Name: Klickchemischer fluorometrischer Assay für Apolipoprotein-N-Acyltransferase von der Enzymcharakterisierung bis zum Hochdurchsatz-Screening (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Lernen Sie einen fluorometrischen Klickchemie-Assay zur Charakterisierung der Apolipoprotein-N-Acyltransferase und zum Hochdurchsatz-Screening von Enzyminhibitoren für die Antibiotikaentwicklung.

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Wir danken Fabrice Agou und Alix Boucharlat von der Chemogenomic and Biological Screening Platform, Center for Technological Resources and Research (C2RT) am Institut Pasteur Paris für hilfreiche Vorschläge zum Protokoll, allen Mitgliedern der BGPB-Einheit für Unterstützung und wissenschaftliche Diskussionen und Simon Legood für die kritische Lektüre des Manuskripts. Die Arbeit wurde von Global Care Initiatives des Instituts Carnot Infektionskrankheiten und des Instituts Carnot Microbes and Health finanziert (15 CARN 0017-01 und 16 CARN 0023-01).

1. Enzym- und Substratzubereitung
<ol><li>Reinigung von Enzymen
	<ol><li>Herstellung und Reinigung des Lnt-Enzyms aus waschmittellöslichen Membranen, wie zuvor beschrieben 4,8. Kurz gesagt, induzieren Sie die Expression des lnt-Strep-Gens, das Lnt mit einem C-terminalen Streptokokken-Tag kodiert, bei OD 600 von 0,6 mit wasserfreiem Tetracyclin (200 ng / ml) bei 37 °C für 16 h.</li>
		<li>Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 4.000 x g für 10 min und verwerfen Sie den Überstand.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet im Puffer WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) auf 100 OD600 Einheiten pro ml.</li>
		<li>Brechen Sie die Zellen durch zwei Durchgänge durch eine französische Druckzellenpresse bei 10.000 psi.</li>
		<li>Entfernen Sie ungebrochene Zellen und Ablagerungen durch Zentrifugieren bei 13.000 x g für 20 min. Bewahren Sie den Überstand auf und entsorgen Sie das Pellet.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie den Überstand bei 120.000 x g für 60 min und sammeln Sie die Membranvesikel (durchscheinendes braun gefärbtes Pellet). Verwerfen Sie den Überstand.</li>
		<li>Lösen Sie die integralen Membranproteine aus dem Membranpellet mit 1% (w/v) n-Dodecyl β-D-Maltosid (DDM) im Puffer WA für 30 min bei Raumtemperatur (RT). Zentrifugieren und entfernen Sie unlösliches Material bei 120.000 x g für 30 min. Verwenden Sie die überstehende Fraktion zur Reinigung.</li>
		<li>Lnt-Streptokokken auf einer Affinitätschromatographiesäule (siehe Materialtabelle) und einer S400-Gelfiltrationssäule (siehe Materialtabelle) reinigen, wie von Nozeret et al.8 beschrieben.</li>
		<li>Lagern Sie das gereinigte Enzym im Puffer WA mit 0,05% DDM und 10% Glycerin bei -80 °C. HINWEIS: Das Enzym ist über 5 Jahre stabil.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung von Alkin-Phospholipid- und biotinylierten Fibroblasten-stimulierenden Liganden (FSL-1-biotin) Substraten
	<ol><li>Aliquot 100 μL kundenspezifisch synthetisiertes Alkin-POPE (1-Hexadec-15-ynoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin, siehe Tabelle der Materialien), in Chloroform in 1,5 ml Röhrchen gelöst.</li>
		<li>Durchstechen Sie die Röhrchen mit einer Spritze und verdampfen Sie das Chloroform in einem Speed-Vac bei RT für 2 h. Lagern Sie die trockenen Phospholipidproben bei -20 °C.</li>
		<li>Alkin-POPE vor Gebrauch in 0,1% Triton X-100 bei 500 μM auflösen. Fügen Sie einen 3-minütigen Ultraschallschritt in einem Ultraschall-Wasserbad bei RT hinzu, um Alkin-POPE bei Bedarf zu lösen.</li>
		<li>FSL-1-Biotin in Wasser bei 445 μM resuspendieren. HINWEIS: Beide Lösungen können mindestens 2 Monate bei -20 °C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Röhrchen-Assay
HINWEIS: Stellen Sie an Tag 1 die Lnt-Reaktion in 1,5-ml-Röhrchen ein (Schritt 2.1) und beschichten Sie 96 Well-Platten mit Streptavidin (Schritt 2.2).
<ol><li>Herstellung der Reagenzmischung und enzymatische Reaktion
	<ol><li>Für einen Standard-Lnt-Assay mischen Sie Alkin-POPE (endgültige 50 μM aus 500 μM-Vorrat) und FSL-1-Biotin (Endkonzentration von 50 μM aus einem 445 μM-Vorrat) in Lnt-Reaktionspuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 mit 1% BSA) bei einem Endvolumen von 18 μL in 1,5-ml-Röhrchen. Führen Sie alle Bedingungen in dreifacher Ausfertigung durch.</li>
		<li>Die Substratmischung (hergestellt in Schritt 2.1.1) wird 3 min lang in einem Ultraschall-Wasserbad beschallt und vor der Zugabe des Enzyms Lnt bei 37 °C 5 min inkubiert (Schritt 2.1.3). HINWEIS: MTSES (Natrium(2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonat), ein thiolspezifisches Reagenz, hemmtLnt 8. 10 mM MTSES (100 mM Stammlösung in 100% DMSO) in die Reaktionsröhrchen geben (Schritt 2.1.1), die als Negativkontrollproben verwendet werden sollen. Stellen Sie das Volumen des Lnt-Reaktionspuffers so ein, dass das Gesamtvolumen 18 μL beträgt.</li>
