Name: Herstellung keimfreier, schnell wachsender Masthähnchen aus einer kommerziellen Linie für Mikrobiota-Studien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Lernen Sie die Herstellung keimfreier Masthähnchen aus kommerziellen Eiern für Mikrobiota-Studien. Diese Methode ermöglicht Forschung zur Darmflora bei Nutztieren mit hoher Erfolgsrate.

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Die Autoren danken den Züchtern und dem Verein Boyé accouvage (La Boissière en Gâtine, Frankreich) für die Lieferung von befruchteten Eiern. Diese Studie wurde unter der Schirmherrschaft des Forschungskonsortiums APR-IA "INTEGRITY" (2017-2019) durchgeführt, das vom Région Centre Val de Loire, Frankreich, finanziert wurde.

Die Tierpflegeverfahren wurden gemäß den Leitlinien der Richtlinie 86/609/EWG des Rates der Europäischen Gemeinschaften und der französischen Tierversuchsverordnung durchgeführt.
1. Isolator-Vorbereitung
<ol><li>Legen Sie die erforderlichen Materialien unter Überdruck in einen starren Isolator ein: 50 ml Röhrchen, 5, 10 und 25 ml Kunststoffpipetten, bestrahltes Futter, autoklaviertes Wasser und steril verschlossene Kunststoffbehälter.</li>
	<li>Füllen Sie die keimtötende Transferfalle mit einer 2% igen quartären Ammoniumlösung.</li>
	<li>Sterilisieren Sie den Isolator dreimal mit Formaldehyddampf, indem Sie 60 ml Formalin (24% Formaldehyd) zu 30 g Kaliumpermanganat pro Kubikmeter (m3) hinzufügen. Bewegen Sie die Materialien im Inneren des Isolators zwischen den einzelnen Sterilisationen, um die Sterilisation aller Kontaktflächen sicherzustellen.</li>
	<li>Stellen Sie die Isolatortemperatur für mindestens 2 Tage auf 37 °C ein, bevor die Eier eingeführt werden. Stellen Sie das Hygrometer am Tag der Einführung auf 65-70% der relativen Luftfeuchtigkeit (RH) ein.</li>
</ol>2. Eizellentnahme und -inkubation
<ol><li>Sammeln Sie die Eier von Betrieben, die auf der Grundlage einer guten Schlupfrate der Legehennen (mindestens 80% auf dem Höhepunkt der Eierproduktion) und ihres guten Gesundheitszustands (d. h. Fehlen von Geflügelpathogenen und Fehlen von Krankheiten innerhalb der Herde) ausgewählt wurden. Wählen Sie auf dem Laufband optisch saubere und makellose Eier aus.</li>
	<li>Dekontaminieren Sie sofort die Eioberfläche, indem Sie sie für 5 Minuten in eine 1,5% ige Peressigsäurelösung bei Raumtemperatur tauchen.</li>
	<li>Transportieren Sie die Eier mit einer mit Formaldehyddampf dekontaminierten Box zur Versuchsanlage.</li>
	<li>Lagern Sie die Eier 24 Stunden bei 4 °C. Wiederholen Sie den in Schritt 2.2 beschriebenen Dekontaminationsvorgang, und legen Sie sie 19 Tage lang in einen Brutkasten (Tag 0).</li>
</ol>3. Schraffur
<ol><li>Überprüfen Sie am 19. Tag die Fruchtbarkeit, die Lebensfähigkeit (Motilität) und die Embryonalentwicklung, indem Sie sie mit einem hellen Eierkerzen unter sterilen Bedingungen kandieren. Geben Sie nur lebende embryonierte Eier in die sterilen Brutisolatoren ein.</li>
	<li>Dekontaminieren Sie die ausgewählten Eier, indem Sie 1,5% ige Peressigsäurelösung für 30 s sprühen oder bis die gesamte Oberfläche jedes Eies bedeckt ist. Die Eier bleiben während des Transfers in Isolatoren 16 Minuten und 30 s in Kontakt mit dem Spray.</li>
	<li>Übertragen Sie die Eier in die sterilen Schlupfisolatoren und spülen Sie sie mit sterilem demineralisiertem Wasser ab, bevor Sie sie in den Schlupfraum legen. HINWEIS: Die Tiere werden in sterilen Isolatoren geschlüpft und aufgezogen. Sie werden ad libitum mit einer kommerziellen Diät gefüttert, die durch Gammabestrahlung sterilisiert und mit autoklaviertem Leitungswasser bewässert wird, das von Wasserspendern bereitgestellt wird.</li>
</ol>4. Bakteriologische Zustandsanalyse
<ol><li>Nehmen Sie einen Tag nach dem Schlüpfen eine Stuhlprobe direkt aus dem Rektum verschiedener Küken und sammeln Sie sie in einem sterilisierten Glasröhrchen, um diese Probe repräsentativ für alle Tiere in einem bestimmten Isolator zu machen.</li>
	<li>Da die Stuhlproben mehr oder weniger flüssig sind, fügen Sie ein Äquivalent von 1 ml Stuhl zu 9 ml Thioglycolatbrühe mit Resazurin hinzu. Fügen Sie die verbleibende Stuhlprobe zu 9 ml Hirnherzinfusionsbrühe (BHI) hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C ohne Schütteln für 18 bis 48 h. Dies wird das Wachstum einer breiten Palette von aeroben, fakultativen aeroben und nicht anspruchsvollen anaeroben Arten ermöglichen. HINWEIS: Thioglycolatbrühe mit Resazurin ist für den Nachweis von nicht anspruchsvollen anaeroben Bakterien vorgesehen, ermöglicht aber auch den Nachweis von aeroben Bakterien. Dieses Medium entspricht den europäischen, amerikanischen und japanischen Arzneibüchern für Sterilitätstests18,19,20.</li>
	<li>Beobachten Sie visuell, ob nach 18 Stunden Inkubation eine Veränderung in den Wachstumsmedien auftritt. Nach 48 h nehmen Sie einen Tropfen aus dem BHI-Stuhlbrühemedium, legen Sie es auf einen Glasobjektträger und beobachten Sie unter einem Mikroskop (40-fache Vergrößerung) die Abwesenheit oder Anwesenheit von Bakterien.</li>
	<li>Wenn der Verdacht auf das Vorhandensein von Bakterien besteht, nehmen Sie eine Probe aus der BHI-Kultur und säen Sie sie auf BHI-Agarplatten aus. Bei 37 °C für 18 bis 48 h inkubieren.</li>
	<li>Wenn Kolonien vorhanden sind, führen Sie Hochdurchsatztechniken wie die MALDI-TOF-Massenspektrometrie zur präzisen mikrobiellen Identifizierung durch. HINWEIS: Nach 72 h, wenn die bakteriologischen Analysen negativ sind, werden die Tiere für keimfrei erklärt.</li>
</ol>

