Name: Ein gnotobiotisches System zur Untersuchung der Mikrobiom-Montage in der Phyllosphäre und in der gemüseischen Fermentation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie keimfreie Napa-Köpfe züchten, um mikrobielle Interaktionen in der Phyllosphäre zu untersuchen. Diese Methode verknüpft Gemeinschaftsstruktur mit Fermentationsfunktion.

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Diese Arbeit wurde durch den USDA-NIFA-Zuschuss unterstützt: 2017-67013-26520. Tracy Debenport und Claire Fogan leisteten technische Unterstützung und Ruby Ye und Casey Cosetta gaben hilfreiche Kommentare zu frühen Versionen dieses Manuskripts.

1. Keimfreie Kohlsorten anbauen
<ol><li>Vorbereitungsgeräte für den Anbau von keimfreiem Kohl<ol>
<li>Reinigung des kalzinierten Tons zur Entfernung von Feinstaubpartikeln<ol>
<li>Kalzinierten Ton(Materialtabelle) mindestens 3x mit Leitungswasser abspülen; Wasser ablassen. VORSICHT: Kalkton produziert sehr feinen Staub und es wird empfohlen, beim Waschen eine Schutzmaske(Materialtabelle)zu tragen.</li>
			<li>Kalzinierten Ton als dünne Schicht (ca. 4 cm) in ein Autoklaventablett und Autoklaven in einem trockenen Zyklus (121 °C Erhitzung für 20 min und 20 min Trocknungszeit) verteilen, um zu sterilisieren.</li>
			<li>Lassen Sie den kalzinierten Ton vor der Verwendung vollständig trocknen, indem Sie ihn auf Schalen ausbreiten und mindestens eine Woche lang in einen warmen Inkubator (30 bis 37 °C) geben. Rühren Sie alle 3 Tage, um den kalzinierten Ton vollständig zu trocknen, so dass er eine gleichmäßige Menge an Murashige und Skoog (MS) Nährstoffbrühe absorbiert (Abschnitt 1.2). HINWEIS: Das Trocknen hilft auch, das Volumen von kalziniertem Ton zu halten, auch wenn er in Rohre gewogen wird. Auch das Trocknen mit anderen Mitteln, wie z.B. einem Trockenschrank, wäre geeignet.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Reinigung der Gläser für den Anbau von keimfreiem Kohl<ol>
<li>Gründlich reinigen und sterilisieren die Glasröhren (Tabelle der Materialien) zwischen jedem Einsatz. Rohre für 30 min in 30% Bleichlösung einweichen und gut mit Leitungswasser abspülen, bevor sie in einer Säurewäsche auf einer Bakteriologie-Einstellung gereinigt werden. Säure-Wasch-Zwei-Wege-Reagenzglaskappen (Materialtabelle) zwischen den Verwendungen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Oberflächensterilisation kohlsamen<ol>
<li>Bis zu 100 Napa-Kohl (B. rapa var pekinensis) Samen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr geben. HINWEIS: Das Hinzufügen von mehr als 100 Samen zu einem Mikrozentrifugenrohr oder die Änderung der Größe des Rohres kann die Keimraten der Samen aufgrund fehlender Entfernung von Samenmänteln beeinflussen.</li>
			<li>Fügen Sie 1 ml 70% Ethanol in die Samen und Wirbel für 5 min. Entsorgen Sie das Ethanol mit einer Pipette.</li>
			<li>Fügen Sie 1 ml 50% Bleichmittel und Wirbel für 5 min. Entsorgen Sie die Bleichlösung mit einer Pipette.</li>
			<li>Fügen Sie 1 ml autoklaviertes entionisiertes Wasser und Wirbel für 5 min. Entsorgen Sie das entionisierte Wasser mit einer Pipette.</li>
			<li>Wiederholen Sie Schritt 1.1.3.4 3x, um alle Bleichmittel abzuspülen. Die Samen vor der Pflanzung in sterilem entionisiertem Wasser einweichen, um das Samenfell zu erweichen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Keimfreier Kohl anbauen HINWEIS: Napa Kohl (B. rapa var pekinensis) werden in Glasröhren (15 cm x 2,5 cm) mit kalziniertem Ton in Murashige und Skoog (MS) Nährbrühe eingeweicht angebaut (Abbildung 1).<ol>
<li>10 g sauberen kalkhaltigen Ton in ein sauberes Glasrohr (15 cm x 2,5 cm) wiegen.</li>
		<li>Bereiten Sie MS-Nährstoffbrühe vor, indem Sie 4,4 g MS-Medium in 1 L entionisiertem Wasser auflösen. Fügen Sie MS-Nährbodenbrühe (ca. 9 ml) zu jedem Glasrohr hinzu, um den kalzinierten Ton mit einer Pipette zu bedecken. HINWEIS: Stehende Flüssigkeit im Rohr verhindert, dass das Saatgut keimt, so dass es notwendig sein könnte, einigen Röhren etwas weniger MS-Brühe hinzuzufügen.</li>
