Name: Überwachung des Überlebens von Influenzaviren außerhalb des Wirts mithilfe der Echtzeit-Zellanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Erfahren Sie die Echtzeit-Zellanalyse zur Überwachung von Influenzaviren außerhalb des Wirts. Diese Methode ermöglicht präzise Quantifizierung infektiöser Partikel und ersetzt aufwendige Endpunktanalysen.

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Behandeln Sie alle Influenzaviren gemäß den entsprechenden Anforderungen an die biologische Sicherheit (BSL-2 oder höher, je nach Subtyp). Verwenden Sie IAV-Stämme mit einer niedrigen Passagengeschichte (weniger als 5x auf MDCK-Zellen), um eine geringe Variation zwischen den Experimenten sicherzustellen.
1. Herstellung von Reagenzien und Ausgangsstoffen
<ol><li>Präparation von MDCK-Zellen und sterilem Zellkulturmedium<ol>
<li>Kultivieren Sie Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) Zellen in modifiziertem Eagle's Medium (MEM), ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fetalem Kalbserum (FCS) und Antibiotika (100 Einheiten / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin).</li>
		<li>Nach dem Auftauen passieren MDCK-Zellen mindestens 2x, bevor Sie sie infizieren, um eine vollständige Genesung zu gewährleisten (aber weniger als 30 Passagen, um eine Drift in den Zellphänotypen zu vermeiden).</li>
		<li>Samen Sie 75 cm2 Gewebekulturkolben mit 30 ml sterilem 1x MEM mit 7,5 x 106 MDCK-Zellen und inkubieren Sie bei 37 °C in befeuchtetem 5% CO2-Inkubator.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung von Impedanzüberwachungsgeräten<ol>
<li>Stellen Sie das Gerät bei 35 °C in den Inkubator und lassen Sie es mindestens 2 h aufwärmen.</li>
		<li>Schließen Sie es an die Steuereinheit an, die sich außerhalb des Inkubators befindet.</li>
		<li>Fahren Sie mit den vom Hersteller empfohlenen Reinigungsverfahren fort, bevor Sie mit dem Rest des Experiments beginnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herstellung von IAV-Beständen auf MDCK-Zellen<ol>
<li>Zur Vermehrung und Amplifikation von H1N1-Viren werden 7,5 x 106 MDCK-Zellen auf zwei 75 cm2 Gewebekulturflaschen gesät und 24 h bei 37 °C inkubiert, um eine Konfluenz von 90 %–100 % zu erreichen.</li>
		<li>Dekantieren Sie das Zellkulturmedium aus der Zellmonoschicht in 75 cm2 Kolben. Waschen Sie die Zellen mit 5 ml sterilem 1x PBS.</li>
		<li>Entfernen Sie PBS und fügen Sie 5 ml 1x PBS hinzu, um die Zellen erneut zu waschen.</li>
		<li>Beschriften Sie einen Kolben als Kontrolle und entfernen Sie PBS, bevor Sie 15 ml Virusvermehrungsmedien (1x MEM mit 0% FCS) vorsichtig auf die Monoschicht geben. Inkubieren Sie diesen Kolben in einem Inkubator, der bei 35 °C mit 5% CO2 gehalten wird. Verwenden Sie es zum Vergleich nach 3 Tagen der Vermehrung.</li>
		<li>Eine Durchstechflasche mit IAV-Bestand bei RT auftauen. Das Virus wird in einem 1,5-ml-Röhrchen, das Virusvermehrungsmedien enthält (1x MEM mit 0% FCS), auf die entsprechende Konzentration verdünnt.</li>
		<li>Entfernen Sie 1x PBS aus dem 75 cm2-Kolben und infizieren Sie MDCK-Zellen bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 1 x 10-3 oder 1 x 10-4 plaquebildenden Einheiten pro Zelle (pfu / Zelle), indem Sie 1 ml des verdünnten Virus in die Zellmonoschicht geben.</li>
		<li>Adsorbieren Sie das Virus an MDCK-Zellen für 45 min bei RT, indem Sie den Kolben regelmäßig alle 15 min umrühren.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig das Inokulum und geben Sie 15 ml Virusvermehrungsmedien pro Kolben hinzu, die 1 μg/ml TPCK-Trypsin (Trypsin/L-1-tosylamid-2-phenylethylchlormethylketon) enthalten, um das virale Hämagglutinin HA0 in HA1- und HA2-Untereinheiten zu spalten (ein Ereignis, das für die HA-Fusion mit der endosomalen Membran und die Freisetzung des viralen Genoms erforderlich ist)22.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Kolben bei 35 °C und 5% CO2 für mindestens 3 Tage, um das Virus zu replizieren.</li>
		<li>Beobachten Sie MDCK-Zellen unter dem Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung und suchen Sie nach zytopathischen Effekten (CPE) auf die Zellen (durch Vergleich mit dem Zellkontrollkolben). Wenn CPE nicht vollständig ist (d. h. etwa 80% der Zellen sind vom Substrat getrennt), stellen Sie die Kolben für weitere 24 h wieder in den Inkubator.</li>
