Verwendung von Caenorhabditis elegans zum Screening auf gewebespezifische Chaperon-Interaktionen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments in genetisch rückverfolgbaren Caenorhabditis elegans ist es, gewebespezifische Chaperon-Wechselwirkungen zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einfach zu handhabende Assays wie die Anpassung der Golan-KI und Verhaltensmessungen kombiniert, um neuartige gewebespezifische Wechselwirkungen aufzudecken. Für eine stressfreie Embryosynchronisation verwenden Sie einen Wurmpicker, um etwa 100 Eier von einer nicht synchronisierten Wurmplatte auf eine neu eingesetzte NGM-Platte zu bewegen und die Tiere gemäß dem entsprechenden Versuchsplan zu kultivieren.

Wenn die Tiere den ersten Tag der Eiablage erreichen, geben Sie langsam einen Milliliter M9-Puffer in die Platte, die sich vom Bakterienrasen entfernt befindet, und drehen Sie die Platte so, dass der Puffer die Platte vollständig bedeckt. Kippen Sie die Platte zur Seite, um die Flüssigkeit zu entfernen und die Tiere von der Platte zu waschen. Wenn alle Würmer von der Platte gewaschen wurden, schneide mit einer Standard-Pipettenspitze aus Plastik ein Quadrat Agar um die Stelle, an der die Eier konzentriert sind, und lege das Stück Agar auf eine neu eingesetzte NGM-Platte.

Kultivieren Sie die Eier unter den gleichen Kulturbedingungen. Am Ende der Inkubation sollte die Platte mit synchronisierten Eiern bedeckt sein. Nachdem Sie alle Tiere wie gerade gezeigt von der Platte gewaschen haben, fügen Sie einen Milliliter frischen M9-Puffer hinzu und verwenden Sie einen Zellschaber, um die Eier von der Platte zu lösen.

Wenn alle Eier abgetrennt wurden, wird das gesamte Puffervolumen von der Platte in ein konisches Röhrchen zur Zentrifugation überführt. Das Röhrchen zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, geben Sie bis zu einem Milliliter frischen M9-Puffer auf die Platte und pipettieren Sie, um die Eier wieder zu suspendieren.

Waschen Sie die Eier noch fünfmal wie gerade gezeigt. Nach der letzten Wäsche sollte das Eipellet weiß erscheinen und alle bis auf die letzten 200 Mikroliter Überstand können entfernt werden. Um synchronisierte Nematoden für ein Experiment zu kultivieren, legen Sie einen Tropfen von etwa 30 Eiern in der Nähe des Bakterienrasens und jede Interferenz-RNA-Sitzplatte und etwa 30 Eier auf eine Platte, auf der ein leerer Vektor sitzt, der Bakterien enthält.

Anschließend kultivieren Sie die Tiere unter den entsprechenden Kulturbedingungen gemäß dem Versuchsprotokoll. Um die embryonale Letalität der synchronisierten Tiere zu beurteilen, werden bei Beginn der Eiablage etwa 100 Eier auf einen leeren Teller gelegt und die Eier in Reihen verteilt, um die Zählung zu vereinfachen. Nach 24 bis 48 Stunden wird der Prozentsatz der nicht geschlüpften Eier bewertet.

Vergleichen Sie als Referenz die experimentellen tierischen Eier mit den Eiern von Tieren, die mit leeren Vektor-Kontrollbakterien behandelt wurden. Um einen Lähmungstest einzurichten, kultivieren Sie alterssynchronisierte Tiere mit Kontrollbakterien mit leeren Vektoren, bis die Tiere das Erwachsenenalter erreichen, aber bevor die Eiablage beginnt. Zeichnen Sie mit einem feinen Marker eine Linie auf die Rückseite einer normalen NGM-Agar-Platte und platzieren Sie fünf bis zehn Tiere auf der markierten Linie.