		<li>Lose Kappenglasrohre mit 22 mm Zwei-Wege-Reagenzglaskappen und Autoklaven (121 °C für 60 min). Wenn Sie sie aus dem Autoklaven entfernen, schieben Sie Kappen auf die Glasrohre, um sie zu versiegeln. Vor Gebrauch Rohre auf Raumtemperatur kühlen.</li>
		<li>Legen Sie vorsichtig einen sterilen Kohlsamen in die Mitte jedes Rohres mit sterilen, extralangen (25,4 cm) Zangen. Legen Sie die Rohre in eine 7-Wege-Schale und dann unter Lichtgestellen (Vollspektrum-T5-Leuchtstofflampen oder andere Beleuchtungseinstellungen für das Pflanzenwachstum) mit einem 16-Stunden-Lichtzyklus bei 24 °C. HINWEIS: Samen keimen über Nacht und entwickeln ihr erstes wahres Blatt nach 5 Tagen. Ein wahres Blatt ist das erste Gefäßblatt, nachdem sich die Kotyledonen gebildet haben. Es hat eine eher faltige Kante und in Brassica rapa ist in Trichome bedeckt.</li>
	</ol></li>
	<li>Prüfung auf Sterilität von keimfreiem Kohl HINWEIS: Um zu testen, ob die Kohlsorten keimfrei sind, wählen Sie aus jeder Charge und Platte ein paar Kohlsorten aus, um festzustellen, ob kultische Kolonien vorhanden sind.<ol>
<li>Entfernen Sie den Kohl vorsichtig aus den Glasröhren, indem Sie die Basis der Pflanze mit sterilisierten Zangen greifen und herausziehen. Bevor Sie den Kohl vollständig aus dem Rohr entfernen, schneiden Sie die Wurzeln vorsichtig mit einer sterilisierten Sezierschere ab. Die Kohlblätter in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr verdichten. HINWEIS: Größere Kohlsorten erfordern möglicherweise das Entfernen eines oder zwei der größeren Blätter, während sich der Kohl noch in der Röhre befindet, um es einfacher zu machen, den Kohl in das 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr zu bekommen. Diese größeren Blätter können dem 1,5 ml Rohr hinzugefügt werden, nachdem der Rest des Kohls in das Rohr gelegt wurde, wenn der gesamte Kohl benötigt wird.</li>
		<li>Fügen Sie jedem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr 400 l 1x Phosphatpuffer-Saline (PBS) hinzu. Mit einem sterilen Mikroschädling den Kohl durch 30-faches Schädling sanieren.</li>
		<li>Platte 100 l des Kohls homogenisiert auf Agarplatten, um festzustellen, ob in der Probe Verunreinigungen vorhanden sind. Die meisten Bakterien, die in der Phyllosphäre gefunden werden, wachsen auf tryptischen Sojaplatten (TS). Verwenden Sie breite Öffnungspipettenspitzen beim Plattieren kohlhomogenat, da das Kohlhomogenat dick ist und regelmäßige Pipettenspitzen verstopfen kann.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Inokulation der Phyllosphäre mit mikrobiellen Lösungen
<ol><li>Herstellung von Glycerinvorräten von Impfstämmen HINWEIS: In Tabelle 1 sind die mikrobiellen Isolate aufgeführt, die in diesem Schritt verwendet werden können. Auch andere Phyllosphärenisolate könnten hier verwendet werden.<ol>
<li>Dicht streifen einzelne Kolonien von einem frischen Streifen, auf zwei /drei neue Platten der gleichen Medien, um viele Kolonien zu bekommen.</li>
		<li>Lassen Sie Streifen für 2 bis 5 Tage wachsen, dann kratzen Kolonien von allen Platten in ein 15 ml konisches Rohr mit 15 ml 15% Glycerin, und Wirbel gründlich zu mischen.</li>
		<li>Übertragen Sie ein Aliquot von 1 ml des gut gemischten Glycerinbestands in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und lagern Sie Die Glycerinbestände bei -80 °C bis zur Verwendung. Sparen Sie die restlichen 14 ml Glycerinbestand bei -80 °C, da bei der Impfung von Kohl relativ große Mengen an Impflösung erforderlich sind.</li>
		<li>Eine Woche vor Gebrauch das 1,5 ml-Rohr mit 1 ml Glycerinstock (ab Schritt 2.1.3) auf Eis, verdünnt und platte bei mehreren verschiedenen Verdünnungen (z. B. 10-4, 10-5und 10-6) auftauen, um die Konzentration (koloniebildende Einheit [KBE] pro L) der 14 ml Impflösung zu bestimmen.</li>
	</ol></li>
	<li>Sterilisierende Impfsprayflaschen<ol>
<li>Zerlegen Sie die bernsteinfarbenen runden Boston Pumpenflaschen (59 ml) und tränken Sie alle Komponenten (Pumpe, Rohr, Kappe und Flasche) in 30% Bleichlösung für 30 min in einem großen Kunststoffbehälter mit einem eng anliegenden Deckel.</li>