		<li>Fügen Sie aktives (1 ng/μL, entsprechend 17,2 nM) oder inaktives Lnt (C387S) (2 μL 10 ng/μL Vorrat im Puffer WA mit 0,05% DDM) hinzu und mischen Sie es mit den Substraten (Schritt 2.1.2) durch Pipettieren auf und ab.</li>
		<li>Die Reaktion wird bei 37 °C für 16 h in einem Thermomixer mit beheiztem Deckel inkubiert.</li>
	</ol></li>
	<li>Streptavidin-Beschichtung von 96 Well-Platten
	<ol><li>Bereiten Sie eine Stammlösung von Streptavidin bei 2 mg/ml inH2Ovor. HINWEIS: Diese Lösung kann bis zu 6 Monate bei -20 °C gelagert werden.</li>
		<li>Aus der Stammlösung 10 μg/ml Streptavidin in Wasser als Arbeitslösung herstellen. Geben Sie 100 μL der Lösung in jede Vertiefung der 96-Well-Platte. Binden Sie Streptavidin an die Platte, indem Sie bei 37 °C über Nacht ohne Deckel inkubieren, um die Vertiefungen an der Luft zu trocknen.</li>
	</ol></li>
</ol>HINWEIS: Führen Sie an Tag 2 eine Klickchemie durch (Schritt 2.3), binden Sie die Lnt-Reaktionsmischung an Streptavidin-beschichtete Platten (Schritt 2.4), detektieren Sie Fluoreszenz und analysieren Sie die Ergebnisse (Schritt 2.5).
<ol start="3"><li>Klickchemische Reaktion
	<ol><li>Stammlösungen von Azido-FAM (5 mM in DMSO), TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid; 50 mM in Wasser hergestellt), TBTA (Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amin; 2 mM in tert-Butanol:DMSO (4:1)) und CuSO4∙5H2O(50 mM frisch zubereitet inH2O).</li>
		<li>In den 1,5-ml-Röhrchen, die das in Schritt 2.1.4 hergestellte Lnt-Reaktionsgemisch enthalten, wird eine Klickchemie durchgeführt, indem die Reagenzien in der folgenden Reihenfolge hinzugefügt werden: 0,2 μL Stamm Azido-FAM (Endkonzentration 50 μM), 0,4 μL Stamm-TCEP (Endkonzentration 1 mM), 0,2 μL Stamm-TBTA (Endkonzentration 0,02 mM).</li>
		<li>Vortex die Lösung für 5 s. Dann fügen Sie 0,4 μL CuSO4 (Endkonzentration 1 mM) hinzu. Vortex wieder für 5 s. Inkubieren Sie die Proben im Dunkeln bei RT für 1 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Bindung von Lnt-Reaktionsgemisch an Streptavidin-beschichtete Platten
	<ol><li>Die Vertiefungen der mit Streptavidin beschichteten Platten werden nach der nächtlichen Inkubation aus Schritt 2.2.2 3x mit 200 μL PBS-T1 (PBS enthält 0,05% Tween-20) gewaschen. HINWEIS: Streptavidinplatten können sofort verwendet oder trocken bei 4 °C gelagert werden.</li>
		<li>18 μL aus dem Klick-Chemie-Gemisch aus Schritt 2.3.3 in eine Vertiefung in eine 96-Well-Streptavidin-beschichtete Platte überführen und 100 μL PBS-T1 zugeben, um N-Acyl-FSL-1-biotin-FAM-Produkt an Streptavidinplatten zu binden.</li>
		<li>Verwenden Sie Biotin-Fluorescein (0,26 μM aus einem 3,1 mM-Bestand in DMSO) als Positivkontrolle für die Streptavidinbindung und Fluoreszenzauslesung.</li>
		<li>Die Platten bei RT für 1 h im Dunkeln in einem Thermomixer unter Schütteln bei 300 U/min inkubieren.</li>
		<li>Führen Sie manuelle Waschschritte der 96 Well-Platten mit einer elektronischen Mehrkanalpipette wie folgt durch: sechs Waschgänge mit 200 μL PBS-T2 (PBS enthält 1% Tween-20), drei Spülungen mit einer Pipette, drei Spülungen mit 200 μL PBS, drei Spülungen mit einer Pipette.</li>
	</ol></li>
	<li>Fluoreszenzdetektion und -analyse
	<ol><li>Fügen Sie 200 μL PBS hinzu und zeichnen Sie die Fluoreszenz bei 520 nm in einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader auf. Speichern Sie die Ergebnisse in einer Tabellenkalkulationssoftware. HINWEIS: Biotin-Fluorescein wird als Positivkontrolle für die Streptavidinbindung und Fluoreszenzdetektion bei 520 nm verwendet. Es wird ein reproduzierbarer Messwert von 30.000–40.000 A.E. mit 0,26 μM Biotin-Fluorescein erwartet. Alle Proben werden in dreifacher Ausfertigung analysiert, einschließlich Kontrollen.</li>
		<li>Berechnen Sie die Standardabweichung für jede Reaktion und berechnen Sie die P-Werte für Negativkontrollen und positive Proben unter Verwendung eines ungepaarten t-Tests unter Verwendung einer statistischen Software.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Multiwell-Plattentest
HINWEIS: An Tag 1 die Lnt-Reaktion in 384 Well-Platten (Schritt 3.1) einrichten und 384 Well-Platten mit Streptavidin beschichten (Schritt 3.2).
<ol><li>Herstellung der Reagenzmischung und enzymatische Reaktion HINWEIS: Die Menge der Reagenzien und des Enzyms ist im Vergleich zum Röhrchentest reduziert und die Lnt-Reaktion wird direkt in 384 Well-Platten durchgeführt. Dies ermöglicht den Einsatz von weniger Material und eine Reduzierung der Schritte, die weiter automatisiert werden können.<ol><li>Mischen Sie die Substrate wie folgt: Alkin-POPE (Endkonzentration 50 μM aus 500 μM Stoff) und FSL-1-Biotin (endgültige 50 μM aus 500 μM Vorrat) in Lnt-Reaktionspuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 mit 1% BSA) bei einem Volumen von 13,5 μL pro Reaktion pro Vertiefung in einem 384-Well-Plattenformat. Führen Sie alle Bedingungen in dreifacher Ausfertigung durch. Berechnen Sie die Gesamtmenge an Reagenzien, die für die Anzahl der durchzuführenden Reaktionen erforderlich ist (d. h. 5.184 μL für eine 384-Well-Platte).</li>
