Lineage Tracing und Clonal Analysis bei der Entwicklung von Zerebralparese mit Mosaikanalyse mit Doppelmarkern (MADM)
8. Mai 2020
Es wird ein Protokoll zur Verfolgung und funktionellen genetischen Analyse von Kandidatengenen auf Einzelzellebene mithilfe von Mosaikanalysen mit Doppelmarkern (MADM) vorgestellt. Die CLonale MADM-Analyse bietet einen quantitativen Rahmen, um das proliferative Verhalten, die zelluläre Leistung und die Abstammungsbeziehung einzelner Vorfahren und ihrer Tochterzellen zu messen.
Mosaikanalyse mit Double Markers Technologie ist eine leistungsstarke Methode, die hochquantitative Informationen über das Proliferationsverhalten und Kellerausgänge von Individuen Stammzellen liefern kann. Ein einzigartiges Merkmal dieser Technik ist, dass sie die Linienverfolgung und funktionelle genetische Analyse von Kandidatengenen auf der Single Cell level.demontrating to procedure ermöglicht, Carmen Streicher, Ihre Technikerin, Nicole Amberge, Post-Doc, Gisselle Cheung, Post-Doc und Andy Hansen, ein Doktorand aus meinem Labor. Um MADM-Rekombinationsereignisse bei experimentellen Mäusen zu induzieren, verwenden Sie eine 1ml Spritze, die mit einer 25-Messgerät-Nadel ausgestattet ist, um eine einzige Injektion von Tamoxifen Intraperitoneal in eine zeitversetzte, schwangere Mutter zu liefern. Von der KLonalanalyse madM bis hin zu postnatalen Zeitpunkten. Legen Sie an den embryonalen Tagen 18 bis 19 eine trächtige Maus in die Supine-Position und desinfizieren Sie das Fell mit 70% Ethanol. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut im Unterbauch über der Gebärmutter und machen Sie einen zweiten Schnitt durch die Muskeln und die bauchige Muskelwand, um das Peritoneum zu offenbaren. Verwenden Sie eine Schere, um die Gebärmutter von den umgebenden Geweben zu trennen und legen Sie die intakte Gebärmutter in einen Handschuh mit warmem Wasser. Dann verwenden Sie feine Spitze Schere und Finger, um sorgfältig die Gebärmutterwände zu öffnen, um die Embryonen zu befreien. Reinigen Sie die Welpen, die von Zeit zu Zeit sanft die Truhen drücken, um die Atmung zu initiieren, bevor sie die pränatalen Tiere zu einer Pflegemutter überführen. Um neuronales MADM-Klongewebe zu sammeln, legen Sie ein anästhesiertes Tier in die Supine-Position auf einem Perfusions-Operationstablett und desinfizieren Sie das Fell mit 70% Ethanol. Verwenden Sie Schere und Zange, um einen Schnitt durch die Haut und einen Schnitt durch die Muskelschicht zu machen. Wenn die Brusthöhle sichtbar ist, schnüffeln und heben Sie das Zwerchfell, um das Herz zu offenbaren und vorsichtig zu trimmen und stecken Sie den Rippenkäfig an die chirurgische Schale. Legen Sie eine Nadel mit einer peristaltischen Pumpe Schlauch mit PBS gefüllt in die untere linke Herzkammer und verwenden Sie kleine Iris Schere, um einen Schnitt in der hinteren Ende des rechten Atriums zu machen. Durchdringen Sie das Herz-Kreislauf-System mit dem PBS, gefolgt von einer Perfusion mit frisch zubereitetem eiskaltem 4%Paraformaldehyd in PBS. Wenn die Perfusion abgeschlossen ist, entfernen Sie das Gehirn durch sorgfältige Zerlegung und legen Sie das geerntete Organ mindestens das Fünffache des Gehirnvolumens von frischem 4%Paraformaldehyd über Nacht bei 4
Überblick
Diese Studie präsentiert ein Protokoll für die Abstammungsverfolgung und funktionelle genetische Analyse von Kandidatengenen auf Einzelzellebene unter Verwendung der Mosaikanalyse mit Doppelmarkierungen (MADM). Die MADM-Klonalanalyse ermöglicht die quantitative Messung des proliferativen Verhaltens und der zellulären Outputs einzelner Vorläuferzellen und ihrer abstammenden Zellen.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsgebiet
- Abstammungsverfolgung
- Genetische Analyse
- Stammzellenbiologie
Hintergrund
- MADM-Technologie ist entscheidend für das Verständnis der Zellproliferation.