		<li>Wenn CPE abgeschlossen ist, dekantieren Sie den Zellkulturüberstand und zentrifugieren Sie bei 300 x g für 10 min, um die Zelltrümmer zu pelletieren.</li>
		<li>Übertragen Sie den geklärten Überstand auf ein 15-ml-Röhrchen und aliquote Nachkommenviren auf sterile kryogene Einwegfläschchen. Stellen Sie die Kryotuben sofort bei -80 °C auf, um Viren einzufrieren und zu lagern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bestimmung einer geeigneten Zellmenge für die Infektion von Zellen
HINWEIS: Bewahren Sie die Platten bei allen Experimenten immer auf nicht elektrostatischen Oberflächen auf, z. B. auf den Papierverpackungen der Verpackung. Befolgen Sie Abschnitt 2 unten, um die am besten geeignete Konzentration von Zellen zu bestimmen, die in der elektronischen Mikrotiterplatte (als E-Platte ausgelegt) ausgesät werden sollen.
<ol><li>Bereiten Sie MDCK-Zellen in 75 cm2-Kolben vor, um 24 h vor dem Experiment frisch gespaltene Zellen (ca. 80% Konfluenz) zu erhalten.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen mit 5 ml 1x PBS und lösen Sie sie durch Zugabe von 3 ml 0,25% iger Trypsin-EDTA-Lösung.</li>
	<li>Fügen Sie 7 ml frisches Zellkulturmedium hinzu und zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler mit Trypanblaufärbung.</li>
	<li>Stellen Sie die Zellkonzentration mit Zellkulturmedien auf 400.000 Zellen/ml ein. Führen Sie zweifache serielle Verdünnungen in zusätzlichen Röhrchen durch, um Zelldichten von 200.000 zu erhalten; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; und 6.250 Zellen/ml. Passen Sie den Verdünnungsbereich der Zellen entsprechend dem Zelltyp und ihrem Wachstumsverhalten an.</li>
	<li>Lassen Sie die E-Platte (Table of Materials) für einige Minuten bei RT und geben Sie 100 μL Zellkulturmedien mit einer Mehrkanalpipette zu jeder Vertiefung hinzu. Berühren Sie nicht die Elektroden der E-Plate.</li>
	<li>Entriegeln Sie die Halterungen und stecken Sie die Plattenfront in die Halterungstasche des Impedanzmessgeräts (Materialtabelle). Schließen Sie die Tür des Inkubators.</li>
	<li>Öffnen Sie die Software.<ol>
<li>Wählen Sie unter "Standard-Experimentmuster-Setup" die ausgewählte(n) Dockingstation(n) aus, doppelklicken Sie auf die obere Seite, und geben Sie dann den Namen des Experiments ein. Klicken Sie auf "Layout" und geben Sie die erforderlichen Probeninformationen für jede ausgewählte Vertiefung der Platte ein. Klicken Sie dann auf "Übernehmen", wenn Sie fertig sind. Klicken Sie auf "Zeitplan" | | "Schritte" "Fügen Sie einen Schritt hinzu". Die Software fügt automatisch einen Schritt von 1 s hinzu, um die Hintergrundimpedanz (CI) zu messen.</li>
		<li>Klicken Sie im Reiter "Ausführen" auf "Start/Weiter". Klicken Sie auf "Plot", fügen Sie alle Proben hinzu, indem Sie die entsprechenden Bohrlöcher auswählen, und stellen Sie sicher, dass der KI zwischen -0,1 und 0,1 liegt, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernen Sie die Platte von der Halterung.</li>
	<li>100 μL jeder Zellsuspension aus Schritt 2.4 werden doppelt in die entsprechenden Vertiefungen und 100 μL Zellmedien in Vertiefungen, die als Kontrollen verwendet werden, gegeben. Lassen Sie die E-Platte bei RT 30 minuten in der Laminar-Flow-Haube, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen an den Böden der Vertiefungen zu ermöglichen.</li>
	<li>Stecken Sie die E-Platte in die Wiegetasche. Klicken Sie auf "Zeitplan" | "Schritt hinzufügen" in der Software und geben Sie Werte ein, um die Zellen alle 30 Minuten für 200 Wiederholungen zu überwachen. Wählen Sie dann "Start/ Weiter".</li>
	<li>Überprüfen und plotten Sie die CI-Daten, indem Sie in der Software auf die Schaltfläche "Plot" klicken. Wählen Sie die Konzentration der Zellen, die sich kurz vor der stationären Phase 24 h nach der Aussaat auf der Platte befinden, um Zellen zu erhalten, die sich während der Virusinfektion noch in einer Wachstumsphase befinden. Die stationäre Phase ist erreicht, wenn die KI auf ihrem Maximum ist.</li>
</ol>3. Korrelation zwischen CIT50-Werten und Vielzahl der Infektionen
<ol><li>Fügen Sie 100 μL steriles 1x MEM-Kulturmedium in jede Vertiefung der E-Platte hinzu. Setzen Sie die E-Platte bei 35 °C in die Wiegetasche des Instruments ein. Messen Sie den Hintergrund wie in Schritt 2.7 beschrieben.</li>
	<li>Entfernen Sie die E-Platte von der Halterung.</li>
	<li>Säen Sie 3 x 104 frisch gespaltene MDCK-Zellen auf jede Vertiefung der elektronischen Mikrotiterplatte und züchten Sie sie für 24 h bei 35 °C mit 5% CO2 , so dass sie sich während der IAV-Infektion in einer replikativen Phase befinden.</li>