		<li>Beschallen Sie die Substratmischung für 3 min in einem Ultraschall-Wasserbad.</li>
		<li>Aliquot 13,5 μL der Substratmischung pro Vertiefung in einer 384-Well-Platte. HINWEIS: Als Negativkontrolle können 10 mM MTSES (625 mM Stammlösung in 100% DMSO) pro Vertiefung hinzugefügt werden. Stellen Sie das Volumen des Lnt-Puffers ein (Schritt 3.1.1), um ein endgültiges Reaktionsvolumen von 13,5 μL zu erreichen.</li>
		<li>Vor der Zugabe des Enzyms Lnt bei 37 °C 5 min inkubieren (Schritt 3.1.5).</li>
		<li>0,5 ng/μL (entsprechend 8,6 nM) aktives Lnt-Enzym oder inaktive Variante (C387S) (1,5 μL aus 5 ng/μL Bestand im Puffer WA mit 0,05% DDM) in Lnt-Reaktionspuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 1% BSA) in jede Vertiefung geben, die das Reaktionsgemisch aus Schritt 3.1.3 enthält. Mischen Sie Reagenzien, indem Sie auf und ab pipettieren. Das Gesamtreaktionsvolumen beträgt 15 μL.</li>
		<li>Versiegeln Sie die Platte mit Kunststofffolie für Multiwell-Platten.</li>
		<li>Bei 37 °C für 16 h in einem Thermomischer mit beheiztem Deckel inkubieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Streptavidin beschichtet 384 Well-Platten<ol><li>Verwenden Sie 75 μL Streptavidin (10 μg/ml inH2O) aus Schritt 2.2.2, um Vertiefungen einer 384-Well-Platte zu beschichten. Lassen Sie Streptavidin an die Platte binden, indem Sie bei 37 °C über Nacht ohne Deckel inkubieren, um die Vertiefungen an der Luft zu trocknen.</li>
	</ol></li>
</ol>HINWEIS: Führen Sie an Tag 2 eine Klickchemie durch (Schritt 3.3), binden Sie die Lnt-Reaktionsmischung an Streptavidin-beschichtete Platten (Schritt 3.4), erkennen Sie Fluoreszenz und analysieren Sie die Ergebnisse (Schritt 3.5).
<ol start="3"><li>Klickchemische Reaktion<ol><li>Stammlösungen von Azido-FAM (1,2 mM in DMSO), TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid; 24 mM hergestellt in H2O), TBTA (Tris[(1-Benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amin; 0,48 mM in tert-Butanol:DMSO (4:1)) und CuSO4∙5H2O(24 mM frisch zubereitet inH2O).</li>
		<li>Kombinieren Sie die drei Klickchemie-Reagenzien: eine Mischung aus Azido-FAM (Endkonzentration 50 μM), TCEP (1 mM final) und TBTA (0,02 mM final), jeweils bei 0,75 μL im Endvolumen von 2,25 μL pro Well. Berechnen Sie das erforderliche Volumen pro 384-Well-Platte (d. h. verwenden Sie 864 μL, wenn alle Wells der 384-Well-Platte verwendet werden). Kräftig mischen.</li>
		<li>2,25 μl der Reagenzlösung pro Vertiefung direkt in die fertige Lnt-Reaktion in der 384-Well-Platte aus Schritt 3.1.7 geben.</li>
		<li>Mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren mit einer elektronischen Mehrkanalpipette.</li>
		<li>CuSO4 (0,75 μL aus 24 mM Bestand für eine Endkonzentration von 1 mM) hinzufügen und durch Pipettieren mit einer elektronischen Mehrkanalpipette auf und ab mischen.</li>
		<li>Bei RT für 1 h im Dunkeln inkubieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Bindung des Lnt-Reaktionsgemisches an Streptavidin-beschichtete 384-Well-Platten
	<ol><li>Die Vertiefungen der Streptavidin-beschichteten Platten nach der nächtlichen Inkubation ab Schritt 3.2.1 1x mit 85 μL PBS-T1 waschen.</li>
		<li>11 μL der Klickchemiereaktion aus jeder Vertiefung der Inkubationsplatte aus Schritt 3.3.6 auf die mit Streptavidin beschichtete Platte aus Schritt 3.4.1 übertragen, um das N-Acyl-FSL-1-biotin-FAM-Produkt an die Streptavidinplatten zu binden.</li>
		<li>Fügen Sie 64 μL Puffer PBS-T1 hinzu.</li>
		<li>Biotin-Fluorescein (0,19 μM aus einem 3,1 mM-Bestand in DMSO) als Kontrolle für die Bindung an Streptavidin-beschichtete Vertiefungen enthalten.</li>
		<li>Die 384 Well-Platten bei RT für 1 h im Dunkeln in einem Thermomixer inkubieren und bei 300 U/min schütteln.</li>
		<li>Waschen Sie die Platten mit einer automatischen Plattenwaschanlage wie folgt: 10 Wäschen mit 85 μL PBS-T2, Platten werden zwischen den Wäschen geschüttelt; 5 Wäschen mit 85 μL PBS, Platten werden zwischen den Wäschen geschüttelt.</li>
	</ol></li>
	<li>Fluoreszenzdetektion und -analyse
	<ol><li>Fügen Sie PBS (85 μL) hinzu und zeichnen Sie die Fluoreszenz in einem Fluoreszenz-Mikroplattenleser bei 535 nm auf.</li>
		<li>Analysieren Sie die Daten wie beschrieben (Schritt 2.5.2).</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das hier beschriebene Protokoll für den Lnt-Assay, basierend auf der Fluoreszenzdetektion des triacylierten Produkts, ist sensitiv und reproduzierbar. Die spezifische und effiziente Bindung von Biotin an Streptavidin ist ein Schlüsselelement des Assays. Alkin-POPE-Substrat, das nach Abschluss der Lnt-Reaktion übrig bleibt, wird ebenfalls fluoreszierend mit FAM markiert, aber nach der Bindung an die Streptavidinplatten durch mehrere Waschschritte effizient entfernt. Darüber hinaus hat die Zugabe von DMSO keinen Einfluss a...