		<li>Nach dem Einweichen alle Bleichmittel vorsichtig aus dem Behälter gießen, indem Sie nur eine Ecke des Deckels des Behälters heben.</li>
		<li>Spülen Sie die Flaschen, indem Sie den Kunststoffbehälter mit autoklaviertem entionisiertem Wasser (je nach Behältergröße 1 L) befüllen und vorsichtig entionisiertes Wasser ausgießen, indem Sie den Deckel an einer Ecke anheben.</li>
		<li>Sterilisieren Sie einen Biosicherheitsschrank, indem Sie mit 70% Ethanollösung besprühen und das UV-Licht 30 min einschalten. HINWEIS: Setzen Sie diese Arbeit im Biosicherheitsschrank fort, damit keine Gefahr einer mikrobiellen Kontamination der Flaschen besteht, wenn sie lufttrocken sind.</li>
		<li>Entfernen Sie Flaschen aus dem großen Kunststoffbehälter und füllen Sie jede Flasche mit autoklaviertem entionisiertem Wasser mit einer Pipette. Montieren Sie die Pumpen wieder zusammen und legen Sie eine in jede Flasche. Pumpen Sie das entionisierte Wasser durch jede Flasche (10 Sprays pro Flasche), um Bleichmittel aus der Pumpenkomponente der Flasche zu entfernen.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.2.5, um sicherzustellen, dass alle Bleichmittel aus den Glasflaschen entfernt werden.</li>
		<li>Testen Sie, ob Flaschen steril sind, indem Sie eine Nummer auf jede Flasche legen (Laborband an der Seite der Flasche kleben, wenn es vollständig trocken ist), und fügen Sie dann 10 ml 1x PBS zu jeder der Flaschen hinzu und pumpen Sie 3 Sprays auf eine TS-Agarplatte. Nach dem Sprühen die Platten eine Woche bei Raumtemperatur bebrüten. Wenn Kolonien auf einem Teller wachsen, bedeutet dies, dass die jeweilige Flasche nicht steril war und nicht für Experimente verwendet werden sollte.</li>
		<li>Vor der Lagerung der sterilen Flaschen alle verbleibenden PBS entfernen und die Flaschen gründlich im Biosicherheitsschrank trocknen lassen. Bewahren Sie sterile Flaschen in einem sterilen Kunststoffbehälter (in der Regel den Behälter zum Bleichen der Flaschen) bis zur Verwendung auf.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung des mikrobiellen Inokulums und Sprühen von keimfreiem Kohl VORSICHT: Alle Schritte sollten in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt werden, da das Sprühen die mikrobiellen Lösungen aerosolisiert, die Arbeitsflächen kontaminieren oder ein Gesundheitsrisiko darstellen könnten, wenn sie auf einer Laborbank durchgeführt werden. HINWEIS: Kohl bildet nach 5 Tagen echte Blätter, daher ist es ratsam, eine Woche nach der Pflanzung des Kohls zu warten, bevor er mit mikrobiellen Lösungen impfen kann. Da die Rohre versiegelt sind, besteht keine Notwendigkeit, den Kohl zu wässern. Experimente werden am besten innerhalb eines Monats nach der Pflanzung durchgeführt, da die kleinen Röhren das Wachstum des Kohls einschränken.<ol>
<li>Glycerinvorräte auf Eis auftauen und in 1x PBS auf die gewünschte Impfkonzentration verdünnen (Konzentration durch Auftauen und Plattieren eines 1 ml Aliquot in Schritt 2.1.4 bestimmt). HINWEIS: Es können verschiedene Impfstufen verwendet werden, aber Phyllosphärenisolate können innerhalb von 10 Tagen von 104 bis 108 KBE/ml Kohlschlämme wachsen.</li>
		<li>Fügen Sie 10 ml verdünnten Glyzerinbestand in die sterile Pumpenflasche und pumpen Sie 5 Sprays in ein großes Abfallsammelbecher, um restliche PBS aus der Flaschenpumpenkomponente zu entfernen.</li>
		<li>Entfernen Sie den Deckel aus dem Kohlrohr, neigen Sie den Kohl in Richtung der Sprühflasche und sprühen Sie jeden Kohl mit 3 Pumpen der Impflösung, die für inokulum 600 l liefert.</li>
		<li>Nach der Impfung eine Teilmenge der Kohlsorten ernten, um die tatsächliche Inokulationskonzentration zu bewerten. Entfernen Sie den Kohl aus einem Rohr mit sterilisierten Zangen. Schneiden Sie die Wurzeln mit einer sterilen Sezierschere ab und legen Sie den Kohl vorsichtig in ein vorgewogenes steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Zeichnen Sie das Gewicht des Kohls für zukünftige Berechnungen auf, wenn KBE/g Kohl für Berechnungen erforderlich ist.</li>
		<li>Fügen Sie 400 l 1x PBS zu jedem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit Kohl hinzu und verwenden Sie ein steriles Mikropestle, um den Kohl in die 1x PBS zu homogenisieren, indem er ihn 30x mahlt.</li>
