Mapping-Auflösung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in der Zelle im Vergleich zur herkömmlichen Chromatin-Immunpräzipitationsmethode. Um Protein-G-Magnetkügelchen für ChIP herzustellen, mischen Sie die Magnetkügelchen, bis sie homogen sind. Geben Sie dann 25 Mikroliter der magnetischen Kügelchen in ein zwei Milliliter Protein-Röhrchen mit geringer Bindung.
Füge einen Milliliter Blocklösung zu den Kügelchen hinzu. Durch Pipettieren gut mischen und dann das Röhrchen eine Minute lang auf ein Magnetgestell stellen. Sobald der Überstand klar ist, entfernen Sie ihn.
Geben Sie als Nächstes einen Milliliter Blocklösung zu den Kügelchen. Stellen Sie das Rohr auf eine vier Grad Celsius heiße Plattform und schaukeln Sie 10 Minuten lang, dann drehen Sie das Rohr kurz. Stellen Sie das Rohr auf das Magnetgestell und entfernen Sie den Überstand.
Geben Sie 500 Mikroliter Blocklösung zu den magnetischen Kügelchen. Drehen Sie den Antikörper kurz gegen Islet-1 und geben Sie dann vier Mikrogramm des Antikörpers in das Röhrchen mit den magnetischen Kügelchen. Legen Sie das Röhrchen mit den magnetischen Kügelchen und dem Islet-1-Antikörper bei vier Grad Celsius auf eine Schaukelplattform und schaukeln Sie sechs bis 24 Stunden lang.
Um mit der Chromatin-Immunpräzipitation zu beginnen, waschen Sie die mit Antikörpern beschichteten Kügelchen in einem Milliliter Blockierungslösung. Legen Sie das Röhrchen mit den mit Antikörpern beschichteten Kügelchen für fünf Minuten bei vier Grad Celsius auf eine Schaukelplattform. Nach kurzem Schleudern das Röhrchen auf ein Magnetgestell legen und den Überstand entfernen.
Resuspendieren Sie die mit Antikörpern beschichteten Kügelchen in 50 Mikrolitern Blockierungslösung. Geben Sie einen Milliliter beschallter Lysate zu den mit Antikörpern beschichteten Kügelchen und inkubieren Sie die Probe dann über Nacht auf einer schaukelnden Plattform bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie die Probe über Nacht inkubiert haben, sammeln Sie Flüssigkeit aus der Kappe, indem Sie das Röhrchen kurz drehen, und stellen Sie das Röhrchen dann auf ein Magnetgestell.
Und nach einer Minute entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Führen Sie als Nächstes eine Reihe von Wäschen wie folgt durch. Geben Sie der Probe einen Milliliter Kaltwaschpuffer mit CPI zu.
Mischen Sie die Probe auf einer schaukelnden Plattform bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Drehen Sie das Probenröhrchen kurz und legen Sie es dann auf ein Magnetgitter. Entfernen Sie nach einer Minute den Überstand mit einer Pipette.
Für die erste enzymatische Reaktion und Reparatur sowie das DA-Tailing geben Sie 38 Mikroliter autoklaviertes doppelt destilliertes Wasser in die Probe und fügen Sie dann die Endvorbereitungsreaktionsmischung und die Endvorbereitungsenzymmischung hinzu. Mischen Sie den Inhalt des Röhrchens durch Pipettieren und inkubieren Sie die Probe dann 30 Minuten lang bei 20 Grad Celsius. Waschen Sie anschließend die Probenkügelchen mit einem Waschpuffer mit hohem Salzgehalt, einem Lithiumchlorid-Waschpuffer und einem 10 millimolaren Tris-Chlorwasserstoffpuffer, wie zuvor beschrieben.
Um die Indexadapterligatur durchzuführen, geben Sie 27 Mikroliter kalten 10 millimolaren Tris-Chlorwasserstoffpuffer in die Probe. Fügen Sie dann den Indexadapter, den Ligationsverstärker und den Ligase-Mastermix hinzu. Inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 20 Grad Celsius.
