Lineage Tracing und Clonal Analysis bei der Entwicklung von Zerebralparese mit Mosaikanalyse mit Doppelmarkern (MADM)

Mosaikanalyse mit Double Markers Technologie ist eine leistungsstarke Methode, die hochquantitative Informationen über das Proliferationsverhalten und Kellerausgänge von Individuen Stammzellen liefern kann. Ein einzigartiges Merkmal dieser Technik ist, dass sie die Linienverfolgung und funktionelle genetische Analyse von Kandidatengenen auf der Single Cell level.demontrating to procedure ermöglicht, Carmen Streicher, Ihre Technikerin, Nicole Amberge, Post-Doc, Gisselle Cheung, Post-Doc und Andy Hansen, ein Doktorand aus meinem Labor. Um MADM-Rekombinationsereignisse bei experimentellen Mäusen zu induzieren, verwenden Sie eine 1ml Spritze, die mit einer 25-Messgerät-Nadel ausgestattet ist, um eine einzige Injektion von Tamoxifen Intraperitoneal in eine zeitversetzte, schwangere Mutter zu liefern. Von der KLonalanalyse madM bis hin zu postnatalen Zeitpunkten. Legen Sie an den embryonalen Tagen 18 bis 19 eine trächtige Maus in die Supine-Position und desinfizieren Sie das Fell mit 70% Ethanol. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut im Unterbauch über der Gebärmutter und machen Sie einen zweiten Schnitt durch die Muskeln und die bauchige Muskelwand, um das Peritoneum zu offenbaren. Verwenden Sie eine Schere, um die Gebärmutter von den umgebenden Geweben zu trennen und legen Sie die intakte Gebärmutter in einen Handschuh mit warmem Wasser. Dann verwenden Sie feine Spitze Schere und Finger, um sorgfältig die Gebärmutterwände zu öffnen, um die Embryonen zu befreien. Reinigen Sie die Welpen, die von Zeit zu Zeit sanft die Truhen drücken, um die Atmung zu initiieren, bevor sie die pränatalen Tiere zu einer Pflegemutter überführen. Um neuronales MADM-Klongewebe zu sammeln, legen Sie ein anästhesiertes Tier in die Supine-Position auf einem Perfusions-Operationstablett und desinfizieren Sie das Fell mit 70% Ethanol. Verwenden Sie Schere und Zange, um einen Schnitt durch die Haut und einen Schnitt durch die Muskelschicht zu machen. Wenn die Brusthöhle sichtbar ist, schnüffeln und heben Sie das Zwerchfell, um das Herz zu offenbaren und vorsichtig zu trimmen und stecken Sie den Rippenkäfig an die chirurgische Schale. Legen Sie eine Nadel mit einer peristaltischen Pumpe Schlauch mit PBS gefüllt in die untere linke Herzkammer und verwenden Sie kleine Iris Schere, um einen Schnitt in der hinteren Ende des rechten Atriums zu machen. Durchdringen Sie das Herz-Kreislauf-System mit dem PBS, gefolgt von einer Perfusion mit frisch zubereitetem eiskaltem 4%Paraformaldehyd in PBS. Wenn die Perfusion abgeschlossen ist, entfernen Sie das Gehirn durch sorgfältige Zerlegung und legen Sie das geerntete Organ mindestens das Fünffache des Gehirnvolumens von frischem 4%Paraformaldehyd über Nacht bei 4