		<li>Kohl homogenisieren (falls erforderlich) und die geponte Kohlmischung verdünnen. Verwenden Sie breite Öffnungsspitzen zum Pipetieren der Kohlschlämme, da sie dick und voller pflanzlicher Gewebestücke sein wird.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Zubereitung steriler Pflanzenextrakt
HINWEIS: Diese Methode ist eine modifizierte Version der Kohl sterilen Medienproduktion18,19.
<ol><li>Kaufen Sie einen Kohl im Supermarkt. Entfernen und entsorgen Sie im Labor die äußersten Blätter des Kohls. Schneiden Sie den restlichen Kohl, um in einen Mixer zu passen und homogenisieren Kohl zu einem feinen Fruchtfleisch, d.h. der Kohl wird nicht feiner mit weiterer Mischung. HINWEIS: Jeder Mixer, der Kohl zu einem glatten homogenen Fruchtfleisch hacken kann, sollte für diese Methode geeignet sein.</li>
	<li>Den gemischten Kohl homogenieren und 2 ml destilliertes Wasser pro Gramm Kohl hinzufügen. Filtern Sie die gemischte Kohlschlämme durch 2 Schichten Korbkaffeefilter (ungebleichtes Papier).</li>
	<li>Die Kohlschlämme in Zentrifugenröhrchen geben (die Größe ist abhängig von der Zentrifuge). Zentrifugieren Sie die gefilterte Kohlschlämme bei 20.000 x g für 20 min, bis sich große Partikel aus der Lösung absetzen. HINWEIS: Es ist wichtig, die Kohlschlämme für einen langen Zeitraum zu zentrieren, da Kohlpartikel den Filtersterilisator schnell verstopfen.</li>
	<li>Mit einer serologischen Pipette, entfernen Sie den Überstand aus den pelleted Kohl Schutt, um darauf zu achten, den Pellet Kohl nicht zu stören. Wenn Ziel der Wiederherstellung von Fermentationsbedingungen, unter denen Standardsalzkonzentrationen verwendet werden, 2% w/v NaCl bei diesem Schritt hinzufügen (d. h. vor der Filtersterilisation).</li>
	<li>Filter sterilisieren Sie den Pflanzenextrakt mit einem 0,2 m-Filter (500 ml oder 1 L), der an einem Vakuum befestigt ist. In sterile Schläuche (entweder 50 ml Zentrifugenrohre oder 15 ml Zentrifugenrohre) geben und bei -80 °C einfrieren, bis sie verwendet werden.</li>
</ol>4. Impfung von sterilem Pflanzenextrakt
<ol><li>SVE auftauen und 490 l in 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre geben. Verwenden Sie genügend Rohre, um mindestens fünf Replikationen pro Behandlung pro Zeitpunkt zu haben, da jede Zeitpunktmessung destruktiv ist.</li>
	<li>Glycerinbestände an mikrobiellen Isolaten auf Eis auftauen und mit 1x PBS auf die gewünschte Konzentration verdünnen. Die Konzentration von Milchsäurebakterien kann bis zu 5.000 KBE pro ml SVE betragen. Um diese Konzentration zu erreichen, werden die Lagerbestände auf 250 KBE/L verdünnt, da 10 l für die Impfung mit einem Gesamtvolumen von 500 l verwendet werden.</li>
	<li>Impfen Sie SVE mit 10 l verdünntem mikrobiellem Isolat. Pipette ein paar Mal rauf und runter, um gründlich zu mischen. Bei gewünschter Temperatur inkubieren (14 °C für Kimchi-Produktionstemperatur oder 24 °C für wärmste Sauerkrautfermentation).</li>
	<li>Messen Sie die Wachstumsrate des mikrobiellen Isolats im SVE, indem Sie replizierte Rohre am Tag 1, Tag 2, Tag 4, Tag 7 und Tag 14 ernten. HINWEIS: Die Gärung verläuft von Anfang an schnell und verlangsamt sich mit der Zeit. Daher gibt mehr Anfangszeitpunkte eine größere Lösung für die Dynamik des Fermentationsverlaufs.</li>
	<li>Mischen Sie den geimpften SVE zu jedem Zeitpunkt gut, indem Sie ein paar Mal auf und ab pfeifen. Den geimpften SVE in 1x PBS und Platte auf Agarplatten seriell verdünnen. Inkubieren Sie die Agarplatten für 4 bis 7 Tage, bevor Sie Kolonien zählen. HINWEIS: Mann, Rogosa und Sharpe (MRS) Agar sollte verwendet werden, um alle Milchsäurebakterien aufzuzählen, Hefe Pepton-Dextrose (YPD) sollte für Hefe verwendet werden, und TS-Agar für die meisten anderen Bakterienisolate aus der Phyllosphäre.</li>
	<li>Zeichnen Sie den pH-Wert der Proben zu jedem Zeitpunkt mit einer Mikro-pH-Sonde auf. HINWEIS: Dieser Schritt sollte nach der Beschichtung durchgeführt werden, da die pH-Sonde Zellen zwischen Röhren/Behandlungen überträgt.</li>
</ol>