Bakterielle Lipoproteine sind durch kovalent gebundene Fettsäuren an ihren Aminotermini gekennzeichnet, durch die sie in Membranenverankert sind 1,2. Der reife Teil des Proteins ist in Struktur und Funktion sehr vielfältig, was die Rolle von Lipoproteinen in verschiedenen biologischen Prozessen in der bakteriellen Zellhülle erklärt.
Lipoproteine werden durch Phospholipid-abgeleitete Fettsäuren nach dem Einbringen in die zytoplasmatische Membran modifiziert. Die Prolipoproteine enthalten ein Signaturmotiv, die Lipobox, die einen invarianten Cysteinrest enthält, der acyliert wird, und die erste Aminosäure im reifen Protein. Der erste Schritt dieses Weges wird durch Prolipoprotein Phosphatidylglycerol::d Iacylglyceryltransferase (Lgt) katalysiert, die die Diacylglycerylgruppe von Phosphatidylglycerol auf das Prolipoprotein über eine Thioetherverbindung zwischen Diacylglyceryl und Cystein überträgt. Die Signalpeptidase II (Lsp) spaltet das Signalpeptid vom Diacylglyceryl-Prolipoprotein, was zu einem Apolipoprotein führt, das durch seinen Diacylglycerylanteil in der Membran verankert ist. Der dritte und letzte Schritt wird durch Apolipoprotein N-Acyltransferase (Lnt) katalysiert, die eine Fettsäure aus der sn-1-Position des Phospholipids an Apolipoprotein hinzufügt, was zu triacyliertem reifem Lipoprotein führt (Abbildung 1)3. Die Lnt-Reaktion ist eine zweistufige Ping-Pong-Reaktion, bei der ein stabiles Thioester-Acylenzym-Zwischenprodukt gebildet wird. Das Lysophospholipid-Nebenprodukt wird vor der Acylierung des Apolipoproteinsubstrats im zweiten Schritt der Reaktion freigesetzt.
Die Phospholipidsubstratspezifität wird in einem Lnt-Assay basierend auf der Mobilitätsverschiebung des N-Acyldiacylglycerylpeptids auf einem hochprozentigen Tris-Tricin-Harnstoff SDS-PAGE4 bestimmt. Phospholipide mit kleinen polaren Kopfgruppen, gesättigt [sn-1] und nicht gesättigt [sn-2], waren bevorzugte Substrate4. Der Gelverschiebungstest eignet sich weder für umfangreiche kinetische Studien der Apolipoprotein-N-Acyltransferase noch für HTS zur Identifizierung hemmender Moleküle. Die Klickchemie unter Verwendung von Alkinfettsäuren wurde erfolgreich eingesetzt, um die Lipoproteinmodifikation in Bakterien5 und den Fettsäurestoffwechsel in Eukaryoten6 zu untersuchen. Vor kurzem wurde ein In-vitro-Assay der Ras-Palmitoylierung berichtet, um Inhibitoren zu identifizieren7.
Bei dem hier beschriebenen Verfahren wird gereinigtes aktives Lnt in Waschmittel mit Substraten in gemischten Mizellen inkubiert, um alkintriacyliertes Peptid zu bilden, das anschließend durch Fluoreszenzspektrometrie nachgewiesen wird.