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<li>Grover, M., Kashyap, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-free+mice+as+a+model+to+study+effect+of+gut+microbiota+on+host+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterology+%26+Motility%22%5BJournal%5D)">Germ-free mice as a model to study effect of gut microbiota on host physiology.</a> Neurogastroenterology & Motility. 26 (6), 745-748 (2014).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Mehrere Methoden zur Erzeugung keimfreier Hühner wurden zuvor beschrieben 7,21,22. Einfache Methoden, wie die hier vorgestellte, verwenden verschiedene Desinfektionsmittel, um die Keimbelastung in der Eioberfläche und in den Isolatoren zu reduzieren. Die am häufigsten verwendeten Desinfektionsmittel sind Quecksilberchlorid, quartäres Ammonium, Jodform, Natriumhypochlorit und Chlordioxidlösungen. Die Ergebnisse sind oft zufriedenstellend. Trotz der Zugänglichkeit dieser Methoden können jedoch nur wenige Strukturen die Methode anwenden und die Tiere in großem Maßstab aufziehen, was die Verwendung keimfreier Hühner zu einem relativ seltenen Ansatz macht, der nur zur Beantwortung sehr spezifischer wissenschaftlicher Fragen verwendet wird. Die hier beschriebenen Methoden, Materialien und Geräte ermöglichen einen hocheffizienten Schlüpfanteil keimfreier Masthähnchen, die mindestens 3 Wochen (die Dauer der wissenschaftlichen Experimente, zu denen sie hergestellt wurden) gesund und steril bleiben.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Anpassung des Protokolls an die Produktion keimfreier Küken aus Eiern, die in kommerziellen Geflügelfarmen gesammelt wurden, erfolgreich ist. Die Erfahrung mit der SPF-Eierproduktion zeigt, dass die Schlupfeffizienz in erster Linie vom Alter der Legehennen und von der Qualität der gesammelten Eier abhängt. Beide Parameter wurden bei der Auswahl der Betriebe und der Sammlung der Eier berücksichtigt. Mit der gleichen Methode ist die durchschnittliche Schlüpfrate von keimfreien Masthähnchen viel besser als bei der letzten Produktion von SPF-Legehennen in unserer Anlage (79% gegenüber 35%), ohne die Tiersterilität zu beeinträchtigen (87% vs. 83%). Diese Unterschiede können mit dem genetischen Hintergrund der Vögel (Masthähnchen versus Schichten) sowie mit der Qualität der Eierschale zusammenhängen, die in den Eiern der SPF-Tiere, die seit mehr als 40 Jahren in geschlossener Zucht gehalten werden, anfälliger ist. Darüber hinaus zeigen wir auch, dass der Transport von mehr als 2 h (von den Farmen zur Versuchsanlage) die Schlupfeffizienz und -qualität nicht beeinträchtigt.
Obwohl der Sterilisationsprozess für Schlüpfisolatoren und das Protokoll für die Eizelldekontamination optimiert wurden, waren rund 10% der Isolatoren nicht keimfrei. Um den Ursprung der Kontamination zu verstehen, ist es sehr wichtig, eine routinemäßige Sterilitätskontrolle der geschlüpften Isolatoren vor der Eieinführung durchzuführen.
In Bezug auf den Sterilitätsstatus der Vögel haben wir versucht, Methoden anzuwenden, die das Wachstum von aeroben und nicht anspruchsvollen anaeroben Bakterien aus Stuhlproben ermöglichen und so sicherstellen, dass wir lebende, lebensfähige Bakterien nachweisen. Diese Methoden entsprechen den internationalen Arzneibüchern für Sterilitätstests und stellen schnelle, einfache und kostenreduzierte Techniken dar, die routinemäßig angewendet werden können. Molekularbiologische Techniken wie die 16S rRNA-Gensequenzierung geben zwar keine Informationen über die Lebensfähigkeit von Bakterien, können jedoch zur Bestätigung des Vorhandenseins nicht kultivierbarer Bakterien eingesetzt werden. Tatsächlich deutete eine kürzlich durchgeführte Studie darauf hin, dass einige Bakterien der mütterlichen Eileitermikrobiota durch das Eiweiß auf den Embryo übertragen zu werden scheinen und später den größten Teil der embryonalen Darmbakterienpopulationausmachen 5. Darüber hinaus deutete eine andere Studie darauf hin, dass ein Teil der mikrobiellen Kolonisatoren, die in frühen Embryonen untergebracht waren, von mütterlichen Hühnern vererbt wurden und die mikrobielle Häufigkeit und Vielfalt des Darms später durch Umweltfaktoren und Wirtsgenetik während der Entwicklungbeeinflusst wurden 23. Die Ergebnisse dieser Studien basieren jedoch auf DNA-Sequenzanalysen, bei denen eine große Anzahl dieser Bakterien im Eiweiß (stark mit antimikrobiellen Molekülen beladen) tot oder nicht replizierbar sein könnte. Thomas und seine Mitarbeiter16 führten Sterilitätstests durch die Bewertung kultivierbarer aerober und fakultativer aerober Bakterien durch fäkales Abtropfen auf BHI-Platten durch und hoben so die Effizienz der bakteriologischen Standardmethoden zur keimfreien Sterilitätskontrolle hervor. Darüber hinaus haben wir in dem vorgeschlagenen Protokoll die Wachstumsüberwachung in Thioglycolatbrühe mit Resazurin verwendet, um das Wachstum von nicht anspruchsvollen anaeroben Bakterien nachweisen zu können.
Das Protokoll, das bereits für die Produktion von keimfreien Wachteln und Hühnern verwendet wird, ist an die Produktion von keimfreien Tieren aus den meisten Brutvögeln anpassbar und bietet Perspektiven für die Untersuchung des Beitrags der Mikrobiota zur Physiologie dieser Tiere. Neben der Verwendung dieses Modells zur Untersuchung gegenseitiger Interaktionen zwischen Wirt und Mikrobiota im Geflügeldarm könnte es auch für die angewandte Forschung nützlich sein. Zum Beispiel könnte es verwendet werden, um die Sicherheit und Wirksamkeit von Probiotika aus Hühnerdarm-kommensalen Mikroorganismen zu bewerten, um die Gesundheit und Robustheit der Tiere zu verbessern.