	<li>Infizieren Sie MDCK-Zellen mit verschiedenen 10-fachen Verdünnungen eines bekannten 6 log10 TCID50 / ml-Titers des H1N1-Virus, indem Sie die umgekehrte Pipettierung für die Reproduzierbarkeit verwenden, indem Sie die folgenden Schritte ausführen:<ol>
<li>Spülen Sie MDCK-Zellen 2x mit 100 μL MEM ohne FCS (Virus Propagation Media). Achten Sie darauf, alle Medien nach der zweiten Wäsche zu entfernen, um eine weitere Verdünnung des Inokulums zu vermeiden.</li>
		<li>Fügen Sie 100 μL Virussuspension in jede Vertiefung mit einer Einkanalpipette hinzu. Um eine Kontamination zu vermeiden, beginnen Sie von links nach rechts und dann von oben nach unten in der Platte, während Sie die verbleibenden Vertiefungen mit dem Deckel abdecken.</li>
		<li>Setzen Sie die Platte bei 35 °C in die Wiegetasche des Instruments ein. Seien Sie sanft, um plötzliche Bewegungen zu vermeiden, die möglicherweise zu Kontaminationen führen.</li>
		<li>Beginnen Sie mit der Überwachung der Zellimpedanz alle 15 Minuten während mindestens 100 h, wie in Schritt 2.10 beschrieben.</li>
		<li>Nach den beiden Messzyklen (d. h. 30 min) pausieren Sie das Gerät, indem Sie auf der Registerkarte "Ausführen" auf "Pause" klicken und die E-Platte aus der Dockingstation entfernen.</li>
		<li>1 μg/ml TPCK-Trypsin in das Virusvermehrungsmedium geben, um das virale Hämagglutinin zu spalten.</li>
		<li>Fügen Sie 100 μL TPCK-Trypsin enthaltende Virusvermehrungsmedien in jede Vertiefung hinzu und stecken Sie die E-Platte in die Cradle-Tasche.</li>
		<li>Klicken Sie auf der Registerkarte "Ausführen" auf "Start/Weiter". HINWEIS: Vergessen Sie nicht, eine Negativkontrolle zu erstellen, die den mit Schein infizierten Zellen entspricht, indem Sie die Virussuspension durch Virusvermehrungsmedien ersetzen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. IAV-Überlebenskinetik
<ol><li>Setzen Sie IAV salzdestilliertem Wasser bei 35 °C aus und testen Sie ihre Infektiosität im Laufe der Zeit, indem Sie die Abnahme der Zellimpedanz messen.<ol>
<li>Salzhaltiges destilliertes Wasser durch Zugabe von NaCl zu einer Endkonzentration von 35 g/L in destilliertem Wasser zubereiten. 900 μL Salzwasser in 2 mL Kryotuben geben.</li>
		<li>100 μL Virusvorrat in Salzwasser geben und die Kryotuben für 1 h, 24 h oder 48 h in einen Inkubator (35 °C, 5% CO2) geben.</li>
		<li>Säen Sie 100 μL (mit 3 x 104) frisch gespaltener MDCK-Zellen auf eine 16-Well-Mikrotiterplatte und wachsen Sie 24 h bei 37 °C und 5% CO2.</li>
		<li>Infizieren Sie Zellen mit 100 μL exponierten Viren (zuvor 10x in Kulturmedien verdünnt) unter Verwendung der reversen Pipettiermethode zur Reproduzierbarkeit durch Wiederholung von Abschnitt 3.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Überwachen Sie die Zellimpedanz alle 15 Minuten für mindestens 100 h.</li>
</ol>5. Bewertung des Verlusts der Infektiosität
<ol><li>Bestimmung von CIT50-Werten zur Quantifizierung der CI-Abnahme aufgrund virusinduzierter zytopathischer Effekte mit dem CIT50-Wert .<ol>
<li>Klicken Sie auf "Plot" und fügen Sie alle Beispiele hinzu, indem Sie auf "Alle hinzufügen" klicken. Exportieren Sie die Ergebnisse in eine Tabelle, indem Sie auf "Experimentinformationen exportieren" klicken. Betrachten Sie die anfängliche CI als zellulären Impedanzwert, der 5 h nach der Zellinfektion durch exponierte Viren gemessen wird (d. h. 24 h nach dem Seeding von MDCK-Zellen auf der E-Platte des Mikrotiters).</li>
		<li>Berechnen Sie den CIT50-Wert , der der erforderlichen Zeit entspricht, um eine 50%ige Abnahme gegenüber dem ursprünglichen CI zu messen. Um den CIT50-Wert zu berechnen, notieren Sie sich den CI-Wert bei 5 hpi für jede Probe. Ermitteln Sie dann den Zeitpunkt, zu dem der CI-Wert gleich der Hälfte des CI-Werts bei 5 HPI ist, indem Sie die Index- und Übereinstimmungsfunktionen in der Tabelle verwenden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Berechnung der mittleren Inaktivierungssteigung<ol>
<li>Bestimmen Sie die CIT50-Werte für jede exponierte Virussuspension zu unterschiedlichen Expositionszeiten (in Tagen).</li>
		<li>Berechnen Sie eine lineare Regressionssteigung aus CIT50-gezeichneten Werten, die als Inaktivierungssteigung bezeichnet und in CIT50.tag-1 ausgedrückt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

