Hochauflösende Kartierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in Mausstammzell-abgeleiteten Neuronen mit Chromatin-Immunpräzipitation-Exonuklease (ChIP-Exo)
14. August 2020
Eine präzise Bestimmung von Proteinbindungsstellen im genomischen Ist wichtig für das Verständnis der Genregulation. Hier beschreiben wir eine genomische Kartierungsmethode, die chromatinimmunpräzipierte DNA mit Exonukleaseverdauung (ChIP-exo) behandelt, gefolgt von hochdurchsatzhoher Sequenzierung. Diese Methode erkennt Protein-DNA-Wechselwirkungen mit nahezu Base-Pair-Mapping-Auflösung und einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis in Säugetierneuronen.
Der Hauptvorteil unserer ChIP-exo-Methode ist die verbesserte Mapping-Auflösung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in der Zelle im Vergleich zur herkömmlichen Chromatin-Immunpräzipitationsmethode. Um Protein-G-Magnetkügelchen für ChIP herzustellen, mischen Sie die Magnetkügelchen, bis sie homogen sind. Geben Sie dann 25 Mikroliter der magnetischen Kügelchen in ein zwei Milliliter Protein-Röhrchen mit geringer Bindung.
Füge einen Milliliter Blocklösung zu den Kügelchen hinzu. Durch Pipettieren gut mischen und dann das Röhrchen eine Minute lang auf ein Magnetgestell stellen. Sobald der Überstand klar ist, entfernen Sie ihn.
Geben Sie als Nächstes einen Milliliter Blocklösung zu den Kügelchen. Stellen Sie das Rohr auf eine vier Grad Celsius heiße Plattform und schaukeln Sie 10 Minuten lang, dann drehen Sie das Rohr kurz. Stellen Sie das Rohr auf das Magnetgestell und entfernen Sie den Überstand.
Geben Sie 500 Mikroliter Blocklösung zu den magnetischen Kügelchen. Drehen Sie den Antikörper kurz gegen Islet-1 und geben Sie dann vier Mikrogramm des Antikörpers in das Röhrchen mit den magnetischen Kügelchen. Legen Sie das Röhrchen mit den magnetischen Kügelchen und dem Islet-1-Antikörper bei vier Grad Celsius auf eine Schaukelplattform und schaukeln Sie sechs bis 24 Stunden lang.
Um mit der Chromatin-Immunpräzipitation zu beginnen, waschen Sie die mit Antikörpern beschichteten Kügelchen in einem Milliliter Blockierungslösung. Legen Sie das Röhrchen mit den mit Antikörpern beschichteten Kügelchen für fünf Minuten bei vier Grad Celsius auf eine Schaukelplattform. Nach kurzem Schleudern das Röhrchen auf ein Magnetgestell legen und den Überstand entfernen.
Resuspendieren Sie die mit Antikörpern beschichteten Kügelchen in 50 Mikrolitern Blockierungslösung. Geben Sie einen Milliliter beschallter Lysate zu den mit Antikörpern beschichteten Kügelchen und inkubieren Sie die Probe dann über Nacht auf einer schaukelnden Plattform bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie die Probe über Nacht inkubiert haben, sammeln Sie Flüssigkeit aus der Kappe, indem Sie das Röhrchen kurz drehen, und stellen Sie das Röhrchen dann auf ein Magnetgestell.
Und nach einer Minute entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Führen Sie als Nächstes eine Reihe von Wäschen wie folgt durch. Geben Sie der Probe einen Milliliter Kaltwaschpuffer mit CPI zu.
Mischen Sie die Probe auf einer schaukelnden Plattform bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Drehen Sie das Probenröhrchen kurz und legen Sie es dann auf ein Magnetgitter. Entfernen Sie nach einer Minute den Überstand mit einer Pipette.
Für die erste enzymatische Reaktion und Reparatur sowie das DA-Tailing geben Sie 38 Mikroliter autoklaviertes doppelt destilliertes Wasser in die Probe und fügen Sie dann die Endvorbereitungsreaktionsmischung und die Endvorbereitungsenzymmischung hinzu. Mischen Sie den Inhalt des Röhrchens durch Pipettieren und inkubieren Sie die Probe dann 30 Minuten lang bei 20 Grad Celsius. Waschen Sie anschließend die Probenkügelchen mit einem Waschpuffer mit hohem Salzgehalt, einem Lithiumchlorid-Waschpuffer und einem 10 millimolaren Tris-Chlorwasserstoffpuffer, wie zuvor beschrieben.
Um die Indexadapterligatur durchzuführen, geben Sie 27 Mikroliter kalten 10 millimolaren Tris-Chlorwasserstoffpuffer in die Probe. Fügen Sie dann den Indexadapter, den Ligationsverstärker und den Ligase-Mastermix hinzu. Inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 20 Grad Celsius.