- Die Methode ermöglicht die Verfolgung auf Einzelzellebene.
- Anwendungen umfassen die Bewertung zellulärer Outputs und Abstammungsbeziehungen.
Verwendete Methoden
- Mosaikanalyse mit Doppelmarkierungen (MADM)
- Experimentelles Modell: Mäuse
- Techniken umfassen intraperitoneale Injektionen und Gewebeperfusion.
Hauptergebnisse
- Ermöglichte detaillierte Untersuchung des Verhaltens von Vorläuferzellen.
- Bot Einblicke in die Abstammungsbeziehungen von Tochterzellen.
- Demonstrierte eine zuverlässige Methode für funktionelle genetische Analyse.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie bietet ein umfassendes Protokoll für die Verwendung von MADM in der genetischen Analyse.
- Die Ergebnisse tragen wesentlich zum Bereich der Entwicklungsbiologie bei.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Mosaic Analysis with Double Markers (MADM) enables unprecedented single-cell resolution lineage tracing and clonal analysis in the developing cerebral cortex, directly addressing the challenge of mapping neural stem cell fate and division patterns. This capability enhances predictive confidence in early neurodevelopmental target validation and supports mechanistic de-risking for CNS portfolio decisions. MADM's quantitative and qualitative outputs position it as a critical tool for functional genetic interrogation in neurobiology-focused R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of neural stem cell lineage transitions and division modes.
- Supports functional validation of candidate genes in neurodevelopmental pathways.
- Provides mechanistic de-risking by distinguishing control and mutant subclones in vivo.
- Facilitates high-confidence target selection for CNS therapeutic programs.
Screening & Assay Development
- Generates validated single-cell lineage maps for downstream phenotypic screening.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of progenitor proliferation and fate specification.
- Supports assay standardization by enabling comparative analysis within the same tissue environment.
- Prepares robust biological systems for compound evaluation in neurodevelopmental contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns lineage tracing outputs with disease-relevant neural circuit formation.
- Enables continuity from discovery-stage genetic manipulation to preclinical model validation.
- Supports risk-adjusted advancement of CNS targets based on in vivo functional evidence.
- Provides translational biomarker insights through clonal analysis of neural progenitors.
Pipeline & Workflow Integration
MADM-based lineage tracing integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation in CNS-focused pipelines.
- Discovery Biology: Delivers high-resolution hypothesis testing of neural stem cell fate and division patterns.
- Screening: Supplies quantitative, reproducible lineage data for assay development and compound screening.
- Analytics: Provides optical and statistical outputs for comparing control and mutant progenitor behaviors.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by mapping lineage outcomes in vivo.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any murine stem cell niche with appropriate CreERT2 drivers, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural lineage studies.
- Operational Value: Standardizes lineage tracing and clonal analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in CNS portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets based on in vivo functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic manipulation, in vivo lineage tracing, and neuroanatomical dissection.
- Demands access to murine models with CreERT2 drivers and advanced imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible clonal analysis and data interpretation.
- Adaptable to various stem cell niches with appropriate genetic drivers and tissue handling protocols.
- Limited to murine systems where genetic tools and tissue access are feasible.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Tamoxifen (TM) Induction in Mosaic Analysis with Double Markers (MADM) Mice
2:00
MADM Clone Brain Tissue Harvest
3:12
MADM Brain Tissue Sectioning
4:30
Adult Tissue Mounting
5:29
Confocal Image Acquisition and MADM Clone Quantification
6:29
Serial 3D Clone Reconstruction
7:30
Results: Representative Lineage Tracing and Clonal Analysis
8:41
Conclusion