RTCA ist eine impedanzbasierte Technologie, die zunehmend zur Echtzeitüberwachung von Zelleigenschaften wie Zelladhärenz, Proliferation, Migration und Zytotoxizität eingesetzt wird. In dieser Studie wird die Fähigkeit dieser Technologie zur Beurteilung des IAV-Überlebens außerhalb des Wirts durch messung der Virusinaktivierungssteigung nachgewiesen. Anspruchsvolle Techniken wie TCID50 und Plaque-Assays werden durch eine objektive Echtzeitbewertung der Zelllebensfähigkeit ersetzt und spiegeln so die durch das V...

Die Übertragung eines Virus beruht auf der Kombination mehrerer Faktoren. Für ein virus, das in der Umwelt sezerniert wird, hängt seine Übertragung auch von der Fähigkeit ab, unter Bedingungen außerhalb des Wirts zu bestehen. Die Untersuchung der Virusinaktivierung im Allgemeinen ist daher ein entscheidender Schritt, um die nationalen Gesundheitsbehörden und politischen Entscheidungsträger bei der Umsetzung von Kontroll- und Biosicherheitsmaßnahmen zu unterstützen.
Das Wissen über die Persistenz von Viren in natürlichen und Laborumgebungen hat in den letzten zehn Jahren erheblich zugenommen. Bei Influenza-A-Viren (IAV) setzen ihre Übertragungswege Viruspartikel einer Vielzahl von Umweltbedingungen aus. Insbesondere können sie über 1) fäkal-orale Wege durch Wasser (d.h. Vogelviren) oder 2) direkten oder indirekten Kontakt durch kontaminierte Fomiten sowie Aerosole und Atemtröpfchen (d.h. Geflügel- und Säugetierviren)1 übertragen werden. In jedem Fall werden IAV verschiedenen physikalisch-chemischen Parametern (d.h. pH-Wert, Salzgehalt, Temperatur und Luftfeuchtigkeit) ausgesetzt, die ihre Infektiosität mehr oder weniger schnell beeinflussen2,3,4,5,6,7,8,9. Insbesondere bei zoonotischen und pandemischen Viren ist es von großer Bedeutung, das Potenzial von Umweltfaktoren zur Beeinflussung der Virusdynamik und die Risiken einer Exposition und artenübergreifenden Übertragung zu bewerten.
Bisher wurden traditionelle virologische Techniken (d.h. virale Titerbestimmung durch Plaque-Assays oder 50% Abschätzung der infektiösen Dosis in der Gewebekultur) verwendet, um die IAV-Infektiosität im Laufe der Zeit zu bewerten; aber diese Techniken sind zeitaufwendig und erfordern viele Vorräte10,11,12. Die Messung der Impedanz infizierter Zellen im Laufe der Zeit mit Mikroelektroden dient als nützliches Werkzeug, um das IAV-Überleben unter verschiedenen Umweltbedingungen sowie die Virusinaktivierung im Allgemeinen zu überwachen. Diese Methode liefert objektive Echtzeitdaten, die die subjektive Beobachtung zytopathischer Effekte beim Menschen ersetzen. Es kann verwendet werden, um die Virustitration zu bestimmen, wodurch traditionelle Messungen mit niedrigeren Konfidenzintervallen ersetzt und arbeitsintensive Endpunkt-Assays vermieden werden.
Es besteht eine lineare Korrelation zwischen Titrationsergebnissen, die durch Messung der Zellimpedanz und durch klassische Plaque-Assay- oder TCID50-Methoden erhalten werden. Daher können Daten, die mit der impedanzbasierten Titrationsmethode erhalten werden, leicht in TCID50- oder pfu-Werte transformiert werden, indem eine Standardkurve mit serieller Verdünnung des Virus erstellt wird13,14,15,16,17. Der Nachweis, die Quantifizierung und die Wirksamkeit neutralisierender Antikörper in Serumproben können ebenfalls mit diesem experimentellen Ansatz erreicht werden18,19. In jüngerer Zeit wurden impedanzbasierte zelluläre Assays verwendet, um antivirale Verbindungen gegen Equid-Alphaherpesviren zu screenen und zu bewerten20.
Diese Technologie wurde verwendet, um die Persistenz von IAVs in Salzwasser bei verschiedenen Temperaturen zu bewerten und Mutationen im Hämagglutinin von IAV zu identifizieren, die die IAV-Persistenz in der Umwelt erhöhen oder verringern21. Ein solches Screening würde umfangreiche Arbeiten erfordern, wenn traditionelle Titrationsmethoden verwendet würden. Diese Methodik kann jedoch für jedes Virus verwendet werden, das sich auf die Zellmorphologie, die Zellzahl und die Stärke der Zelloberfläche auswirkt. Es kann auch verwendet werden, um die Persistenz unter verschiedenen Umgebungsbedingungen (z. B. in der Luft, im Wasser oder auf Oberflächen) zu überwachen.
Das hier beschriebene Protokoll verwendet als Beispiel das IAV-Überleben im Wasser. Menschliche Influenzaviren sind über einen längeren Zeitraum verschiedenen physikalisch-chemischen Parametern ausgesetzt. Salzhaltiges (35 g/L NaCl) Wasser bei 35 °C wurde auf der Grundlage früherer Ergebnisse als Umweltmodell gewählt9. Die Restinfektiosität exponierter Viren wird zu verschiedenen Zeitpunkten durch Zellinfektion quantifiziert. MDCK-Zellen, der Referenzzelltyp für die IAV-Amplifikation, werden auf 16 mit Mikroelektrodensensoren beschichtete Well-Mikrotiterplatten gesät und 24 h später von exponierten Viren infiziert. Die Zellimpedanz wird alle 15 Minuten gemessen und als beliebige Einheit ausgedrückt, die als Zellindex (CI) bezeichnet wird. Zytopathische Wirkungen, die durch das Influenzavirus induziert werden und deren Entstehungsrate direkt von der Anzahl der infektiösen Viruspartikel abhängt, die der Zellkultur geimpft werden, führen zu einer CI-Abnahme, die anschließend als CIT50-Wert quantifiziert wird. Dieser Wert entspricht der Zeit, die erforderlich ist, um eine Reduktion von 50% gegenüber dem ursprünglichen CI (d. h. vor der Viruszugabe) zu messen. CIT50-Werte , die für mehrere Umweltexpositionszeiten berechnet wurden, erlauben die Ableitung der Inaktivierungssteigung eines Virus nach linearer Regression der CIT50-Werte .