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<li>Wuyts, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carrot+Juice+Fermentations+as+Man-Made+Microbial+Ecosystems+Dominated+by+Lactic+Acid+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Carrot Juice Fermentations as Man-Made Microbial Ecosystems Dominated by Lactic Acid Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (12), AEM.00134(2018).</li>
<li>Niu, B., Paulson, J. N., Zheng, X., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+and+representative+bacterial+community+of+maize+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Simplified and representative bacterial community of maize roots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2450-E2459 (2017).</li>
<li>Steinkraus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactic+acid+fermentation+in+the+production+of+foods+from+vegetables%2C+cereals+and+legumes%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Lactic acid fermentation in the production of foods from vegetables, cereals and legumes.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 49 (3), 337-348 (1983).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Keimfreie Napa-Kohlpflanzen wurden verwendet, um die Dispersionsbeschränkung von Milchsäurebakterien in der Napa Kohlphyllosphäre17zu untersuchen. Keimfreie Napa-Kohlsorten können auch verwendet werden, um individuelles oder paarweises Wachstum in der Phyllosphäre zu testen (Abbildung 1). Methoden zur Herstellung von sterilem Pflanzenextrakt wurden für drei verschiedene Kohlsorten getestet: Rot, Grün und Napa. Jede dieser SVE fungiert als zuverlässiges Wachstumsmedium...