<table><tbody><tr><td>&Auml; kta Purifier FPLC System</td><td>GE Healthcare</td><td>NA</td><td>Reinheit: NA Lnt Aufreinigung</td></tr><tr><td>Alkin-POPE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>900414P</td><td>Reinheit: >99% Lnt</td></tr><tr><td>Substrat Azido-FAM</td><td>Lumiprobe</td><td>A4130</td><td>Reinheit: 100% (rein) Click Reagenz</td></tr><tr><td>BioPhotometer Plus</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td>Reinheit: NA OD 600 nm</td></tr><tr><td>BioTek ELX 405 Select Tellerwaschmaschine</td><td>BioTek</td><td>N&deg; serie 115800, n&deg; Material 405 Select</td><td>Reinheit: NA Waschstufen</td></tr><tr><td>Biotin-Fluorescein</td><td>Sigma</td><td>53608</td><td>Reinheit: &ge; 90% Fluoreszenzkontrolle</td></tr><tr><td>Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat</td><td>Sigma</td><td>C3036</td><td>Reinheit: &ge; 98% Click-Reagenz</td></tr><tr><td>DDM</td><td>Anatrace</td><td>D310A</td><td>Reinheit: &ge; 99% &beta;+&alpha;; < 15% &alpha; Detergens für die Lnt-Reinigung</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Invitrogen</td><td>D12435</td><td>Reinheit: wasserfrei Auflösungsreagenz Klick-Reagenz</td></tr><tr><td>Elektronische Pipette Voyager 8 Kanäle 0,5-12,5 uL</td><td>INTEGRA</td><td>4721</td><td>Reinheit: NA Handhabung von Reagenzien</td></tr><tr><td>Französische Druckzelle</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Reinheit: NA Zellaufschluss</td></tr><tr><td>FSL-1-biotin</td><td>EMV-Mikrosammlungen</td><td>L7030</td><td>Reinheit: NA Lnt-Substrat</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One 384-Well-Standard CELLSTAR Polystyrol-Mikroplatte</td><td>Greiner</td><td>781091</td><td>Reinheit: NA Schwarz mit transparentem Boden (Ablesung nach oben oder unten)</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One 96-Well-Platte aus sterilem Polystyrol, hochbindend</td><td>Greiner</td><td>655097</td><td>Reinheit: NA Schwarz mit transparenter Unterseite (Ablesung nach oben oder unten)</td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader Infinite M1000 pro</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Reinheit: NA Fluoreszenzdetektion</td></tr><tr><td>MTSES (Natrium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonat)</td><td>Anatrace</td><td>S110MT</td><td>Reinheit: ~100% Thiol-spezifischer Inhibitor</td></tr><tr><td>Optisch klare selbstklebende Siegelfolien</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1170</td><td>Reinheit: NA Folie zum Versiegeln von Multi-Well-Platten</td></tr><tr><td>Sephacryl S400 HR 16/60 Gel Filtrationssäule</td><td>GE Healthcare</td><td>GE28-9356-04</td><td>Reinheit: NA Lnt-Reinigung</td></tr><tr><td>StrepTactin Sepharose 50 %</td><td>IBA Biotechnologie</td><td>2-1201-010</td><td>Reinheit: NA Lnt-Reinigung</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Sigma</td><td>S4762-1MG</td><td>Reinheit: &ge; 13 Einheiten/mg Protein Biotin-bindendes</td></tr><tr><td>TBTA (Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amin</td><td>Sigma</td><td>678937</td><td>Reinheit: 97% Click-Reagenz</td></tr><tr><td>TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>75259</td><td>Reinheit: &ge; 98% Click-Reagenz</td></tr><tr><td>TECAN Infinite F500</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Reinheit: NA Fluoreszenzdetektion</td></tr><tr><td>TECAN Infinite M1000 pro</td><td>Tecan</td><td>N/A</td><td>Reinheit: NA Fluoreszenzdetektion</td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Reinheit: NA Beheizter Deckel</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td>Reinheit: 10% in H2O Lnt Reaktionspuffer</td></tr><tr><td>Ultra Zentrifuge</td><td>Beckman LC</td><td>N/A</td><td>Reinheit: NA Zellfraktionierung</td></tr></tbody></table>