Das wissenschaftliche und populäre Interesse am Beitrag der Darmmikrobiota zur Tiergesundheit hat dramatisch zugenommen. Die Mikrobiota, bestehend aus Bakterien, Viren, Pilzen und Archaeen, die verschiedene Nischen im Darm des Tieres bewohnen, ist direkt oder indirekt an der Regulation von entzündlichen, infektiösen und metabolischen Erkrankungen beteiligt, die nicht nur Säugetierarten, sondern auch Nutztiere wie Geflügelbetreffen 1. Mehrere Tiermodelle wurden entwickelt, um den Beitrag der Darmmikrobiota zu Gesundheit und Krankheit besser untersuchen zu können. Zum Beispiel ermöglichen keimfreie und gnotobiotische Tiere die Untersuchung der vollständigen Abwesenheit von Mikroben bzw. einer bekannten Mikrobiota auf die Physiopathologie von Infektionen 2,3. Die Erzeugung und Pflege dieser Tiere erfordert jedoch spezielle Techniken und Einrichtungen, und die Kosten, die Arbeit und die Fähigkeiten, die erforderlich sind, um sie zu erhalten, beschränken ihren Zugang zu vielen Forschern. Tatsächlich müssen keimfreie Tiere regelmäßig auf eine mögliche Kontamination mit einer Kombination aus Bakterienkultivierungsmethoden, Mikroskopie, Serologie, grober Morphologie und sequenzierungsbasierten Nachweistechniken überwacht werden. Ähnliche Verfahren gelten auch für andere Arten wie Nutztiere, bei denen Tiere im Allgemeinen größer sind und größere Einrichtungen für ihre Zucht und Pflege benötigen, was die Erforschung der Mikrobiota bis zu einem gewissen Grad behindern kann.
Geflügel, genauer gesagt Hühner, sind der Eckpfeiler der weltweiten Tierproduktion, mit einer Herdenpopulation, die 40 Milliarden Vögel pro Jahr überschreiten kann. Es ist die wichtigste Quelle für tierisches Protein in der Welt (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). Darüber hinaus gibt es keine kulturellen oder religiösen Tabus, die mit der Aufzucht oder dem Verzehr von Hühnern verbunden sind. Die Geflügeldarmmikrobiota ist wichtig am Wachstum der Tiere, am Futterverwertungsverhältnis, an der Immunität, an der Resistenz gegen Krankheitserreger und an vielen anderen ernährungsphysiologischen, physiologischen oder pathologischen Prozessenbeteiligt 4. Die Erzeugung keimfreier Hühner ist daher unerlässlich, um den Dialog zwischen der Mikrobiota und ihrem Wirt zu unterstreichen4. Selbst wenn mikrobielle Gemeinschaften den Huhneileiter5 bewohnen, ist der Inhalt eines Eies, das von einer gesunden Henne frisch gelegt wurde, meist frei von Mikroorganismen, wobei die Eierschale und die Membranen mechanische Barrieren besitzen, um eine Invasion von Mikroorganismen zu vermeiden4. Darüber hinaus werden Küken in Abwesenheit ihrer Verwandten leicht aufgezogen, was im Gegensatz zu Säugetieren die Produktion keimfreier Tiere ohne elterliche Aufzucht unter sterilen Bedingungen ermöglicht.
Die Versuchsanlage "Infektiologie von Nutztieren, Modellen und Wildtieren" (PFIE, UE-1277, Centre INRAE Val de Loire, Nouzilly, Frankreich, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12) ist Teil des französischen nationalen Infrastrukturnetzes EMERG'IN (https://www.emergin.fr/). PFIE beherrscht die Produktion von keimfreien Hühnern, um seit mehr als 40 Jahren verschiedene experimentelle Studien durchzuführen 7,8,9,10,11. Diese Tiere wurden aus spezifischen pathogenfreien (SPF) Eiern einer weißen Leghorn-Legelinie hergestellt, die seit den 1970er Jahren in geschlossener Zucht gezüchtet wurde. Hauptsächlich für mikrobiologische Studien verwendet 7,8,9, erleben keimfreie Vögel ein Wiederaufleben des Interesses mit Fragen wie dem Beitrag der Darmmikrobiota zum Verhalten 13, Nährstoffverwertung 14, Immunentwicklung 15 und endokriner Aktivität. Auch wenn einige Studien mit keimfreien Masthähnchenlinien16 veröffentlicht wurden, bleiben diese Studien im Vergleich zu Studien mit experimentellen Schichtlinien unterrepräsentiert. Die Entwicklung wissenschaftlicher Fragen hin zum Crosstalk zwischen der Mikrobiota und ihrem Wirt in Bezug auf Geflügelgesundheit und -wohlergehen hat uns dazu veranlasst, unser historisches Protokoll anzupassen, um keimfreie Masthähnchen der Ross PM3-Linie, der weltweit am häufigsten verwendeten Masthähnchenlinie, herzustellen.