Waschen Sie die Probenkügelchen erneut mit einem Waschpuffer mit hohem Salzgehalt, einem Lithiumchlorid-Waschpuffer und einem 10-millimolaren Tris-Chlorwasserstoffpuffer. Geben Sie dann 47 Mikroliter kalten 10 millimolaren Tris-Chlorwasserstoffpuffer in die Probe. Um die Kerbe in der DNA zu reparieren, die durch die fehlende Phosphodiesterbindung entsteht, geben Sie 11,1 Mikroliter der Füllmischung in die Probe.
Inkubieren Sie die Probe 20 Minuten lang bei 30 Grad Celsius. Nach einer Reihe von Waschgängen geben Sie 50 Mikroliter kaltes, autoklaviertes, doppelt destilliertes Wasser in die Probe. Um die ChIP-DNA in der Richtung von fünf bis drei Primzahlen zu verdauen, fügen Sie Lambda-Exonuklease-Puffer und Lambda-Exonuklease hinzu und mischen Sie die Probe durch Pipettieren.
Inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nachdem die Verdauung abgeschlossen ist, wiederholen Sie die drei Wäschen ein letztes Mal. Um die ChIP-Probe aus den Kügelchen zu eluieren, resuspendieren Sie die Probe in 75 Mikrolitern ChIP-Elutionspuffer und Inkubator bei 65 Grad Celsius für 15 Minuten bei 130 mal G.Geben Sie 2,5 Mikroliter 20 Milligramm Proteinase K pro Milliliter in die Probe.
Die Probe kurz vortexen, dann über Nacht bei 65 Grad Celsius inkubieren. Die Probe kurz drehen und auf ein Magnetgestell legen. Nach einer Minute den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen umfüllen.
Reinigen und eluieren Sie die DNA. Nach der Aufreinigung der eluierten DNA werden 16 Mikroliter der extrahierten DNA-Probe in ein PCR-Röhrchen überführt. Geben Sie 1,2 Mikroliter Denaturierungs- und Grundglühmischung in die Probe.
Unter Verwendung des in Tabelle sechs des Manuskripts beschriebenen Programms werden Denaturierungs- und Anneal-Primer an die Template-DNA angepasst. Geben Sie drei Mikroliter Primerverlängerungsmischung in die Probe und führen Sie das in Tabelle 7 des Manuskripts beschriebene PCR-Programm durch. Geben Sie 4,1 Mikroliter DA-Tailing-Mix in die Probe und führen Sie die Probe mit dem PCR-Programm in Tabelle acht des Manuskripts durch.
Geben Sie dann 21,5 Mikroliter Universaladapter-Ligationsmischung in die Probe und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 20 Grad Celsius. Geben Sie 29 Mikroliter LM-PCR-Mix in die Probe und führen Sie die Probe dann mit dem Programm aus Tabelle 10 des Manuskripts durch. Nach 18 Zyklen der LM-PCR wurden ChIP-exo-Proben von Motoneuronen der Maus auf einem 1,5%igen Agarosegel elektrophoresiert.
Die Ergebnisse für ChIP-exo Islet-1 zeigten amplifizierte DNA-Bibliotheken von etwa 200 bis 400 Basenpaaren, was darauf hindeutet, dass die ChIP-exo-Bibliotheken erfolgreich durch LM-PCR amplifiziert wurden. Die Bande um 100 Basenpaare stellt Artefakte von Adaptern und PCR-Primern dar. Die Nicht-Antikörper-Kontrolle zeigt, dass unspezifische Hintergrund-DNA durch die Lambda-Exonuklease-Behandlung verdaut wurde.
Mit Hilfe von ChIP-exo und ChIP-seq wurden Insel-1-gebundene Positionen identifiziert. Das ChIP-exo-Signal war stark auf Insel-1-Bindungsstellen fokussiert und detektierte mehrere geclusterte Bindungsmuster von Insel-1-Transkriptionsfaktoren. Das ChIP-seq-Signal zeigte breitere Signale, die darauf hindeuteten, dass ChIP-exo eine höhere Kartierungsauflösung als ChIP-seq für Islet-1 aufwies.