klickchemischer fluorometrischer assay für apolipoprotein-n-acyltransferase von der enzymcharakterisierung bis zum hochdurchsatz-screening

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Lipoproteine aus Proteobakterien werden posttranslational durch Fettsäuren modifiziert, die aus Membranphospholipiden durch die Wirkung von drei integralen Membranenzymen gewonnen werden, was zu triacylierten Proteinen führt. Der erste Schritt im Lipoproteinmodifikationsweg beinhaltet die Übertragung einer Diacylglycerylgruppe von Phosphatidylglycerol auf das Prolipoprotein, was zu Diacylglycerylprolipoprotein führt. Im zweiten Schritt wird das Signalpeptid des Prolipoproteins gespalten und bildet ein Apolipoprotein, das wiederum durch eine dritte Fettsäure aus einem Phospholipid modifiziert wird. Dieser letzte Schritt wird durch Apolipoprotein N-Acyltransferase (Lnt) katalysiert. Der Lipoprotein-Modifikationsweg ist in den meisten γ-Proteobakterien essentiell und damit ein potenzielles Ziel für die Entwicklung neuartiger antibakterieller Wirkstoffe. Hier wird ein sensitiver Assay für Lnt beschrieben, der mit dem Hochdurchsatz-Screening kleiner inhibitorischer Moleküle kompatibel ist. Das Enzym und die Substrate sind membraneingebettete Moleküle; Daher ist die Entwicklung eines In-vitro-Tests nicht einfach. Dazu gehören die Reinigung des aktiven Enzyms in Gegenwart von Detergens, die Verfügbarkeit von Alkin-Phospholipiden und Diacylglycerylpeptidsubstraten sowie die Reaktionsbedingungen in gemischten Mizellen. Um den Aktivitätstest in einem Hochdurchsatz-Screening (HTS) zu verwenden, wird außerdem das direkte Auslesen des Reaktionsprodukts gegenüber gekoppelten enzymatischen Reaktionen bevorzugt. In diesem fluorometrischen Enzymassay wird das alkintriacylierte Peptidprodukt durch eine Klickchemiereaktion fluoreszierend gemacht und in einem Multiwell-Plattenformat detektiert. Diese Methode ist auf andere Acyltransferasen anwendbar, die fettsäurehaltige Substrate verwenden, einschließlich Phospholipide und Acyl-CoA.

Bei der Lnt-Reaktion wird die sn-1-Fettsäure aus Phospholipiden auf ein Diacylglycerylpeptid übertragen, was zu reifem triacyliertem Peptid8 führt. Der hier beschriebene in vitro Lnt-Assay ist darauf ausgelegt, Phospholipide zu verwenden, die eine Alkinfettsäure (Alkin-POPE) und FSL-1-Biotin als Substrate enthalten, was zur Bildung von Alkin-FSL-1-Biotin führt. Bei einer Klickchemiereaktion mit Azido-FAM sollte dieses Produkt fluoreszierend markiert und mittels Fluoreszenzspektrometrie de...