<table><tbody><tr><td>2 mL sterile Kunststoffpipetten</td><td>Starsted</td><td>86.1252.001</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Röhrchen</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BHI Agarplatten</td><td>Thermo Fisher Diagnostik</td><td>PO1198A</td><td></td></tr><tr><td>Gehirn Herz Infusionsbrühe</td><td>Thermo Fisher Diagnostik</td><td>CM1135</td><td></td></tr><tr><td>Glasröhrchen mit 9 mL BHI Brühe</td><td></td><td></td><td>hausgemacht und durch Autoklavieren sterilisiert</td></tr><tr><td>Glasröhrchen mit 9 mL Thioglykolatbrühe mit Resazurin</td><td></td><td></td>, <td>hausgemacht und durch Autoklavieren sterilisiert</td></tr><tr><td>Brutbrutator</td><td>Fieme</td><td>MG 576</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Memmert</td><td></td><td>für bakteriologische Kultur, 37 > C</td></tr><tr><td>Bestrahlte Einspeisung</td><td>Sichere</td><td>U8983G10R</td><td>40 kG bestrahlte</td></tr><tr><td>Isolatoren</td><td></td><td></td><td>hausgemacht. 1 m3 starrer Isolator unter Überdruck</td></tr><tr><td>Mikrobiologische Sicherheitswerkbank</td><td>thermon electron corporation</td><td></td><td>Modell: Hera</td></tr><tr><td>Safe Microscope Visiscope Serie 300</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettenhilfe</td><td>Drummond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffpipetten</td> Steril versiegelte Dosen <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tuperware</td><td></td><td>Durchmesser</td></tr><tr><td>Sterilisiertes Glasröhrchen</td><td></td><td></td> <td>"Sovirel"</td></tr><tr><td>Thioglykolat Bouillon mit Resazurin</td><td>Merck</td><td>90404-500G</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td>Modell: Polystat 36, zur Inkubation von 10 min bei 100 °C; C die Glasröhrchen mit 9 mL Thioglykolatbrühe mit Resazurin, um das Medium zu regenerieren</td></tr></tbody></table>

herstellung keimfreier, schnell wachsender masthähnchen aus einer kommerziellen linie für mikrobiota-studien

Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies

Untersuchungen des Beitrags der Darmmikrobiota zur Wirtsphysiologie und Immunkompetenz werden durch die Verfügbarkeit keimfreier Tiermodelle erleichtert, die als Goldstandard gelten. Nistende Vögel sind ideale Modelle für die Produktion keimfreier Tiere, da ihre Verwandten nicht unter sterilen Bedingungen aufgezogen werden müssen. Keimfreie Hühner werden hauptsächlich aus spezifisch-pathogenfreien (SPF) Versuchslinien erzeugt, die für kommerzielle Hühnerlinien schlecht repräsentativ sind. Die hier vorgeschlagene Methode ermöglichte die Produktion von keimfreien Hühnern aus der schnell wachsenden Masthähnchenlinie Ross PM3, die üblicherweise von der Geflügelindustrie verwendet wird. Die Eier wurden schnell gesammelt, nachdem sie auf einer Masthähnchenzuchtfarm gelegt worden waren. Sie durchliefen einen strengen Dekontaminationsprozess von der Entnahme bis zur Einführung in einen sterilen Eierschlüpfisolator. Die Küken wurden geschlüpft und in diesen sterilen Isolatoren während des Zeitraums gehalten, der zur Kontrolle ihrer Sterilität erforderlich ist. Ursprünglich für eine experimentelle SPF-Linie für weiße Leghorne entwickelt, wurde das vorliegende Protokoll nicht nur an die Ross PM3-Masthähnchenlinie, sondern auch an Wachteln angepasst. Es stellt daher ein robustes und leicht anpassbares Verfahren an andere Geflügelarten und Brutvögel von ökonomischer, biologischer oder ökologischer Relevanz dar.

Sechs Läufe der keimfreien Kükengeneration wurden mit Ross PM3-Eiern aus zwei verschiedenen französischen Betrieben durchgeführt (Tabelle 1). Insgesamt wurden 853 Eier gesammelt und nach zwei Dekontaminationsschritten und 19 Tagen Inkubation waren 86,40% lebensfähig. 490 dieser lebensfähigen Eier durchliefen einen dritten Dekontaminationsschritt und wurden in verschiedene Schlupfisolatoren eingeführt, was einer durchschnittlichen Schlupfrate von 79,80% entspricht. Dies entspricht einer Schlupfrate von 68,94% im Vergleich zur ursprünglichen Anzahl der gesammelten Eier.
Die Brutergebnisse variieren jedoch je nach durchgeführter Serie erheblich: von 41,67% bis 88,16% der lebensfähigen Küken im Vergleich zur Anzahl der gesammelten Eier. Diese Variationen wurden auch zwischen den verschiedenen Luken während desselben Experiments beobachtet. Da nicht alle Isolatoren für alle Durchläufe verwendet wurden, ist es schwierig, einen isolatorabhängigen Effekt auszuschließen. Dieser Chargeneffekt korrelierte jedoch direkt mit dem Alter der Legehennen (Abbildung 1), wo Eier von älteren Hühnern weniger lebensfähig waren.
Die sechs Läufe wurden mit vier verschiedenen Schraffurisolatoren durchgeführt. Nach bakteriologischer Kontrolle wurde bestätigt, dass die Tiere aus 14 der 16 Isolatoren keimfrei sind. Dies entspricht einer Erfolgsquote von 87,5%. Die beiden verbleibenden Isolatoren waren durch ein einziges umweltbedingtes und nichtpathogenes Bakterium kontaminiert.
Alle Tiere, die für die wissenschaftlichen Experimente verwendet wurden, blieben bis zum Ende der Studien für mindestens drei Wochen nach dem Schlüpfen keimfrei.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61148/61148fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Einfluss des Hühneralters auf die Schlüpfrate Die vorliegende Abbildung zeigt die beobachteten Schlupfraten auf der Grundlage des Alters der Legehennenherde, ausgedrückt in Wochen des Legens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61148/61148fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Gesammelte Eier</td>
			<td>D19 lebensfähige Eier</td>
			<td>D19 lebensfähige Eier/gesammelte Eier</td>
			<td>Eier, die in Isolator 1 überführt werden</td>
