Ein Hochdurchsatz-Elektrochemilumineszenz-7-Plex-Assay zum gleichzeitigen Screening auf Typ-1-Diabetes und mehrere Autoimmunerkrankungen
29. Mai 2020
Wir modellieren einen einfachen Multiplex-ECL-Assay, der 7 Autoantikörper-Assays miteinander kombiniert. Der Test ist in der Lage, gleichzeitig auf T1D und mehrere andere Autoimmunerkrankungen zu untersuchen, einschließlich Zöliakie, Autoimmunerkrankungen der Schilddrüse und autoimmunes polyglanduläres Syndrom 1.
Der Elektrochemilumineszenz-Assay kann gleichzeitig auf Typ-1-Diabetes und andere relevante Autoimmunerkrankungen untersuchen, einschließlich Autoimmun-Kryo-Krankheit, Zöliakie und autoimmunes polyglanduläres Syndrom-1. Der sehr komplexe ECR-Assay kombiniert bis zu 10 Mehrfach-Antikörper-Assays in einer einzigen Vertiefung, was zu einem hohen Durchsatz, weniger Bibliotheken und einem kostengünstigeren Assay führt, der ein geringeres breites Volumen erfordert. Das Verfahren wird von Xiaofan Jia, einem Beitrag aus meinem Labor, demonstriert.
Um eine gemischte Linker-gekoppelte Antigenlösung herzustellen, wählen Sie zunächst die optimale Konzentration für jedes Antigen auf der Grundlage des Schachbrett-Assays aus und verdünnen Sie das mit Biotin und Ruthenium markierte Antigen auf die rationale Arbeitskonzentration. Um verschiedene Linker an jedes der einzigartig biotinylierten Antigene zu binden, mischte man für einen 96-Well-Play-Assay 240 Mikroliter eines geeigneten STREPTAVIDIN-konjugierten Linkers mit 4 Mikrolitern der biotinylierten Proteine von Interesse. Fügen Sie dann 156 Mikroliter 1%BSA pro Röhrchen hinzu und inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Am Ende der Inkubation geben Sie 160 Mikroliter Stopplösung in jedes Röhrchen und inkubieren Sie die Röhrchen weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation entnehmen Sie 400 Mikroliter linkergekoppeltes Antigen aus jedem Röhrchen und ziehen Sie alle sieben Antigensuspensionen in ein einziges Röhrchen. Fügen Sie dann 1,2 Milliliter Stopplösung und 4 Mikroliter Ru-Sulfo-NHS-markiertes GAD65, TPO, tTg, ThG, Proinsulininterferon-alpha und IA-2-Antigen zu der Mischung hinzu.
Vor der Inkubation von Serumproben mit der markierten Antigenmischung fügen Sie 15 Mikroliter Serum pro Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte hinzu und mischen Sie 18 Mikroliter 0,5 molare saure Säure mit jeder Vertiefung Serum für eine 45-minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Während der Inkubation fügen Sie 35 Mikroliter Antigen und 13 Mikroliter einen molaren Tris-Puffer pro Vertiefung einer neuen 96-Well-PCR-Platte hinzu. Am Ende der Inkubation werden sofort 25 Mikroliter des mit Säure behandelten Serums in jede Vertiefung der Antigenplatte gegeben.
Decken Sie die Platte mit PCR-Deckenfolie ab und legen Sie die Platte eine Stunde lang bei niedriger Geschwindigkeit bei Raumtemperatur auf einen Shaker. Stellen Sie die Platte am Ende der Inkubation 18 bis 24 Stunden lang bei 4 Grad Celsius auf. Nehmen Sie die Platte aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie auf Zimmertemperatur kommen.
Geben Sie dann 150 Mikroliter 3%Blocker A-Puffer in jede Vertiefung. Wenn alle Vertiefungen behandelt wurden, decken Sie die Platte mit Deckenfolie ab und stellen Sie die Platte über Nacht in einen Kühlschrank bei 4 Grad Celsius. Drehen Sie die Platte am nächsten Morgen um und waschen Sie die Proben dreimal mit 150 Mikrolitern PBS-T pro Vertiefung und Waschgang.
Tupfen Sie die Platte ab, bis kein Puffer mehr in einer der Vertiefungen verbleibt. Geben Sie 30 Mikroliter Serumantigen-Inkubat in jede Vertiefung. Wenn alle Inkubaten hinzugefügt wurden, decken Sie die Platte mit Folie ab und stellen Sie die Platte eine Stunde lang bei niedriger Geschwindigkeit bei Raumtemperatur auf einen Schüttler.
Entfernen Sie am Ende der Inkubation die Inkubaten durch Schnippen und waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit 150 Mikrolitern PBS-T pro Vertiefung, wie gezeigt. Geben Sie nach dem letzten Waschen 150 Mikroliter Lesepuffer in jede Vertiefung und lesen Sie die Platte auf einem Plattenlesegerät in Zählungen pro Sekunde ab. In dieser Analyse einer großen Kohorte von Proben von 1026 neu diagnostizierten Typ-1-Diabetes-Patienten wurden die Spiegel von Autoantikörpern aus einem Elektrolumineszenz-Assay mit sieben plus mit den Werten aus jedem entsprechenden etablierten Elektrolumineszenz-Assay und aus jedem entsprechenden Einzelstandard-Radiobindungsassay und ELISA verglichen.