Hier wird ein sensitiver Fluoreszenztest zur Überwachung der Apolipoprotein-N-Acyltransferase-Aktivität unter Verwendung von Diacylglycerylpeptid und Alkin-Phospholipiden als Substrate mit Klickchemie vorgestellt.

Klickchemischer fluorometrischer Assay für Apolipoprotein-N-Acyltransferase von der Enzymcharakterisierung bis zum Hochdurchsatz-Screening

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Dieses Protokoll befasst sich mit zwei wichtigen Aspekten, der Charakterisierung einer essentiellen integralen Membran, der Apolipoprotein-Acyltransferase von Bakterien, und der Entwicklung des Assays im HDS-Format zum Screening auf Inhibitoren des Enzyms. Die Methode ist sehr sensitiv und eignet sich für Screening-Zwecke. Es kann zur Entwicklung potenzieller neuartiger Antibiotika beitragen.Dieses Video wird dazu beitragen, kritische Schritte dieses Protokolls zu verdeutlichen, wie z. B. Mischen, Vortexen, Beschallen bei der Arbeit mit inhomogenen lipid- und detergenzienhaltigen Suspensionen. Karine Nozeret und Aurelia Pernin, beide sind Stipendiaten in meiner Gruppe, werden das Verfahren vorführen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Reagenzmischung für den Apolipoprotein- und Acyltransferase- oder LNT-Assay.Mischen Sie Alkin, POPE und FSL-1-Biotin mit LNT-Reaktionspuffer in 1,5-Milliliter-Röhrchen bei einem Endvolumen von 18 Mikrolitern. Bereiten Sie dreifache Reagenzienmischungen für alle getesteten Bedingungen vor. Beschallen Sie die Reagenzienmischungen drei Minuten lang in einem Ultraschall-Wasserbad und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Geben Sie dann aktives oder inaktives LNT bis zu einer Endkonzentration von einem Nanogramm pro Mikroliter hinzu und pipettieren Sie zum Mischen auf und ab. Inkubieren Sie die Reaktion 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem thermischen Mischer mit beheiztem Deckel. Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine Stammlösung von zwei Milligramm pro Milliliter Streptavidin vor.Und verdünnen Sie es auf 10 Mikrogramm pro Milliliter, um eine Arbeitslösung zu erhalten. Geben Sie 100 Mikroliter der Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Dann trocknen Sie die Vertiefungen über Nacht an der Luft, indem Sie die Platte bei 37 Grad Celsius ohne Deckel inkubieren.Bereiten Sie am nächsten Tag Stammlösungen von fünf millimolaren Azido-FAM, 50 millimolaren TCEP, zwei millimolaren TBTA und 50 millimolaren Kupfersulfat-Pentahydrat vor. Führen Sie eine Click-Chemie durch, indem Sie 0,2 Mikroliter Azido-FAM, 0,4 Mikroliter TCEP und 0,2 Mikroliter TBTA zu den 1,5-Milliliter-LNT-Reaktionsröhrchen hinzufügen. Wirbeln Sie die Lösung fünf Sekunden lang vor.Fügen Sie dann 0,4 Mikroliter Kupfersulfat hinzu. Weitere fünf Sekunden vortexen und die Reaktion eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Während die Click-Chemie-Mischung inkubiert, waschen Sie die Vertiefungen der mit Streptavidin beschichteten Platten dreimal mit 200 Mikrolitern PBST1.Übertragen Sie 18 Mikroliter der Click-Chemie-Mischung in eine mit Streptavidin beschichtete Vertiefung und fügen Sie 100 Mikroliter PBST1 hinzu, um das N-Acyl-FSL-1-biotin FAM-Produkt an die Platte zu binden. Geben Sie Biotinfluorescein als Positivkontrolle für die Streptavidin-Bindung und die Fluoreszenzauslesung in die Platte. Dann inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln und schütteln Sie sie bei 300 U/min.Nach der Inkubation waschen Sie die Platte mit einer elektronischen Mehrkanalpipette sechsmal manuell mit 200 Mikrolitern PBST2. Spülen Sie es dreimal mit der Pipette. Waschen Sie es dreimal mit 200 Mikrolitern PBS und spülen Sie es noch dreimal aus.Geben Sie 200 Mikroliter PBS in jede Vertiefung und weisen Sie die Fluoreszenz bei 520 Nanometern in einem Mikroplatten-Reader nach. Speichern Sie alle Ergebnisse in einer Tabelle und berechnen Sie dann die Standardabweichung für jede Reaktion sowie die P-Werte für Negativkontrollen und positive Proben mit einem ungepaarten T-Test. Der hier beschriebene in vitro LNT-Assay verwendet Phospholipide, die eine Alkinfettsäure und FSL-1-Biotin als Substrate enthalten, um Alkin FSL-1-Biotin zu bilden.Nach einer Click-Chemie-Reaktion mit Azido-FAM wird dieses Produkt fluoreszenzmarkiert und kann durch Fluoreszenzspektrometrie nachgewiesen werden. Die Reaktionsbedingungen wurden für eine maximale Fluoreszenzauslesung bei 520 Nanometern optimiert. Zu den Negativkontrollen gehörten Reaktionen ohne Enzym, mit einer inaktiven Variante des Enzyms oder mit dem Thiol-spezifischen Inhibitor MTSES.Biotinfluorescein wurde als interne Kontrolle für ein maximales Fluoreszenzsignal verwendet. Um einen Hochdurchsatz-Screening-Assay zu entwickeln, wurden die Reaktionen direkt in 384-Well-Platten durchgeführt. Die Waschschritte wurden automatisiert und die Menge der Reagenzien reduziert.Die Reaktion war empfindlich und reproduzierbar mit einem signifikanten Unterschied im Fluoreszenzsignal zwischen der Negativkontrolle und dem aktiven Enzym. Für das Hochdurchsatz-Screening bestimmt der Z-Primfaktor, ob eine Reaktion in einem Assay groß genug für Screening-Zwecke ist. Der durchschnittliche Z-Primefaktor lag bei mehr als 0,6 für den LNT-Assay, der in einem 384-Well-Format durchgeführt wurde, was darauf hindeutet, dass er hervorragend war.Der Röhrchenassay in diesem Video wurde in einem Multi-Platten-Format entwickelt, das mit HDS kompatibel ist. Es kann verwendet werden, um andere Acyltransferasen aus einer Vielzahl von Organismen zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Ein Protokoll für das Screening kleiner molekularer Wirkstoffe, das auf der In-situ-Synthese von ultrakleinen fluoreszierenden Gold-Nanoclustern (Au-NCs) unter Verwendung von wirkstoffbeladenen Proteinen als Template basiert, wird vorgestellt. Diese Methode ist einfach, um die Bindungsaffinität von Wirkstoffen an ein Zielprotein durch ein sichtbares Fluoreszenzsignal zu bestimmen, das von den Protein-Template-Au-NCs emittiert wird.