Die mikrobielle Vielfalt der Phyllosphäre spielt eine wichtige Rolle bei der Erhaltung der Pflanzengesundheit und kann auch die Fähigkeit von Pflanzen beeinflussen, Umweltbelastungen zu widerstehen1,2,3,4,5. Die Gesundheit der Kulturen wiederum wirkt sich direkt auf die Lebensmittelsicherheit und die Qualität6,7aus. Pflanzen spielen eine Rolle bei der Funktionsweise des Ökosystems und die damit verbundenen Mikrobiome beeinflussen sowohl die Fähigkeit der Pflanzen, diese Aktivitäten durchzuführen, als auch die Umwelt selbst direkt zu beeinflussen8. Während Wissenschaftler begonnen haben, die Funktion und Zusammensetzung der Phyllosphäre zu entschlüsseln, werden die ökologischen Prozesse, die die mikrobielle Gemeinschaft der Phyllosphäre beeinflussen, nicht vollständig verstanden9,10. Das Phyllosphärenmikrobiom ist ein ausgezeichnetes experimentelles System zur Erforschung der Ökologie von Mikrobiomen11. Diese Communities sind relativ einfach und viele der Community-Mitglieder können auf Standard-Labormedien10,12,13angebaut werden.
Fermentiertes Gemüse ist ein System, bei dem die Gemeinschaftsstruktur der Phyllosphäre wichtige Folgen hat. Sowohl im Sauerkraut als auch in der Kimchi dienen die Mikroben, die natürlicherweise auf gemüseblättern (der Phyllosphäre der Brassica-Arten) vorkommen, als Inokulum für die Fermentation14,15. Milchsäurebakterien (LAB) gelten als allgegenwärtige Mitglieder pflanzlicher Mikrobiome, können aber in der Phyllosphäre16in geringem Überfluss vorhanden sein. Starke abiotische Selektion während der Fermentation treibt eine Verschiebung der mikrobiellen Gemeinschaftszusammensetzung, die es Milchsäurebakterien ermöglicht, in Hülle und Fülle zu zunehmen. Während LAB wächst, produzieren sie Milchsäure, die die saure Umgebung von fermentierten pflanzlichen Produkten17 schafft. Die Verbindung zwischen phyllosphere und ferment bietet die Möglichkeit, Gemüse als Modell zu verwenden, um zu verstehen, wie Mikrobiome strukturiert sind.
Wir haben Methoden entwickelt, um keimfreie Napa-Kohlsorten anzubauen und sie mit speziellen mikrobiellen Gemeinschaften mit Sprühflaschen zu impfen. Dies ist eine kostengünstige und zuverlässige Methode, um den Kohl gleichmäßig mit einzelnen Mikroben oder gemischten Gemeinschaften zu impfen. Ein steriler Gemüseextrakt (SVE) wurde auch aus drei verschiedenen Kohlsorten/Sorten entwickelt: Rot- und Grünkohl (Brassica oleracea) und Napa Kohl (B. rapa). Die Zugabe von Salz zu diesen SVEs repliziert die Fermentationsumgebung und ermöglicht kleine und relativ hochdurchsatzige experimentelle Studien der Fermentationsmikrobiom-Montage. Diese Methoden können verwendet werden, um die mikrobielle Gemeinschaftsmontage in der Phyllosphäre zu untersuchen und wie die mikrobielle Gemeinschaftsdynamik in der Phyllosphäre mit dem Erfolg der pflanzlichen Fermentation in Verbindung gebracht werden kann.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>VWR</td><td>20170-650</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konische Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>7-Wege-Tablett</td><td>Sigma Magenta</td><td>T8654</td><td></td></tr><tr><td>Bernsteinfarbene runde Boston Glasflasche</td><td></td><td>GPS 712OZSPPK12BR</td><td>Bestellt am Amazon.com von verschiedenen Lieferanten</td></tr><tr><td>Warenkorb Kaffeefilter</td><td>Wenn Sie sich dafür interessieren</td><td></td><td>(ungebleichtes Papier) Gekauft von Wholefoods</td></tr><tr><td>Bleach (quecksilberfrei)</td><td>Austin's</td><td>50-010-45</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikatglasröhren</td><td>VWR</td><td>47729-586</td><td></td></tr><tr><td>Kalzinierte Tonerde</td><td>Turface</td><td>MVP</td><td>Bestellt am Amazon.com von Root Naturally 6 Quart Bags. Partikelgröße ca. 3-5 mm</td></tr><tr><td>Cuisinart Mixer</td><td>Cuisinart</td><td></td><td>Cuisinart Mini-Prep Plus Küchenmaschine, 3-Tassen-Sezierschere</td></tr><tr><td></td><td>7-389-A</td><td>American Educational Products</td><td>Bestellt auf Amazon.com</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>89125-172</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Aven</td><td>18434</td><td>Bestellt auf Amazon.com</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>KleenGuard M10</td><td>Kimberley-Clark</td><td>64240</td><td></td></tr><tr><td>Großer Kunststoffbehälter</td><td>Rubbermaid</td><td></td><td>Bestellt bei Amazon.com</td></tr><tr><td>Light Racks</td><td>Gardner's Supply</td><td>39-357</td><td>Vollspektrum T5 Leuchtstofflampen</td></tr><tr><td>Magenta tm 2-Wege-Kappen</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1934</td><td></td></tr><tr><td>Man, Rogosa und Sharpe</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0881-17-5</td><td>Dieses Medium ist für Brühe und 15 g Agar werden zur Herstellung von Platten hinzugefügt</td></tr><tr><td>Mikro-pH-Sonde</td><td>Thermo Scientific</td><td>8220BNWP</td><td></td></tr><tr><td>Micropestle</td><td>Carolina</td><td>215828</td><td>Auch Pellet Stößel</td></tr><tr><td>MS Nährstoffbrühe</td><td>genannt Millipore Sigma</td><td>M5519</td><td>Murashige und Skoog Basal Medium</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Napa-Kohlsamen</td><td>Johnny's Select Seeds</td><td>2814G</td><td>B. rapa var pekinensis (Bilko)</td></tr><tr><td>Petrischale 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>Zur Herstellung von Agarplatten</td></tr><tr><td>Phosphatpuffer-Kochsalzlösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-842-941</td><td>Teknova</td></tr><tr><td>Pflanzengewebekulturbox</td><td>Sigma</td><td>Magenta GA-7</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipetten</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>Steriler Dübel</td><td>Puritan</td><td>10805-018</td><td>Autoklav vor Gebrauch zum</td></tr><tr><td>Sterilisieren Sterilisieren 0,2 & Mikro; m Filter</td><td>Nalgene</td><td>974103</td><td></td></tr><tr><td>Tryptisches Soja-Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0370-17-3</td><td>Dieses Medium ist für Brühe und 15 g Agar werden zur Herstellung von Platten hinzugefügt</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen mit breiter Öffnung</td><td>Rainin</td><td>17007102</td><td></td></tr><tr><td>Hefe, Pepton und Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0428-17-5</td><td>Dieses Medium ist geeignet, aber es können auch Medien mit Hefe, Pepton und Dextrose hergestellt werden, fügen Sie 15 g Agar hinzu, wenn Sie Platten herstellen</td></tr></tbody></table>