<table><tbody><tr><td>0,25%Trypsin</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Gewebekulturkolben</td><td>Falcon</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>E-Plate 16 (6 Platten)</td><td>ACEA Biosciences, Inc</td><td>5469830001</td><td>E-Platten sind in verschiedenen Verpackungen erhältlich</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Life Technologies (gibco)</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>MEM 1X</td><td>Life Technologies (gibco)</td><td>31095029</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Life Technologies (gibco)</td><td>14040091</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies (gibco)</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>TPCK-Trypsin</td><td>Worthington</td><td>LS003740</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16</td><td>ACEA Biosciences, Inc</td><td>380601310</td><td>Die xCELLigence RTCA S16 Geräte sind in verschiedenen Formaten erhältlich (16-Well, 96-Well, Single- oder Multi-Plate)</td></tr></tbody></table>

Überwachung des Überlebens von influenzaviren außerhalb des wirts mithilfe der echtzeit-zellanalyse

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Methoden zur Quantifizierung von Viruspartikeln stellen einen kritischen Aspekt vieler virologischer Studien dar. Obwohl es mehrere zuverlässige Techniken gibt, sind sie entweder zeitaufwendig oder nicht in der Lage, kleine Variationen zu erkennen. Hier wird ein Protokoll zur präzisen Quantifizierung des viralen Titers vorgestellt, indem elektrische Impedanzvariationen infizierter Zellen in Echtzeit analysiert werden. Die zelluläre Impedanz wird durch Goldmikroelektroden-Biosensoren gemessen, die sich unter den Zellen in Mikroplatten befinden, wobei die Größe von der Anzahl der Zellen sowie ihrer Größe und Form abhängt. Dieses Protokoll ermöglicht eine Echtzeitanalyse der Zellproliferation, Lebensfähigkeit, Morphologie und Migration mit erhöhter Sensitivität. Ebenfalls enthalten ist ein Beispiel für eine praktische Anwendung durch Quantifizierung des Zerfalls des Influenza-A-Virus (IAV), das verschiedenen physikalisch-chemischen Parametern ausgesetzt ist, die die virale Infektiosität im Laufe der Zeit beeinflussen (d. H. Temperatur, Salzgehalt und pH-Wert). Für solche Anwendungen reduziert das Protokoll den Arbeitsaufwand und generiert gleichzeitig präzise Quantifizierungsdaten von infektiösen Viruspartikeln. Es ermöglicht den Vergleich von Inaktivierungsneigungen zwischen verschiedenen IAV, was ihre Fähigkeit widerspiegelt, in einer bestimmten Umgebung zu persistieren. Dieses Protokoll ist einfach durchzuführen, ist hochgradig reproduzierbar und kann auf jedes Virus angewendet werden, das zytopathische Effekte in Zellkultur hervorruft.

Rohdaten, die nach 120 h mit unterschiedlichen Konzentrationen von MDCK-Zellen von 15.000 bis 120.000 Zellen pro Bohrung gewonnen wurden, sind in Abbildung 1 dargestellt. Nach 24 h zeigen CI-Messungen, dass sich Zellen in Vertiefungen, die mit 30.000 Zellen ausgesät waren, noch in der exponentiellen Wachstumsphase befanden, und diese Zellkonzentration wurde für weitere Experimente verwendet. Abbildung 2 veranschaulicht die lineare Korrelation zwischen CIT50...

Hier wird ein Protokoll zur Quantifizierung infektiöser Viruspartikel unter Verwendung der Echtzeitüberwachung der elektrischen Impedanz infizierter Zellen beschrieben. Eine praktische Anwendung dieser Methode wird durch die Quantifizierung des Influenza-A-Virus-Zerfalls unter verschiedenen physikalisch-chemischen Parametern, die Umweltbedingungen nachahmen, vorgestellt.