			<td>Eier, die in Isolator 2 überführt werden</td>
			<td>Eier, die in Isolator 3 überführt werden</td>
			<td>Eier, die in Isolator 4 überführt werden</td>
			<td>Gesamtzahl der übertragenen Eier</td>
			<td>lebensfähige Küken, die in Isolator 1 geschlüpft sind</td>
			<td>lebensfähige Küken, die in Isolator 2 geschlüpft sind</td>
			<td>lebensfähige Küken, die in Isolator 3 geschlüpft sind</td>
			<td>lebensfähige Küken, die in Isolator 4 geschlüpft sind</td>
			<td>Gesamtzahl der lebensfähigen geschlüpften Küken</td>
			<td>lebensfähiger Isolator für geschlüpfte/transferierte Eier1</td>
			<td>lebensfähiger Isolator für geschlüpfte/transferierte Eier2</td>
			<td>lebensfähiger Isolator für geschlüpfte/transferierte Eier3</td>
			<td>lebensfähiger Isolator für geschlüpfte/transferierte Eier4</td>
			<td c="">lebensfähige geschlüpfte/transferierte Eier weltweit</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lauf 1</td>
			<td>101</td>
			<td>93</td>
			<td>92.08%</td>
			<td>23</td>
			<td>24</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>47</td>
			<td>22</td>
			<td>23</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>45</td>
			<td>95.65%</td>
			<td>95.83%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>95.74%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lauf 2</td>
			<td>130</td>
			<td>117</td>
			<td>90.00%</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
			<td>75</td>
			<td>20</td>
			<td>24</td>
			<td>18</td>
			<td>-</td>
			<td>62</td>
			<td>80.00%</td>
			<td>96.00%</td>
			<td>72.00%</td>
			<td></td>
			<td>82.67%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lauf 3</td>
			<td>132</td>
			<td>97</td>
			<td>73.48%</td>
			<td>26</td>
			<td>-</td>
			<td>26</td>
			<td>45</td>
			<td>97</td>
			<td>14</td>
			<td>-</td>
			<td>13</td>
			<td>28*</td>
			<td>27</td>
			<td>53.85%</td>
			<td></td>
			<td>50.00%</td>
			<td>62.22%</td>
			<td>56.70%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lauf 4</td>
			<td>130</td>
			<td>116</td>
			<td>89.23%</td>
			<td>36</td>
			<td>35</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>71</td>
			<td>33</td>
			<td>34</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>67</td>
			<td>91.67%</td>
			<td>97.14%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>94.37%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lauf 5</td>
			<td>180</td>
			<td>148</td>
			<td>82.22%</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>120</td>
			<td>26*</td>
			<td>25</td>
			<td>17</td>
			<td>24</td>
			<td>66</td>
			<td>86.67%</td>
			<td>83.33%</td>
			<td>56.67%</td>
			<td>80.00%</td>
			<td>76.67%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lauf 6</td>
			<td>180</td>
			<td>166</td>
			<td>92.22%</td>
			<td>-</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>-</td>
			<td>80</td>
			<td>-</td>
			<td>35</td>
			<td>35</td>
			<td>-</td>
			<td>70</td>
			<td>86.67%</td>
			<td>87.50%</td>
			<td>87.50%</td>
			<td></td>
			<td>87.50%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gesamt</td>
			<td>853</td>
			<td>737</td>
			<td>86.40%</td>
			<td>140</td>
			<td>154</td>
			<td>121</td>
			<td>75</td>
			<td>490</td>
			<td>89</td>
			<td>141</td>
			<td>83</td>
			<td>24</td>
			<td>337</td>
			<td>82.14%</td>
			<td>91.56%</td>
			<td>68.60%</td>
			<td>69.33%</td>
			<td>79.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Technische Ergebnisse der verschiedenen Schraffurexperimente. Die vorliegende Tabelle zeigt die Ergebnisse der 6 durchgeführten Serien keimfreier Schlupflöcher: Anzahl der gesammelten Eier, Lebensfähigkeit des Embryos nach 19 Tagen und lebensfähige geschlüpfte Küken in den verschiedenen Isolatoren.