Waschen Sie die Probenkügelchen erneut mit einem Waschpuffer mit hohem Salzgehalt, einem Lithiumchlorid-Waschpuffer und einem 10-millimolaren Tris-Chlorwasserstoffpuffer. Geben Sie dann 47 Mikroliter kalten 10 millimolaren Tris-Chlorwasserstoffpuffer in die Probe. Um die Kerbe in der DNA zu reparieren, die durch die fehlende Phosphodiesterbindung entsteht, geben Sie 11,1 Mikroliter der Füllmischung in die Probe.
Inkubieren Sie die Probe 20 Minuten lang bei 30 Grad Celsius. Nach einer Reihe von Waschgängen geben Sie 50 Mikroliter kaltes, autoklaviertes, doppelt destilliertes Wasser in die Probe. Um die ChIP-DNA in der Richtung von fünf bis drei Primzahlen zu verdauen, fügen Sie Lambda-Exonuklease-Puffer und Lambda-Exonuklease hinzu und mischen Sie die Probe durch Pipettieren.
Inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nachdem die Verdauung abgeschlossen ist, wiederholen Sie die drei Wäschen ein letztes Mal. Um die ChIP-Probe aus den Kügelchen zu eluieren, resuspendieren Sie die Probe in 75 Mikrolitern ChIP-Elutionspuffer und Inkubator bei 65 Grad Celsius für 15 Minuten bei 130 mal G.Geben Sie 2,5 Mikroliter 20 Milligramm Proteinase K pro Milliliter in die Probe.
Die Probe kurz vortexen, dann über Nacht bei 65 Grad Celsius inkubieren. Die Probe kurz drehen und auf ein Magnetgestell legen. Nach einer Minute den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen umfüllen.
Reinigen und eluieren Sie die DNA. Nach der Aufreinigung der eluierten DNA werden 16 Mikroliter der extrahierten DNA-Probe in ein PCR-Röhrchen überführt. Geben Sie 1,2 Mikroliter Denaturierungs- und Grundglühmischung in die Probe.
Unter Verwendung des in Tabelle sechs des Manuskripts beschriebenen Programms werden Denaturierungs- und Anneal-Primer an die Template-DNA angepasst. Geben Sie drei Mikroliter Primerverlängerungsmischung in die Probe und führen Sie das in Tabelle 7 des Manuskripts beschriebene PCR-Programm durch. Geben Sie 4,1 Mikroliter DA-Tailing-Mix in die Probe und führen Sie die Probe mit dem PCR-Programm in Tabelle acht des Manuskripts durch.
Geben Sie dann 21,5 Mikroliter Universaladapter-Ligationsmischung in die Probe und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 20 Grad Celsius. Geben Sie 29 Mikroliter LM-PCR-Mix in die Probe und führen Sie die Probe dann mit dem Programm aus Tabelle 10 des Manuskripts durch. Nach 18 Zyklen der LM-PCR wurden ChIP-exo-Proben von Motoneuronen der Maus auf einem 1,5%igen Agarosegel elektrophoresiert.
Die Ergebnisse für ChIP-exo Islet-1 zeigten amplifizierte DNA-Bibliotheken von etwa 200 bis 400 Basenpaaren, was darauf hindeutet, dass die ChIP-exo-Bibliotheken erfolgreich durch LM-PCR amplifiziert wurden. Die Bande um 100 Basenpaare stellt Artefakte von Adaptern und PCR-Primern dar. Die Nicht-Antikörper-Kontrolle zeigt, dass unspezifische Hintergrund-DNA durch die Lambda-Exonuklease-Behandlung verdaut wurde.
Mit Hilfe von ChIP-exo und ChIP-seq wurden Insel-1-gebundene Positionen identifiziert. Das ChIP-exo-Signal war stark auf Insel-1-Bindungsstellen fokussiert und detektierte mehrere geclusterte Bindungsmuster von Insel-1-Transkriptionsfaktoren. Das ChIP-seq-Signal zeigte breitere Signale, die darauf hindeuteten, dass ChIP-exo eine höhere Kartierungsauflösung als ChIP-seq für Islet-1 aufwies.
Oft binden mehrere Transkriptionsfaktoren die DNA als Protein-DNA-Komplex nebeneinander. ChIP-exo ermöglicht es uns zu untersuchen, wie mehrere Transkriptionsfaktoren die Ziel-DNA erkennen und regulieren.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine genomische Kartierungsmethode vor, die die Auflösung von Protein-DNA-Interaktionen in neuronalen Zellen von Säugetieren verbessert. Durch die Nutzung von Chromatin-immunpräzipitierter DNA, die einer Exonukleaseverdauung unterzogen und anschließend mittels Hochdurchsatzsequenzierung analysiert wird, erreicht die Methode eine Kartierung mit nahezu basenpaargenauer Auflösung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Genomik
- Genregulation
Hintergrund
- Das Verständnis von Protein-DNA-Wechselwirkungen ist entscheidend für die Genregulation.