Überwachung des Überlebens von Influenzaviren außerhalb des Wirts mithilfe der Echtzeit-Zellanalyse

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Methoden zur verschiedenen Partikelquantifizierung stellen einen kritischen Aspekt der meisten biologischen Studien dar. Dieses Protokoll ermöglicht eine präzise Quantifizierung der viralen Daten in Echtzeit. Diese Technik ersetzt die traditionelle Messung viraler Daten.Durch objektive Echtzeitdaten liegen wir unter unserem Konfidenzintervall und vermeiden arbeitsintensive Endpunkte, die bewertet werden. Diese Methode kann für alle Viren verwendet werden, die eine zytopathische Wirkung induzieren. Das Verfahren wird Quentin Grassin, ein Labortechniker aus unserem Labor, demonstrieren.Um H1N1-Viren zu vermehren und zu verstärken, säen Sie 7,5 mal 10 zu den 6 MDCK-Zellen auf zwei 75 Quadratzentimeter Großen Gewebekulturflaschen gemäß Standardprotokollen und inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius, um 90 bis 100% Konfluenz zu erreichen. Am nächsten Tag waschen Sie die Zellen zweimal mit fünf Millilitern sterilem PBS pro Kolben und Waschgang und beschriften Sie einen Kolben als Kontrolle. Anschließend wird eine aufgetaute Durchstechflasche mit Influenza-A-Virusmaterial in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen, das frisches Virusvermehrungsmedium enthält, auf die entsprechende experimentelle Konzentration verdünnt.Verwenden Sie einen Milliliter des verdünnten Materials, um die MDCK-Zellen bei einer Vielzahl von Infektionen von 1 mal 10 bis zu den negativen 3 oder 1 mal 10 zu den negativen 4 plaquebildenden Einheiten pro Zelle zu infizieren, und fügen Sie einen Milliliter Virusvermehrungsmedium in den Kontrollkolben hinzu. Adsorbieren Sie das Virus für 45 Minuten bei Raumtemperatur an den Zellen, wobei alle 15 Minuten gerührt wird. Am Ende der Inkubation wird das Inokulum entfernt und durch 15 Milliliter Virusvermehrungsmedium ersetzt, das mit einem Mikrogramm pro Milliliter TPCK-Trypsin ergänzt wird, um die Spaltung von viralem Hämagglutinin HA0 in HA1- und HA2-Untereinheiten zu erleichtern.Dann legen Sie den Kolben für drei Tage in den 35 Grad Celsius heißen Inkubator. Vergleichen Sie am Ende der Inkubation die Zellen in jeder Kultur unter einem 40-fachen Objektiv auf einem Lichtmikroskop, um die zytopathischen Wirkungen auf die Zellen zu beurteilen. Wenn der zytopathische Effekt abgeschlossen ist, fügen Sie die Zellkulturüberstände zu einem 15-Millimeter-Röhrchen hinzu und sammeln Sie die Zelltrümmer aus jeder Kultur durch Zentrifugation.Dann übertragen Sie den geklärten Viruskulturüberstand in ein 15-Milliliter-Röhrchen und aliquotieren Sie die Nachkommenviren zu sterilen kryogenen Einwegfläschchen für eine Lagerung von minus 80 Grad Celsius. Um die geeignete Zellmenge für die Zellinfektion zu bestimmen, bereiten Sie 24 Stunden lang etwa 80% konfluente MDCK-Zellkulturen vor, wie nachgewiesen, bevor Sie die Zellen mit PBS waschen und mit einer 45-minütigen Inkubation in drei Millilitern 0,25% Trypsin-EDTA pro Kolben bei 37 Grad Celsius ernten. Wenn sich die Zellen abgelöst haben, stoppen Sie die Reaktion mit sieben Millilitern frischem Kulturmedium pro Kolben und zählen Sie die Zellen aus jeder Kultur.Verdünnen Sie die Zellen auf 4 mal 10 bis 5. Zellen pro Milliliter Zellkulturmedium und führen Sie zweifache serielle Verdünnungen der Zellen wie angegeben durch. Legen Sie eine E-Platte für einige Minuten bei Raumtemperatur auf, bevor Sie 100 Mikroliter Zellkulturmedium in jede Vertiefung geben, ohne die Elektroden der E-Platte zu berühren. Entriegeln Sie die Halterungen und stecken Sie das vordere Ende der Platte in die Halterungstasche des Impedanzmessgeräts.Schließen Sie die Tür des Inkubators und öffnen Sie die Software. Markieren Sie im Standard-Experimentmuster-Setup die ausgewählten Dockingstationen, und doppelklicken Sie auf die obere Seite, um den Namen des Experiments einzugeben. Klicken Sie auf Layout und geben Sie die erforderlichen Probeninformationen für jede ausgewählte Vertiefung der Platte ein.Klicken Sie auf Zeitplan, Schritte und Schritt hinzufügen. Die Software fügt automatisch einen einsekündigen Schritt hinzu, um die Hintergrundimpedanz zu messen Klicken Sie auf Ausführen und Starten, Weiter. Klicken Sie auf Plotten und Hinzufügen, um die entsprechenden Vertiefungen auszuwählen, und vergewissern Sie sich, dass die Hintergrundimpedanz zwischen minus 0,1 und 0,1 liegt, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.Als nächstes entfernen Sie die Platte aus der Halterung und geben Sie 100 Mikroliter jeder Zellsuspension in die entsprechenden Vertiefungen in doppelter Ausfertigung. Lassen Sie die E-Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur in der