Hier beschreiben wir eine Methode zur Erzeugung keimfreier Küken aus Eiern einer kommerziellen Masthähnchenlinie, der Ross PM3. Diese Methode kann für die Erzeugung keimfreier Tiere aus anderen Geflügelarten angepasst werden.

Herstellung keimfreier, schnell wachsender Masthähnchen aus einer kommerziellen Linie für Mikrobiota-Studien

Studies of the gut microbiota contribution to the host physiology and immunocompetence are facilitated by the availability of germ-free animal models, ...

Bisher beschränkte sich die Produktion keimfreier Vögel auf Tierrassen für die Forschung. Wir zeigen hier, dass es möglich ist, dies mit Nutztieren zu tun. Diese Technik ermöglicht es, Studien über den Einfluss der Mikrobiota anhand des genetischen Hintergrunds von Nutzvögeln durchzuführen.Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, ist es wichtig, die Zucht der ausgewählten Spezies unter den Standardbedingungen zu kontrollieren und über fundierte Kenntnisse in der Arbeit mit Isolatoren zu verfügen. Beginnen Sie mit dem Einrichten von 50-Milliliter-Röhrchen, Kunststoffpipetten, bestrahltem Futter, autoklaviertem Wasser und steril versiegelten Kunststoffbehältern in einem starren Isolator unter Überdruck. Füllen Sie die keimtötende Transferfalle mit einer 2%igen quartären Ammoniumlösung und sterilisieren Sie den Isolator dreimal mit Formaldehyddampf, wobei Sie die Materialien im Isolator zwischen jeder Sterilisation bewegen, um die Desinfektion aller Kontaktflächen zu gewährleisten.Stellen Sie mindestens zwei Tage vor dem Einbringen der Eier die Isolatortemperatur auf 37 Grad Celsius ein. Stellen Sie das Aräometer am Tag der Einführung auf 65 bis 70 % der relativen Luftfeuchtigkeit ein. Nachdem Sie saubere und einwandfreie Eier ausgewählt haben, dekontaminieren Sie sofort die Eioberfläche, indem Sie sie fünf Minuten lang in eine 1,5%ige Peressigsäurelösung tauchen, und transportieren Sie die Eier dann mit einer mit Formaldehyddampf dekontaminierten Box zur Versuchsanlage.Lagern Sie die Eier 24 Stunden lang bei 14 Grad Celsius, wiederholen Sie dann die Sterilisation mit 1,5%iger Peressigsäure und legen Sie die Eier für 19 Tage in einen Brutkasten. Überprüfen Sie am 19. Tag die Fruchtbarkeit, Lebensfähigkeit und Entwicklung des Embryos mit einem leichten Egg Candler unter sterilen Bedingungen. Wählen Sie lebende, embryonierte Eier aus und dekontaminieren Sie sie, indem Sie sie 30 Sekunden lang mit einer 1,5%igen Peressigsäurelösung besprühen oder bis die gesamte Oberfläche jedes Eies bedeckt ist.Übertragen Sie die Eier in die sterilen Brutisolatoren und spülen Sie sie mit sterilem demineralisiertem Wasser ab, bevor Sie sie in den Brutraum legen. Nach dem Schlüpfen werden die Tiere in den sterilen Isolatoren gehalten, ad libitum mit einem handelsüblichen Futter gefüttert, das durch Gammabestrahlung sterilisiert und mit autoklaviertem Leitungswasser getränkt wird. Einen Tag nach dem Schlüpfen entnehmen Sie einer Kotprobe direkt aus dem Enddarm verschiedener Küken und poolen Sie sie in einem sterilisierten Glasröhrchen.Fügen Sie einen Milliliter Stuhl zu neun Millilitern Thioglykolatbrühe mit Resazurin hinzu und geben Sie die restliche Probe zu neun Millilitern Brain Heart Infusion oder BHI-Brühe. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 Grad Celsius ohne Schütteln für 18 bis 48 Stunden. Untersuchen Sie die Röhrchen nach 18 Stunden visuell auf Veränderungen im Wachstumsmedium.Nehmen Sie nach 48 Stunden einen Tropfen aus dem BHI-Stuhlbrühe-Medium, geben Sie ihn auf einen Objektträger und betrachten Sie ihn unter einem Mikroskop. Bei Verdacht auf das Vorhandensein von Bakterien entnehmen Sie eine Probe aus der BHI-Kultur und säen Sie sie auf eine BHI-Agarplatte, dann inkubieren Sie die Platte 18 bis 48 Stunden lang bei 37 Grad. Wenn Kolonien auftreten, identifizieren Sie die Bakterien mit einer Hochdurchsatztechnik wie der MALDI-TOF-Massenspektrometrie.Es wurden sechs Durchläufe zur Erzeugung keimfreier Küken mit ROSS PM3-Eiern durchgeführt, die von zwei verschiedenen französischen Farmen stammten. Insgesamt wurden 853 Eizellen entnommen und nach zwei Dekontaminationsschritten und 19 Tagen Inkubation waren 86,40 % lebensfähig. Von den lebensfähigen Eiern durchliefen 490 einen dritten Dekontaminationsschritt und wurden in verschiedene Schlupfisolatoren eingebracht, was einer durchschnittlichen Schlupfrate von 79,80 % entspricht. Dies entspricht einer Schlupfrate von 68,94 % im Vergleich zur ursprünglichen Anzahl der entnommenen Eier.Die Schlupfergebnisse variieren erheblich von 41,67 % bis 88,16 % der lebensfähigen Küken im Vergleich zur Anzahl der gesammelten Eier. Dieser Effekt korrelierte direkt mit dem Alter der Legehennen, bei denen Eier älterer Hennen weniger lebensfähig waren. Die sechs Läufe wurden mit vier verschiedenen Schraffurisolatoren durchgeführt.Nach bakteriologischer Kontrolle wurde bei den Tieren aus 14 der 16 Isolatoren bestätigt, dass sie keimfrei sind, was einer Erfolgsquote von 86,5 % entspricht. Der Kernpunkt dieses Verfahrens ist die Aufrechterhaltung der Sterilität des Isolators. Dies erfordert die Einhaltung von Desinfektionsverfahren und vor allem die Kontrolle des Eintrags der Elemente über die Flüssigkeitsschleuse. Dieses Verfahren ermöglicht es Tieren, den Einfluss der Mikrobiota auf die Physiologie und Gesundheit von Vögeln zu messen.Es kann angepasst und verwendet werden, um die Mikrobiota anderer Nutzvögel oder Wildtiere zu untersuchen, wenn die Eier zugänglich sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Taylor, M. N., et.al. Verwendung von Einzelwurmdaten zur Quantifizierung der Heterogenität bei Caenorhabditis elegans-bakteriellen Interaktionen. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video zeigt die Exposition von keimfreien, altersangepassten Caenorhabditis elegans-Würmern gegenüber einem Bakterienstamm zur Darmbesiedlung. Sie erklärt die selektive Entfernung von nicht anhaftenden und externen Bakterien, wobei nur lebensfähige Bakterien, die am Darmepithel haften, zur Quantifizierung übrig...

Bewertung der bakteriellen Besiedlung im Darm bei keimfreien C. elegans

Es wurde eine Methode entwickelt, keimfreie Napa-Kohlsorten anzubauen, die es Forschern ermöglicht, zu bewerten, wie einzelne mikrobielle Arten oder mikrobielle Gemeinschaften mit mehreren Arten auf Kohlblattoberflächen interagieren. Es wird auch ein steriler Pflanzenextrakt präsentiert, der zur Messung von Verschiebungen in der Zusammensetzung der Gemeinschaft während der Gemüsegärung verwendet werden kann.