- Konventionelle Methoden weisen Einschränkungen hinsichtlich der Abbildungsauflösung auf.
- ChIP-exo bietet verbesserte Nachweismöglichkeiten.
- Diese Methode ist besonders nützlich bei der Untersuchung von neuronalen Zellen von Säugetieren.
Zweck der Studie
- Verbesserung der Auflösung bei der Kartierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen.
- Bereitstellung einer zuverlässigen Methode zur genomischen Kartierung.
- Vertiefung des Verständnisses der Mechanismen der Genregulation.
Verwendete Methoden
- Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von Exonuklease-Degradation.
- High-Throughput-Sequenzierung zur Datenerfassung.
- Herstellung magnetischer Protein-G-Kügelchen für die ChIP.
- Mischen und Blockieren von Lösungen für eine optimale Bindung.
Hauptergebnisse
- Erreichte nahezu basenpaarauflösende Kartierung.
- Zeigte ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis in den Ergebnissen.
- Validierte die Methode in neuronalen Kontexten von Säugetieren.
- Lieferte Einblicke in Protein-DNA-Wechselwirkungen.
Schlussfolgerungen
- Die ChIP-exo-Methode verbessert die Abbildungsauflösung erheblich.
- Diese Technik ist vorteilhaft für die Untersuchung der Genregulation.
- Zukünftige Anwendungen könnten unser Verständnis neuronaler Funktionen vertiefen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mithilfe einer hochauflösenden Kartierung von Protein-DNA-Interaktionen lassen sich Zielstrukturen in der frühen Entdeckungsphase präzise validieren, indem Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen mit nahezu basenpaargenauer Genauigkeit geklärt werden. Dies verringert mechanistische Unschärfen in Studien zur Genregulation und stärkt die Vorhersagekraft bei der Identifizierung von Leitstrukturen für Modelle neurologischer Erkrankungen. Die Methode verbessert die Absicherung therapeutischer Hypothesen, indem sie spezifische von unspezifischen genomischen Signalen unterscheidet.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung transkriptioneller regulatorischer Mechanismen in krankheitsrelevanten neuronalen Systemen.
- Operativer Wert: Bietet eine hochsensible Detektion der Protein-DNA-Bindung mit reduziertem Hintergrundrauschen.
- Predictiver Wert: Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung durch Kartierung von gehäuften Transkriptionsfaktor-Bindungsmustern.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative, hochauflösende Bindungsprofile zur Standardisierung von Assays.
- Operativer Wert: Erzeugt reproduzierbare DNA-Bibliotheken, die für nachgeschaltete Sequenzierungsworkflows geeignet sind.
- Skalierbarkeitswert: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform für mehrere Transkriptionsfaktoren in neuronalen Modellen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet Bindungsdaten aus der Entdeckungsphase mit krankheitsrelevanten Genregulationsprozessen in aus Stammzellen abgeleiteten Neuronen.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Kontinuität von der Zielstrukturfestlegung bis zur präklinischen Validierung durch konsistente genomische Messgrößen.
- Risikominderung: Unterstützt die Absicherung mechanistischer Modelle, indem falsch-positive Bindungssignale ausgeschlossen werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung des Targets bis hin zur Identifizierung von Leitstrukturen ein, indem sie präzise genomische Bindungsdaten liefert, die die Auswahl und Priorisierung von Targets unterstützen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch hochauflösende Kartierung der Bindung von Transkriptionsfaktoren an DNA.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch standardisierte, mit Exonuklease behandelte DNA-Bibliotheken mit einheitlichen Fragmentgrößen.
- Analytik: Liefert quantitative Bindungssignale, die den Vergleich von Protein-DNA-Wechselwirkungen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen erlauben.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem Bindungsstellen in für Krankheiten relevante neuronale Systeme validiert werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare genomische Kartierungsmethode für mehrere Zielstrukturen in neurowissenschaftlichen Entdeckungsprogrammen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Target-Validierung durch nahezu basenpaarauflösende Kartierung.
- Operationaler Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch kontrollierten Exonuklease-Digest und Bibliotheksherstellung.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen durch Verringerung von falsch-positiven Ergebnissen bei der Identifizierung von Bindungsstellen.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung von Targets basierend auf genomischen Bindungsdaten mit hoher Vertrauenswürdigkeit.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der chromatinbasierten Immunpräzipitation und enzymatischen DNA-Aufarbeitung.
- Setzt Zugang zu magnetischen Bead-Handhabung, Exonuklease-Enzymen und Hochdurchsatzsequenzierung voraus.
- Benötigt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams hinsichtlich der Antikörpervalidierung und der Stringenz der Waschschritte.
- Zu berücksichtigende Anpassungsaspekte umfassen die Optimierung für verschiedene Transkriptionsfaktoren und neuronale Subtypen.
- Zu den praktischen Einschränkungen zählen die Qualität der Input-DNA und die Spezifität der Antikörper, die die Signalhelligkeit beeinflussen.