Stellen Sie einen Timer auf 10 Minuten und bewerten Sie den Prozentsatz der Tiere, die als gelähmte Würmer an der Leine verbleiben. Vergleichen Sie diese Daten mit dem Prozentsatz der mutierten Tiere, die auf Kontrollbakterien mit leeren Vektoren gezüchtet wurden. Für die Protein-Knockdown-Validierung legen Sie 250 bis 300 synchronisierte Eier auf eine 60-Millimeter-NGM-Interferenz-RNA-Platte, auf der die entsprechende doppelsträngige RNA exprimierende oder leere vektorhaltige Bakterien sitzt, und kultivieren Sie die Eier für den entsprechenden Versuchszeitraum.

Am Ende der Inkubation werden insgesamt 200 junge erwachsene Tiere in den Deckel eines 1,5-Milliliter-Röhrchens mit 200 Mikrolitern PBST umgefüllt, das bei der Anbautemperatur der Tiere gehalten wird. Schließen Sie die Kappe vorsichtig und zentrifugieren Sie die Tiere 1 Minute lang bei 1000 mal G. Am Ende der Zentrifugation gibst du 800 Mikroliter frisches PBST in das Röhrchen und zentrifugierst die Würmer erneut.

Entfernen Sie vorsichtig die oberen 900 Mikroliter des Überstands und waschen Sie die Nematoden noch 3 Mal in frischem PBST, wie gerade gezeigt. Nach der letzten Wäsche werden alle bis auf die letzten 100 Mikroliter des Überstands entfernt und den Tieren 25 Mikroliter 5X Probenpuffer zugesetzt. Erhitzen Sie die Proben 10 Minuten lang bei 92 Grad Celsius und 1000 Umdrehungen pro Minute, bevor Sie 20 Mikroliter jeder Probe auf ein SDS-Seitengel laden.

Führen Sie dann eine Western-Blot-Analyse mit den entsprechenden Antikörpern durch, um die relative Stabilität des interessierenden Proteins zu bestimmen, und verwenden Sie eine densitometrische Software, um die Intensität der Verbote zu bestimmen. Während der Entwicklung abgeschaltetes HSP6 führt bei Wildtyp-Tieren zu einem starken Entwicklungsstillstand. Gleichzeitig führt HSP6, das in einem muskelspezifischen Interferenz-RNA-Stamm, der Wildtyp-RDE1 im Muskelgewebe exprimiert, abgeschaltet wird, nicht zu einem Entwicklungsstillstand.

Während HSP6 einen darmspezifischen RNAI-Stamm ausschaltet, der den Wildtyp RDE1 in Darmzellen exprimiert, führt dies zu einem starken Entwicklungsstillstand und Phänotyp. Eine Mutation in HSP6 MG585, die eine leichte Wachstumsverzögerung verursacht, kann daher verwendet werden, um auf verschlimmernde oder lindernde Chaperon-Wechselwirkungen zu screenen, indem ein Stamm, der dieses mutierte Gen trägt, mit einem darmspezifischen Interferenz-RNA-Stamm gekreuzt und die Chaperon-Interferenz-RNA-Bibliothek gescreent wird. Die Organisation von Myosin- und UNC45-Mutanten, die mit STI1-, AHSA1- oder DAF41-Interferenz-RNA behandelt wurden, ähnelt der von Wildtyp-Würmern im vierten Larvenstadium.

Obwohl die Mutanten nach Erreichen des Erwachsenenalters gestörte Sarkomere aufweisen. Im Gegensatz dazu bleiben sowohl UNC45-mutierte Tiere, die mit einer leeren Vektorkontrolle behandelt wurden, als auch Wildtyp-Tiere nicht betroffen. Genetische Wechselwirkungen sind kein Hinweis auf eine physische Interaktion.

Daher müssen Folgeexperimente mit einem genetischen Interaktionsscreen durchgeführt werden, um die Art der identifizierten Interaktionen zu validieren und direkt zu untersuchen.