Eine schnelle und quantitative fluorimetrische Verfahren zur Protein-Targeting kleines Molekül als Wirkstoff-Screening

Diese Arbeit stellt eine Methode des Hochdurchsatz-Screenings unter Verwendung eines universellen genetischen Enzym-Screening-Systems vor, das theoretisch auf über 200 Enzyme angewendet werden kann. Dabei identifiziert das Single-Screening-System drei verschiedene Enzyme (Lipase, Cellulase und alkalische Phosphatase) durch einfaches Wechseln des verwendeten Substrats (p-Nitrophenylacetat, p-Nitrophenyl-β-D-Cellobiosid und Phenylphosphat).

Screening Multi-Enzym ein High-throughput Genetic Enzymscreening-System verwenden

Wir präsentieren eine Open-Source hohe Content-Analyse (HCA) Instrument unter Verwendung von automatisierten Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) zur Untersuchung von Protein-Interaktionen mit Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) basiert Ablesungen. Die Datenerfassung für dieses openFLIM-HCA Instrument wird von der Software in μManager geschrieben gesteuert und Datenanalyse wird in FLIMfit unternommen.

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Wir beschreiben hier ein fluorometrisch zellfreie biochemischen Assays zur Bestimmung von HDL-Lipidperoxidation. Dieser schnellen und reproduzierbaren Assay kann zur HDL-Funktion in groß angelegte Studien zu bestimmen und zu unserem Verständnis der HDL-Funktion in der menschlichen Krankheit beitragen kann.

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Messung der in-vitro-Cholesterin Efflux Fähigkeit, Serum oder Plasma in Makrophagen Zellmodellen ist ein viel versprechendes Instrument als Biomarker für Atherosklerose. In der vorliegenden Studie wir optimieren und standardisieren eine fluoreszierende NBD-Cholesterin-Efflux-Methode und eine Hochdurchsatz-Analyse mit 96-Well Platten zu entwickeln.

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Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Messung der Adenin-Nukleotid-Bindung an Rezeptoren in Echtzeit in einer zellulären Umgebung vor. Die Bindung wird als Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen Trinitrophenylnukleotidderivaten und Proteinen, die mit einer nicht-kanonischen, fluoreszierenden Aminosäure markiert sind, gemessen.

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Kontinuierlicher fluoreszenzbasierter Endonuklease-gekoppelter DNA-Methylierungsassay zum Screening auf DNA-Methyltransferase-Inhibitoren

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Klickchemischer fluorometrischer Assay für Apolipoprotein-N-Acyltransferase von der Enzymcharakterisierung bis zum Hochdurchsatz-Screening (Video) | JoVE Journal

Klickchemischer fluorometrischer Assay für Apolipoprotein-N-Acyltransferase von der Enzymcharakterisierung bis zum Hochdurchsatz-Screening

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