Ein gnotobiotisches System zur Untersuchung der Mikrobiom-Montage in der Phyllosphäre und in der gemüseischen Fermentation

Dieses Protokoll wird bei der Etablierung und Aufrechterhaltung von gnotobitischen amerikanischen Kakerlaken (Periplaneta americana) verwendet, indem die Eierhüllen (Oothecae) vor dem Schlüpfen an der Oberfläche sterilisiert werden. Diese gnotobitischen Insekten enthalten ihre vertikal übertragenen Blattabacterium-Endosymbionten, haben aber axenische Eingeweide.

Etablierung und Pflege von Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Um ein axenisches Insekt zu erhalten, wird seine Eioberfläche sterilisiert, und die geschlüpfte Larve wird anschließend mit axenischen Blättern aufgezogen. Diese Methode bietet eine effiziente Möglichkeit für die axenische Insektenvorbereitung, ohne Antibiotika zu verabreichen oder eine künstliche Diät zu entwickeln, die auch auf andere blattfressende Insekten angewendet werden kann.

Vorbereitung und Aufzucht axenischer Insekten mit gewebekultivierten Sämlingen für Wirt-Darm-Mikrobiota-Interaktionsstudien des Blattkäfers

Ein einfaches Verfahren zur Aufzucht axenischer Delia antiqua mit halbfermentiertem sterilem Futter wird beschrieben. Mittels PCR wurde nur ein Wolbachia-Stamm in jedem Instar von axenic D. antiqua nachgewiesen.

Aufzucht von Axenic Delia antiqua mit halbfermentiertem sterilem Futter

Dieses Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte zur Gewinnung keimfreier (GF) Fischembryonen und deren Erhaltung von Larven bis zum Jugendstadium, einschließlich der Probenahme und des Nachweises ihres sterilen Status. Die Verwendung von GF-Modellen mit Infektionen ist wichtig, um die Rolle von Mikroben für die Gesundheit des Wirts zu verstehen.

Generierung, Pflege und Identifizierung von keimfreien Zebrafischmodellen von der Larve bis zum Jungstadium

Das Protokoll stellt zwei Methoden vor, um die Isolierung von anaeroben Darmbakterien zu verbessern. Die erste konzentriert sich auf die Isolierung einer Vielzahl von Bakterien mit unterschiedlichen Nährmedien. Die zweite konzentriert sich auf die Kultivierungsschritte einer bestimmten mikrobiellen Gruppe, die möglicherweise Myo-Inositol assimiliert, um ihre ökologische Bedeutung vollständig zu verstehen.

Strategien zur Verbesserung der Kultivierung anaerober Bakterien aus dem Magen-Darm-Trakt von Hühnern

Dieses Protokoll beschreibt ein lungenrelevantes Polymikrobien-Biofilmmodell für Mukoviszidose (CF) mit vier Spezies, mit dem die Auswirkungen bakterieller Wechselwirkungen zwischen den Spezies untersucht werden können.

Züchtung eines Mukoviszidose-relevanten polymikrobiellen Biofilms zur Untersuchung von Phänotypen in der Gemeinschaft

Hier beschreiben wir den Aufbau und die Betriebsabläufe, einschließlich mikrobieller Eindämmungsmaßnahmen einer Anlage zur "Wilding von Mäusen" am Beispiel von Blutproben zur Immunphänotypisierung.

Betriebs- und Biocontainment-Verfahren einer Anlage für Labormäuse mit natürlichem Mikrobiom: Immunphänotypisierungsverfahren

Dieses Protokoll beschreibt die Best Practices für den keimfreien Transfer von Mäusen zu und die Unterbringung in experimentellen Einzelkäfig-Isolatoren (Isokäfigen) unter Beibehaltung steriler Bedingungen. Methoden zur Stuhltransplantation in keimfreie Mäuse und die Gewinnung lebensfähiger Bakterien aus diesen darmisierten "humanisierten" Mäusen für weitere Anwendungen werden diskutiert.

Vorbereitung und Durchführung eines IsoPositiv-Käfig-Experiments zur Stuhltransplantation von Menschen in keimfreie Mäuse

Diese Methode zeigt den Hühnerembryo als einfaches und kostengünstiges in vivo Modell, um den bakteriellen Erreger L. monocytogenes aus einem lebensfähigen, aber nicht kultivierbaren (VBNC) Zustand wiederzubeleben und mit potenziellen weiteren Anwendungen für das Verständnis der bakteriellen Ruhemechanismen.

Hühnerembryo als In-vivo-Modell zur Wiederbelebung lebensfähiger, aber nicht kultivierbarer Krankheitserreger

Lernen Sie die Herstellung keimfreier Masthähnchen aus kommerziellen Eiern für Mikrobiota-Studien. Diese Methode ermöglicht Forschung zur Darmflora bei Nutztieren mit hoher Erfolgsrate.

Herstellung keimfreier, schnell wachsender Masthähnchen aus einer kommerziellen Linie für Mikrobiota-Studien

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