ein gnotobiotisches system zur untersuchung der mikrobiom-montage in der phyllosphäre und in der gemüseischen fermentation

A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation

Die Phyllosphäre, der oberirdische Teil der Pflanze, der von Mikroben besiedelt werden kann, ist ein nützliches Modellsystem, um Prozesse der mikrobiellen Gemeinschaftsmontage zu identifizieren. Dieses Protokoll skizziert ein System zur Untersuchung der mikrobiellen Gemeinschaftsdynamik in der Phyllosphäre von Napa-Kohlpflanzen. Es beschreibt, wie keimfreie Pflanzen in Reagenzgläsern mit einem kalzinierten Ton- und Nährboden anwachsen. Die Impfung von keimfreien Pflanzen mit spezifischen mikrobiellen Kulturen bietet Möglichkeiten, das mikrobielle Wachstum und die Gemeinschaftsdynamik in der Phyllosphäre zu messen. Durch die Verwendung von sterilem Pflanzenextrakt aus Kohl können auch Verschiebungen in mikrobiellen Gemeinschaften, die während der Fermentation auftreten, bewertet werden. Dieses System ist relativ einfach und kostengünstig im Labor einzurichten und kann verwendet werden, um wichtige ökologische Fragen in der mikrobiellen Gemeinschaftsversammlung zu behandeln. Es bietet auch Möglichkeiten zu verstehen, wie die Zusammensetzung der Phyllosphärengemeinschaft die mikrobielle Vielfalt und Qualität der pflanzlichen Fermentationen beeinflussen kann. Dieser Ansatz zur Entwicklung von gnotobiotischen Kohlphyllosphärengemeinschaften könnte auf andere wilde und landwirtschaftliche Pflanzenarten angewendet werden.

Wachstumsraten von Napa-Kohl Die Samensterilisationsmethode wurde mit mehreren verschiedenen Napa Kohlsorten getestet (B. rapa var pekinese; Ergänzende Abbildung 1) von einer Reihe von verschiedenen Lieferanten und alle wuchsen konsequent mit ähnlichen Wachstumsraten. Jedoch, Testen der Methoden mit verschiedenen Arten von Brassica (B. rapa: Rüben lila Top; B. oleracea: Cairo Hybrid, Tropic Giant Hybrid; B. campe...

Es wurde eine Methode entwickelt, keimfreie Napa-Kohlsorten anzubauen, die es Forschern ermöglicht, zu bewerten, wie einzelne mikrobielle Arten oder mikrobielle Gemeinschaften mit mehreren Arten auf Kohlblattoberflächen interagieren. Es wird auch ein steriler Pflanzenextrakt präsentiert, der zur Messung von Verschiebungen in der Zusammensetzung der Gemeinschaft während der Gemüsegärung verwendet werden kann.

Ein gnotobiotisches System zur Untersuchung der Mikrobiom-Montage in der Phyllosphäre und in der gemüseischen Fermentation

The phyllosphere, the above ground portion of the plant that can be colonized by microbes, is a useful model system to identify processes of microbial ...

Mit diesem Protokoll können wir wichtige Fragen beantworten, wie Mikroben sich in der Phyllosphäre zusammensetzen und interagieren. Es hat den zusätzlichen Vorteil, dass wir durch die Verwendung des sterilen Pflanzenextrakts die Struktur der Phyllo-Sphärengemeinschaften mit ihrer Funktion während der gemüselichen Gärung verknüpfen können. Diese Techniken ermöglichen es Wissenschaftlern, zu testen, wie Mikroben in der Phyllo-Sphäre interagieren, und dann zu verfolgen, wie diese Phyllo-Sphärengemeinschaften die Fermentation beeinflussen können.Um die Kohlsamen an die Oberfläche zu sterilisieren, beginnen Sie mit 100 Samen in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie einen Milliliter 70% Ethanol in die Röhre und wirbeln Sie es für fünf Minuten. Verwenden Sie dann eine Pipette, um das Ethanol zu entsorgen.Fügen Sie einen Milliliter 50% Bleichmittel und Wirbel das Rohr für fünf Minuten, dann entsorgen Sie die Bleiche. Spülen Sie die Samen viermal, indem Sie einen Milliliter autoklaven entionisiertes Wasser hinzufügen, das die Röhre durchwirbelt, und dann das Wasser entsorgen. Nach der letzten Spülung die Samen in sterilisiertem entionisiertem Wasser zwei bis acht Stunden einw

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Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Quelle: Nathoo, N., et al. Ein hydroponisches Co-Kultivierungssystem zur gleichzeitigen und systematischen Analyse der molekularen Interaktionen und Signalwege von Pflanzen und Mikroben. J. Vis. Exp. (2017).Dieses Video zeigt ein hydroponisches Co-Kultivierungssystem zur Untersuchung von Pflanzen-Bakterien-Interaktionen unter sterilen Bedingungen. Die Pflanzensämlinge werden in ein steriles, saures Wachstumsmedium überführt, inkubiert und auf Kontamination untersucht, bevor sie mit...

Ein Co-Kultivierungssystem zur Untersuchung der molekularen Reaktionen von pflanzlichen Wirten und interagierenden Bakterien

Das beschriebene hydroponische Kokultivierungssystem unterstützt intakte Pflanzen mit Metallgittersieb und kokultiviert sie mit Bakterien. Pflanzengewebe, Bakterien und sezernierte Moleküle können dann separat für nachgeschaltete Analysen geerntet werden, wobei gleichzeitig die molekularen Reaktionen sowohl der Pflanzenwirte als auch der interagierenden Mikroben oder Mikrobiome untersucht werden können.

