Herstellung keimfreier, schnell wachsender Masthähnchen aus einer kommerziellen Linie für Mikrobiota-Studien

Bisher beschränkte sich die Produktion keimfreier Vögel auf Tierrassen für die Forschung. Wir zeigen hier, dass es möglich ist, dies mit Nutztieren zu tun. Diese Technik ermöglicht es, Studien über den Einfluss der Mikrobiota anhand des genetischen Hintergrunds von Nutzvögeln durchzuführen.

Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, ist es wichtig, die Zucht der ausgewählten Spezies unter den Standardbedingungen zu kontrollieren und über fundierte Kenntnisse in der Arbeit mit Isolatoren zu verfügen. Beginnen Sie mit dem Einrichten von 50-Milliliter-Röhrchen, Kunststoffpipetten, bestrahltem Futter, autoklaviertem Wasser und steril versiegelten Kunststoffbehältern in einem starren Isolator unter Überdruck. Füllen Sie die keimtötende Transferfalle mit einer 2%igen quartären Ammoniumlösung und sterilisieren Sie den Isolator dreimal mit Formaldehyddampf, wobei Sie die Materialien im Isolator zwischen jeder Sterilisation bewegen, um die Desinfektion aller Kontaktflächen zu gewährleisten.

Stellen Sie mindestens zwei Tage vor dem Einbringen der Eier die Isolatortemperatur auf 37 Grad Celsius ein. Stellen Sie das Aräometer am Tag der Einführung auf 65 bis 70 % der relativen Luftfeuchtigkeit ein. Nachdem Sie saubere und einwandfreie Eier ausgewählt haben, dekontaminieren Sie sofort die Eioberfläche, indem Sie sie fünf Minuten lang in eine 1,5%ige Peressigsäurelösung tauchen, und transportieren Sie die Eier dann mit einer mit Formaldehyddampf dekontaminierten Box zur Versuchsanlage.

Lagern Sie die Eier 24 Stunden lang bei 14 Grad Celsius, wiederholen Sie dann die Sterilisation mit 1,5%iger Peressigsäure und legen Sie die Eier für 19 Tage in einen Brutkasten. Überprüfen Sie am 19. Tag die Fruchtbarkeit, Lebensfähigkeit und Entwicklung des Embryos mit einem leichten Egg Candler unter sterilen Bedingungen. Wählen Sie lebende, embryonierte Eier aus und dekontaminieren Sie sie, indem Sie sie 30 Sekunden lang mit einer 1,5%igen Peressigsäurelösung besprühen oder bis die gesamte Oberfläche jedes Eies bedeckt ist.

Übertragen Sie die Eier in die sterilen Brutisolatoren und spülen Sie sie mit sterilem demineralisiertem Wasser ab, bevor Sie sie in den Brutraum legen. Nach dem Schlüpfen werden die Tiere in den sterilen Isolatoren gehalten, ad libitum mit einem handelsüblichen Futter gefüttert, das durch Gammabestrahlung sterilisiert und mit autoklaviertem Leitungswasser getränkt wird. Einen Tag nach dem Schlüpfen entnehmen Sie einer Kotprobe direkt aus dem Enddarm verschiedener Küken und poolen Sie sie in einem sterilisierten Glasröhrchen.

Fügen Sie einen Milliliter Stuhl zu neun Millilitern Thioglykolatbrühe mit Resazurin hinzu und geben Sie die restliche Probe zu neun Millilitern Brain Heart Infusion oder BHI-Brühe. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 Grad Celsius ohne Schütteln für 18 bis 48 Stunden. Untersuchen Sie die Röhrchen nach 18 Stunden visuell auf Veränderungen im Wachstumsmedium.

Nehmen Sie nach 48 Stunden einen Tropfen aus dem BHI-Stuhlbrühe-Medium, geben Sie ihn auf einen Objektträger und betrachten Sie ihn unter einem Mikroskop. Bei Verdacht auf das Vorhandensein von Bakterien entnehmen Sie eine Probe aus der BHI-Kultur und säen Sie sie auf eine BHI-Agarplatte, dann inkubieren Sie die Platte 18 bis 48 Stunden lang bei 37 Grad. Wenn Kolonien auftreten, identifizieren Sie die Bakterien mit einer Hochdurchsatztechnik wie der MALDI-TOF-Massenspektrometrie.

Es wurden sechs Durchläufe zur Erzeugung keimfreier Küken mit ROSS PM3-Eiern durchgeführt, die von zwei verschiedenen französischen Farmen stammten. Insgesamt wurden 853 Eizellen entnommen und nach zwei Dekontaminationsschritten und 19 Tagen Inkubation waren 86,40 % lebensfähig. Von den lebensfähigen Eiern durchliefen 490 einen dritten Dekontaminationsschritt und wurden in verschiedene Schlupfisolatoren eingebracht, was einer durchschnittlichen Schlupfrate von 79,80 % entspricht. Dies entspricht einer Schlupfrate von 68,94 % im Vergleich zur ursprünglichen Anzahl der entnommenen Eier.

Schlupfergebnisse variieren erheblich von 41,67 % bis 88,16 % der lebensfähigen Küken im Vergleich zur Anzahl der gesammelten Eier. Dieser Effekt korrelierte direkt mit dem Alter der Legehennen, bei denen Eier älterer Hennen weniger lebensfähig waren. Die sechs Läufe wurden mit vier verschiedenen Schraffurisolatoren durchgeführt.

Nach bakteriologischer Kontrolle wurde bei den Tieren aus 14 der 16 Isolatoren bestätigt, dass sie keimfrei sind, was einer Erfolgsquote von 86,5 % entspricht. Der Kernpunkt dieses Verfahrens ist die Aufrechterhaltung der Sterilität des Isolators. Dies erfordert die Einhaltung von Desinfektionsverfahren und vor allem die Kontrolle des Eintrags der Elemente über die Flüssigkeitsschleuse. Dieses Verfahren ermöglicht es Tieren, den Einfluss der Mikrobiota auf die Physiologie und Gesundheit von Vögeln zu messen.

Es kann angepasst und verwendet werden, um die Mikrobiota anderer Nutzvögel oder Wildtiere zu untersuchen, wenn die Eier zugänglich sind.