Oft binden mehrere Transkriptionsfaktoren die DNA als Protein-DNA-Komplex nebeneinander. ChIP-exo ermöglicht es uns zu untersuchen, wie mehrere Transkriptionsfaktoren die Ziel-DNA erkennen und regulieren.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Überblick
Diese Studie präsentiert eine genomische Mapping-Methode, die die Auflösung von Protein-DNA-Interaktionen in Säugetierneuronen verbessert. Durch die Verwendung von chromatin-immunpräzipitierter DNA, die mit Exonukleaseverdauung behandelt wurde, gefolgt von Hochdurchsatz-Sequenzierung, erreicht die Methode eine nahezu Basenpaar-Mapping-Auflösung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Genomics
- Genregulation
Hintergrund
- Das Verständnis von Protein-DNA-Interaktionen ist entscheidend für die Genregulation.
- Konventionelle Methoden haben Einschränkungen in der Mapping-Auflösung.
- ChIP-exo bietet verbesserte Erkennungsfähigkeiten.
- Diese Methode ist besonders nützlich bei der Untersuchung von Säugetierneuronen.
Zweck der Studie
- Verbesserung der Auflösung des Mappings von Protein-DNA-Interaktionen.
- Bereitstellung einer zuverlässigen Methode für genomisches Mapping.
- Verbesserung des Verständnisses von Genregulationsmechanismen.
Verwendete Methoden
- Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von Exonukleaseverdauung.
- Hochdurchsatz-Sequenzierung für die Datenerfassung.
- Vorbereitung von Protein G magnetischen Perlen für ChIP.
- Mischung und Blocking-Lösungen für optimale Bindung.
Hauptergebnisse
- Erreichte nahezu Basenpaar-Auflösung beim Mapping.
- Demonstrierte hohes Signal-Rausch-Verhältnis in den Ergebnissen.
- Validierte die Methode in neuronalen Kontexten von Säugetieren.
- Bot Einblicke in Protein-DNA-Interaktionen.
Schlussfolgerungen
- Die ChIP-exo-Methode verbessert die Mapping-Auflösung signifikant.
- Diese Technik ist vorteilhaft für die Untersuchung der Genregulation.
- Zukünftige Anwendungen können unser Verständnis neuronaler Funktionen verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
High-resolution mapping of protein-DNA interactions enables precise target validation in early discovery by clarifying transcription factor binding sites with near base-pair accuracy. This reduces mechanistic ambiguity in gene regulation studies and supports predictive confidence in lead identification for neurological disease models. The method enhances de-risking of therapeutic hypotheses by distinguishing specific from non-specific genomic signals.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional regulatory mechanisms in disease-relevant neuronal systems.
- Operational Value: Provides high-sensitivity detection of protein-DNA binding with reduced background noise.
- Predictive Value: Supports functional target validation by mapping clustered transcription factor binding patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, high-resolution binding profiles for assay standardization.
- Operational Value: Produces reproducible DNA libraries suitable for downstream sequencing workflows.
- Scalability Value: Enables platform reuse across multiple transcription factors in neuronal models.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links discovery-stage binding data to disease-relevant gene regulation in stem cell-derived neurons.
- Operational Value: Ensures continuity from target identification to preclinical validation via consistent genomic readouts.
- Risk Mitigation: Supports de-risking of mechanistic models by eliminating false-positive binding signals.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by delivering precise genomic binding data that informs target selection and prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through high-resolution mapping of transcription factor occupancy.
- Screening: Enables assay readiness via standardized, exonuclease-digested DNA libraries with uniform fragment sizes.
- Analytics: Delivers quantitative binding signals that allow comparison of protein-DNA interactions across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating binding sites in disease-relevant neuronal systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable genomic mapping capability for multiple targets in neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through near base-pair mapping resolution.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via controlled exonuclease digestion and library preparation.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing false positives in binding site identification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on high-confidence genomic binding data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin immunoprecipitation and enzymatic DNA processing.
- Dependent on access to magnetic bead handling, exonuclease enzymes, and high-throughput sequencing.
- Needs cross-team standardization for antibody validation and wash stringency.
- Adaptation considerations include optimization for different transcription factors and neuronal subtypes.
- Practical limitations include input DNA quality and antibody specificity affecting signal clarity.