Ein Hydroponisches Co-Kultivierungssystem zur gleichzeitigen und systematischen Analyse von Pflanzen- / Mikroben-Molecular-Wechselwirkungen und Signalgebung

Dieser Artikel beschreibt ausführliche Protokolle für die Ökosystem-Herstellung von Geräten (EcoFABs), die das Studium der Pflanzen und Pflanzen-Mikroben-Interaktionen in hohem Grade kontrollierten Laborbedingungen ermöglichen.

Ökosystem-Herstellung (EcoFAB)-Protokolle für den Bau von Labor Ökosysteme entwickelt, um die Pflanze-Mikroben Interaktionen zu untersuchen

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Amplikons Sequenzdaten von Boden, Rhizosphäre und Wurzel Endosphere mikrobiome zu erhalten. Diese Informationen kann verwendet werden, um die Zusammensetzung und Vielfalt der Anlage verbundenen mikrobieller Gemeinschaften zu untersuchen, und eignet sich für den Einsatz mit einer Vielzahl von Pflanzenarten.

Die Wurzel Mikrobiom zu erkunden: Extrahieren von Bakteriengemeinschaft Daten aus dem Boden, die Rhizosphäre und die Wurzel Endosphere

Ausgrabung der Pflanzenwurzeln aus dem Bereich sowie Verarbeitung von Proben in Endosphere, Rhizosphäre und Boden sind im Detail beschrieben, einschließlich DNA-Extraktion und Analyse-Methoden. Dieses Papier soll anderen Labors, diese Techniken für die Untersuchung von Böden, Endosphere und Rhizosphäre mikrobiome zu ermöglichen.

Isolierung und Analyse der mikrobiellen Lebensgemeinschaften im Boden, Rhizosphäre und Wurzeln in mehrjährige Grass Experimente

Hier beschreiben wir einen hydroponischen Pflanzenwachstumstest zur Quantifizierung des Artenvorkommens und zur Visualisierung der räumlichen Verteilung von Bakterien während der anfänglichen Besiedlung von Pflanzenwurzeln und nach deren Übertragung in verschiedene Wachstumsumgebungen.

Überwachung der bakteriellen Kolonisation und Erhaltung von Arabidopsis thaliana Roots in einem schwimmenden Hydroponischen System

Kompost-Mikrokosmen bringen die mikrobielle Vielfalt der Natur ins Labor, um die Mikrobiomforschung bei Caenorhabditis elegans zu erleichtern. Hier sind Protokolle für den Aufbau von Mikrokosmos-Experimenten, wobei die Experimente die Fähigkeit demonstrieren, die mikrobielle Vielfalt der Umwelt zu modulieren, um die Beziehungen zwischen der mikrobiellen Vielfalt der Umwelt und der Zusammensetzung des Mikrobioms des Wurmdarms zu untersuchen.

Kompostmikrokosmen als mikrobiell vielfältige, naturähnliche Umgebungen für die Mikrobiomforschung bei Caenorhabditis elegans

Wir stellen ein Protokoll für ein glasbasiertes, semihydroponisches Versuchssystem vor, das das Wachstum einer Vielzahl von phylogenetisch unterschiedlichen Pflanzen mit oder ohne Mikroben unterstützt. Das System ist mit verschiedenen Nährmedien kompatibel und ermöglicht eine zerstörungsfreie Wurzelexsudatprobenahme für die nachgelagerte Analyse.

Ein vielseitiges Glasgefäßsystem für die semihydroponische Profilierung von Wurzelexsudat

Wir schlagen ein optimiertes Rasterelektronenmikroskopie-Protokoll vor, um sehr heterogene und empfindliche Proben zu visualisieren, die pflanzliche und pilzliche Biomasse zusammen mit Mikrobiota und Biofilm enthalten. Dieses Protokoll ermöglicht es, die räumlichen Dimensionen der Mikrobiota-Organisation zu beschreiben.

Mikrobiota von Attinanameisengärten: Visualisierung einer mikrobiellen Landschaft mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt den Zusammenbau von Mini-Bioreaktor-Arrays, die für die kontinuierliche Durchflusskultur komplexer Stuhlgemeinschaften unter anaeroben Bedingungen verwendet werden sollen. Wir besprechen auch die Methoden für den Zusammenbau, die Inokulation und die Probenahme der Reaktoren für die weitere Analyse.

Bioreaktor-Assemblierung für die kontinuierliche Kultivierung komplexer Stuhlgemeinschaften

Erfahren Sie, wie Sie keimfreie Napa-Köpfe züchten, um mikrobielle Interaktionen in der Phyllosphäre zu untersuchen. Diese Methode verknüpft Gemeinschaftsstruktur mit Fermentationsfunktion.

Ein gnotobiotisches System zur Untersuchung der Mikrobiom-Montage in der Phyllosphäre und in der gemüseischen Fermentation

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