Laminar-Flow-Haube, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen auf den Boden der Vertiefungen zu ermöglichen, bevor Sie die E-Platte in die Wiegetasche laden. Klicken Sie auf Zeitplan und Schritt hinzufügen und geben Sie Werte ein, um die Zellen alle 30 Minuten auf 200 Wiederholungen zu überwachen, bevor Sie Start und Weiter auswählen.Um die Zellimpedanzdaten zu überprüfen und aufzuzeichnen, klicken Sie auf Plot und wählen Sie die Zellkonzentration aus, die sich 24 Stunden nach dem Seeding kurz vor der stationären Phase befindet, um Zellen zu erhalten, die sich während der Virusinfektion noch in einer Wachstumsphase befinden. Um die Korrelation zwischen den CIT50-Werten und der Vielzahl der Infektion zu bestimmen, waschen Sie die Zellen nach der Kultivierung von 3 mal 10 bis 4. frisch gespaltenen MDCK-Zellen in jede Vertiefung der elektronischen Mikrotiterplatte für 24 Stunden zweimal mit 100 Mikrolitern frischem Virusvermehrungsmedium pro Vertiefung und pro Wäsche und verwenden Sie eine Einkanalpipette, um 100 Mikroliter Virussuspension in jede Vertiefung zu geben. Wenn alle Virusverdünnungen hinzugefügt wurden, laden Sie die Platte vorsichtig bei 35 Grad Celsius in die Cradle-Tasche des Instruments und beginnen Sie, die Zellimpedanz alle 15 Minuten für mindestens 100 Stunden zu überwachen, wie gezeigt.Klicken Sie nach zwei Messzyklen, um das Gerät anzuhalten, und entfernen Sie die E-Platte aus der Dockingstation. Fügen Sie 100 Mikroliter Virusvermehrungsmedium, ergänzt mit TPCK-Trypsin, zu jeder Vertiefung hinzu und geben Sie die E-Platte in die Wiegetasche zurück. Starten Sie dann die Analyse.Um die Überlebenskinetik des Influenza-A-Virus zu beurteilen, fügen Sie Natriumchlorid zu einer Endkonzentration von 35 Gramm pro Liter in destilliertem Wasser hinzu und geben Sie 900 Mikroliter der resultierenden Kochsalzlösung zu Zwei-Milliliter-Kryoröhren hinzu. Fügen Sie jedem Kryoröhrchen 100 Mikroliter Virusmaterial hinzu und legen Sie die Röhrchen für den entsprechenden Versuchszeitraum in den 35 Grad Celsius heißen Inkubator. Am Tag vor dem Ende der Inkubation säen Sie 3 mal 10 bis 4. frisch gespaltene MDCK-Zellen und 100 Mikroliter Virusvermehrungsmedium pro Vertiefung in einer 16-Well-Mikrotiterplatte in Wiederholungsschritten, um die Messung der Hintergrundimpedanz und gleichmäßigen Verteilung der Zellen auf den Boden der Vertiefungen zu ermöglichen.Dann wachsen die Zellen für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag zweimal, infizieren Sie die Zellen dann mit 100 Mikrolitern des kochsalzdestillierten Virus, das 10-mal in frischem Kulturmedium verdünnt wird, wie gezeigt, und überwachen Sie die Zellimpedanz alle 15 Minuten für mindestens 100 Stunden. Hier werden Rohdaten gezeigt, die nach 120 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen von MDCK-Zellen gewonnen wurden.Nach 24 Stunden zeigten Zellindexmessungen, dass sich Zellen in Vertiefungen, die mit 3 mal 10 bis 4 Zellen ausgesät waren, noch in der exponentiellen Wachstumsphase befanden, daher wurde diese Zellkonzentration für nachfolgende Experimente verwendet. MDCK-Zellkulturen zeigen eine klare lineare Beziehung zwischen dem CIT50 und der anfänglichen Vielzahl von Infektionen durch influenzavirales Virus. Die Ergebnisse eines typischen kinetischen Überlebensexperiments zeigen eine Abnahme des Zellindex aufgrund der virusinduzierten zytopathischen Wirkung.Der CIT50 kann verwendet werden, um die virale Inaktivierungssteigung für jedes Virus in jedem Zustand zu berechnen, um festzustellen, welches Virus die größte Stabilität in der untersuchten Umgebung hatte. Die Stabilität des Virus korreliert indirekt mit der Inaktivierungssteigung, so dass beispielsweise Aminosäurereste im Hämagglutininglykoprotein identifiziert werden können, die am Überleben des Influenza-A-Virus außerhalb des Wirts beteiligt sind. Diese Technik reagiert sehr empfindlich auf kleine Variationen.Daher wird die Verwendung eines automatischen Zellzählers empfohlen, um reproduzierbare Ergebnisse zwischen den Experimenten zu erhalten. Diese Methode kann auch verwendet werden, um die Replikation verschiedener Viren zu vergleichen, den Virustropismus für mehrere Zelllinien gleichzeitig zu untersuchen oder bestimmte Schritte des Viruszyklus zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Diese Methode beschreibt die Verwendung von Infrarot-Farbstoff basierende Imaging-System für den Nachweis von H1N1 in bronchioalveolar Lavage (BAL) Flüssigkeit von infizierten Mäuse mit einer hohen Empfindlichkeit. Diese Methodik in einem 96 durchgeführt werden kann - oder 384-Well-Platte, erfordert &lt;10 ul Volumen von Testmaterial und hat das Potenzial für die gleichzeitige Screening von mehreren Erregern.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

