Klickchemischer fluorometrischer Assay für Apolipoprotein-N-Acyltransferase von der Enzymcharakterisierung bis zum Hochdurchsatz-Screening

Dieses Protokoll befasst sich mit zwei wichtigen Aspekten, der Charakterisierung einer essentiellen integralen Membran, der Apolipoprotein-Acyltransferase von Bakterien, und der Entwicklung des Assays im HDS-Format zum Screening auf Inhibitoren des Enzyms. Die Methode ist sehr sensitiv und eignet sich für Screening-Zwecke. Es kann zur Entwicklung potenzieller neuartiger Antibiotika beitragen.

Dieses Video wird dazu beitragen, kritische Schritte dieses Protokolls zu verdeutlichen, wie z. B. Mischen, Vortexen, Beschallen bei der Arbeit mit inhomogenen lipid- und detergenzienhaltigen Suspensionen. Karine Nozeret und Aurelia Pernin, beide sind Stipendiaten in meiner Gruppe, werden das Verfahren vorführen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Reagenzmischung für den Apolipoprotein- und Acyltransferase- oder LNT-Assay.

Mischen Sie Alkin, POPE und FSL-1-Biotin mit LNT-Reaktionspuffer in 1,5-Milliliter-Röhrchen bei einem Endvolumen von 18 Mikrolitern. Bereiten Sie dreifache Reagenzienmischungen für alle getesteten Bedingungen vor. Beschallen Sie die Reagenzienmischungen drei Minuten lang in einem Ultraschall-Wasserbad und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Geben Sie dann aktives oder inaktives LNT bis zu einer Endkonzentration von einem Nanogramm pro Mikroliter hinzu und pipettieren Sie zum Mischen auf und ab. Inkubieren Sie die Reaktion 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem thermischen Mischer mit beheiztem Deckel. Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine Stammlösung von zwei Milligramm pro Milliliter Streptavidin vor.

Und verdünnen Sie es auf 10 Mikrogramm pro Milliliter, um eine Arbeitslösung zu erhalten. Geben Sie 100 Mikroliter der Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Dann trocknen Sie die Vertiefungen über Nacht an der Luft, indem Sie die Platte bei 37 Grad Celsius ohne Deckel inkubieren.

Bereiten Sie am nächsten Tag Stammlösungen von fünf millimolaren Azido-FAM, 50 millimolaren TCEP, zwei millimolaren TBTA und 50 millimolaren Kupfersulfat-Pentahydrat vor. Führen Sie eine Click-Chemie durch, indem Sie 0,2 Mikroliter Azido-FAM, 0,4 Mikroliter TCEP und 0,2 Mikroliter TBTA zu den 1,5-Milliliter-LNT-Reaktionsröhrchen hinzufügen. Wirbeln Sie die Lösung fünf Sekunden lang vor.

Fügen Sie dann 0,4 Mikroliter Kupfersulfat hinzu. Weitere fünf Sekunden vortexen und die Reaktion eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Während die Click-Chemie-Mischung inkubiert, waschen Sie die Vertiefungen der mit Streptavidin beschichteten Platten dreimal mit 200 Mikrolitern PBST1.

Übertragen Sie 18 Mikroliter der Click-Chemie-Mischung in eine mit Streptavidin beschichtete Vertiefung und fügen Sie 100 Mikroliter PBST1 hinzu, um das N-Acyl-FSL-1-biotin FAM-Produkt an die Platte zu binden. Geben Sie Biotinfluorescein als Positivkontrolle für die Streptavidin-Bindung und die Fluoreszenzauslesung in die Platte. Dann inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln und schütteln Sie sie bei 300 U/min.

Nach der Inkubation waschen Sie die Platte mit einer elektronischen Mehrkanalpipette sechsmal manuell mit 200 Mikrolitern PBST2. Spülen Sie es dreimal mit der Pipette. Waschen Sie es dreimal mit 200 Mikrolitern PBS und spülen Sie es noch dreimal aus.

Geben Sie 200 Mikroliter PBS in jede Vertiefung und weisen Sie die Fluoreszenz bei 520 Nanometern in einem Mikroplatten-Reader nach. Speichern Sie alle Ergebnisse in einer Tabelle und berechnen Sie dann die Standardabweichung für jede Reaktion sowie die P-Werte für Negativkontrollen und positive Proben mit einem ungepaarten T-Test. Der hier beschriebene in vitro LNT-Assay verwendet Phospholipide, die eine Alkinfettsäure und FSL-1-Biotin als Substrate enthalten, um Alkin FSL-1-Biotin zu bilden.

Nach einer Click-Chemie-Reaktion mit Azido-FAM wird dieses Produkt fluoreszenzmarkiert und kann durch Fluoreszenzspektrometrie nachgewiesen werden. Die Reaktionsbedingungen wurden für eine maximale Fluoreszenzauslesung bei 520 Nanometern optimiert. Zu den Negativkontrollen gehörten Reaktionen ohne Enzym, mit einer inaktiven Variante des Enzyms oder mit dem Thiol-spezifischen Inhibitor MTSES.

Biotinfluorescein wurde als interne Kontrolle für ein maximales Fluoreszenzsignal verwendet. Um einen Hochdurchsatz-Screening-Assay zu entwickeln, wurden die Reaktionen direkt in 384-Well-Platten durchgeführt. Die Waschschritte wurden automatisiert und die Menge der Reagenzien reduziert.

Die Reaktion war empfindlich und reproduzierbar mit einem signifikanten Unterschied im Fluoreszenzsignal zwischen der Negativkontrolle und dem aktiven Enzym. Für das Hochdurchsatz-Screening bestimmt der Z-Primfaktor, ob eine Reaktion in einem Assay groß genug für Screening-Zwecke ist. Der durchschnittliche Z-Primefaktor lag bei mehr als 0,6 für den LNT-Assay, der in einem 384-Well-Format durchgeführt wurde, was darauf hindeutet, dass er hervorragend war.

Der Röhrchenassay in diesem Video wurde in einem Multi-Platten-Format entwickelt, das mit HDS kompatibel ist. Es kann verwendet werden, um andere Acyltransferasen aus einer Vielzahl von Organismen zu untersuchen.