In diesem Video demonstrieren wir den Prozess der Echtzeitüberwachung zellulärer Ereignisse, einschließlich der Proliferation adhärenter Zellen, über einen zellulären Impedanzassay. Dabei wirken die adhärenten Zellen als Isolatoren, die den Stromfluss zwischen den Elektroden begrenzen und die Impedanz erhöhen.

Zelluläre impedanzbasierte Analyse zur Überwachung zellulärer Prozesse in Echtzeit

In diesem Video diskutieren wir die Korrelation zwischen dem CIT50 und der Vielzahl von Virusinfektionen. Die virusinfizierten Zellen zeigen zytopathische Wirkungen, die zu ihrem Tod und ihrer Ablösung von der Goldmikroelektrode führen, was wiederum die Impedanz verringert.

Impedanzbasierter zellulärer Assay zur Messung der Vielzahl von Infektionen mit Influenzaviren

Dieses Video beschreibt eine zelluläre Impedanz-basierte Technik, um die Überlebenskinetik von Viren zu untersuchen, die zytopathische Effekte induzieren. Die Methode misst die elektrische Impedanz von virusinfizierten adhärenten Zellen, die mit Kochsalzlösung vorbehandelt wurden.

Zellulärer impedanzbasierter Überlebenskinetik-Assay zur Beurteilung des Überlebens von Viren

Wir präsentieren ein Protokoll, das eine semiquantitative Methode zur Messung sowohl der Bindung von Influenza-A-Viren an A549-Zellen als auch der Internalisierung von Viruspartikeln in die Zielzellen durch Durchflusszytometrie beschreibt.

Mess Bindung und Internalisierung von Influenza A-Virus in A549-Zellen mittels Durchflusszytometrie

Diese Studie beschreibt ein   Imaging-basierte Mikroneutralisationstest auf die antigenen Beziehungen zwischen Viren zu analysieren. Das Protokoll verwendet einen Flachbettscanner und hat vier Schritte, einschließlich der Titration Titration Quantifizierung, Neutralisierung und Neutralisierung Quantifizierung. Der Test funktioniert gut mit aktuellen zirkulierenden Influenza A (H1N1) pdm09, A (H3N2) und B-Viren.

Optimierung eines Assay Quantitative Mikroneutralisations

Beschrieben ist eine Methodik, die Expression von Genen 96 quantitate und 18 Oberflächenproteine von einzelnen Zellen Ex Vivo, ermöglicht die Identifizierung von differenziell ausgedrückt, Genen und Proteinen in Virus-infizierten Zellen im Verhältnis zu nicht infizierten Zellen. Wir wenden das Konzept Studie SIV-infizierten CD4+ T Zellen isoliert von Rhesus-Makaken.

Einzellige Quantifizierung der mRNA und Oberfläche Protein-Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infizierten CD4+ T Zellen isoliert von Rhesus-Makaken

Influenza-A-Viren (IAVs) sind ansteckende Atemwegserreger, die jährliche Epidemien und gelegentliche Pandemien verursachen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Verfolgung viraler Infektionen in vivo mit einer neuartigen rekombinanten Luziferase und fluoreszenz-exzierenden Bi-Reporter IAV (BIRFLU). Dieser Ansatz bietet Forschern ein ausgezeichnetes Werkzeug, um IAV in vivo zu studieren.

Ein luziferasefluoreszierendes Reporter-Influenzavirus zur Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen

Hier wird ein Protokoll für einen Fluoreszenzbildgebungsansatz vorgestellt, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), eine Methode, die in der Lage ist, gleichzeitig Fluoreszenz-Einzelzellvisualisierung von viralen Proteinen und Nukleinsäuren unterschiedlicher Art und Strandung zu visualisieren. Dieser Ansatz kann auf eine Vielzahl von Systemen angewendet werden.

Einzelzell-Multiplex-Fluoreszenzbildgebung zur Visualisierung viraler Nukleinsäuren und Proteine und zur Überwachung von HIV-, HTLV-, HBV-, HCV-, Zika-Virus- und Influenza-Infektionen

Die aktuelle Studie beschreibt ein Protokoll zur Überwachung der Veränderungen in humanen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) während einer Virusinfektion mit Hilfe eines Echtzeit-Zellanalysesystems (RTCA).

Überwachung von Veränderungen in menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen nach Virusinfektion mittels impedanzbasierter Echtzeit-Zellanalyse

Der hier berichtete TCID50-Test nutzt beschriftungsfreie Echtzeitimpedanzmessungen und das Virologiemodul des Systems, um virusinduzierte zytopathische Effekte (CPE) objektiv in Echtzeit zu überwachen. Dieser optimierte Assay reduziert die praktische Erfahrung erheblich, unterstützt gleichzeitig hochdurchgängige, quantitative kinetische CPE-Messungen und ermöglicht automatisierte, Echtzeit-TCID50-Berechnungen.

Ein stromlinienförmiger, etikettenfreier, Echtzeit-50%-Gewebekultur-Infektionsdosen-Assay (TCID50) unter Verwendung von Impedanz zur automatisierten Quantifizierung viraler Titer-Quantifizierung

Erfahren Sie die Echtzeit-Zellanalyse zur Überwachung von Influenzaviren außerhalb des Wirts. Diese Methode ermöglicht präzise Quantifizierung infektiöser Partikel und ersetzt aufwendige Endpunktanalysen.

Überwachung des Überlebens von Influenzaviren außerhalb des Wirts mithilfe der Echtzeit-Zellanalyse

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