Die Assay-Spezifitäten waren am 99. Perzentil für alle Autoantikörper-Assays identisch, mit Ausnahme der Schilddrüsen-Autoantikörper, für die das 95. Perzentil verwendet wurde. Eine kleine Anzahl von diskordanten Proben für jeden der sieben Autoantikörper wurde um die Grenze der Cutoffs für jeden Assay gefunden. Hier können die entsprechenden Daten für 1022 gesunde Kontrollen für jeden Assay beobachtet werden.
Das Wichtigste, woran Sie denken sollten, ist, einen anderen Linker für jedes der einzigartig biotinylierten Antigene zu finden und jedes Antigen mit den Eigenschaften zu mischen, die einen konjugierten Linker liefern. Diese Assay-Technik wird es Forschern ermöglichen, das Screening auf mehrere Autoimmunerkrankungen gleichzeitig in großen Populationen zu planen, und es Kliniken ermöglichen, mehrere relevante Krankheiten mit Typ-1-Diabetes einfach zu screenen.
Übersicht
Diese Studie stellt einen multiplexierten Elektrochemilumineszenz-(ECL)-Assay vor, der eine gleichzeitige Untersuchung auf Typ-1-Diabetes und verschiedene autoimmune Erkrankungen ermöglicht. Der Assay kombiniert mehrere Autoantikörpertests in einer einzelnen Mulde, wodurch die Effizienz gesteigert und die Kosten gesenkt werden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Autoimmunität
- Diagnostik
- Elektrochemilumineszenz-Assays
Hintergrund
- Typ-1-Diabetes (T1D) ist häufig mit anderen Autoimmunerkrankungen assoziiert.
- Traditionelle Tests können mehrere Einzelanalysen erfordern, was Zeit und Kosten erhöht.
- Multiplexanalysen können den diagnostischen Prozess vereinfachen.
- Die Elektrochemilumineszenz bietet eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines multiplexierten ECL-Assays zum Screening von Typ-1-Diabetes und verwandten Autoimmunerkrankungen.
- Vergleich der Leistung des multiplexierten Assays mit etablierten Einzelassays.
- Ermöglichung von großangelegten Screenings in klinischen Anwendungen.
Verwendete Methoden
- Herstellung von gemischten, linker-gekoppelten Antigenlösungen.
- Inkubation von Serumproben mit markierten Antigenen.
- Verwendung eines 96-Loch-Plattenformats für das Hochdurchsatz-Screening.
- Vergleich der Autoantikörperspiegel bei T1D-Patienten und gesunden Kontrollpersonen.
Hauptergebnisse
- Der multiplexierte Assay zeigte eine vergleichbare Spezifität wie Einzelassays.
- Identifizierte eine geringe Anzahl diskordanter Proben nahe der Cut-off-Schwelle.
- Lieferte Daten für eine große Kohorte neu diagnostizierter T1D-Patienten.
- Ermöglichte eine effiziente Screening-Untersuchung auf mehrere autoimmune Erkrankungen.
Schlussfolgerungen
- Der multiplexe ECL-Assay ist ein geeignetes Werkzeug für die gleichzeitige Untersuchung.
- Diese Methode kann die diagnostische Effizienz in der klinischen Praxis verbessern.
- Weitere Validierungen in größeren Populationen werden empfohlen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die gleichzeitige Detektion mehrerer Autoantikörper in einem einzelnen Well überwindet einen kritischen Engpass bei der großflächigen Screening von Autoimmunerkrankungen, wodurch der Assayaufwand und der Ressourcenverbrauch reduziert werden. Dieser multiplexe elektrochemilumineszente Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit bei der frühen Erkennung von Erkrankungen, indem korrelierte Biomarker-Signale für Typ-1-Diabetes und assoziierte Autoimmunerkrankungen bereitgestellt werden. Der Assay unterstützt die Portfolio-Priorisierung und die mechanistische Risikominimierung in der Entwicklung von Immuntherapien, indem eine effiziente Patientenstratifizierung anhand von Multi-Autoantikörper-Profilen ermöglicht wird.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Korrelation von Autoantikörper-Clustern mit Krankheits-Endotypen in präklinischen Modellen.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch funktionelle Validierung antigenspezifischer Immunantworten in krankheitsrelevanten Systemen.
- Prädiktiver Wert: Steigert die Sicherheit bei der Zielstrukturauswahl, indem Patientensubgruppen mit konvergenten Autoantikörper-Signaturen identifiziert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erstellt standardisierte, quantitative Biomarker-Panels für nachgeschaltete Screening-Kampagnen, die hohe Reproduzierbarkeit erfordern.
- Operativer Wert: Gewährleistet Einsatzbereitschaft durch immobilisierte Antigen-Linker-Komplexe, die eine konsistente Bindung in flüssiger Phase über alle Mulden hinweg sicherstellen.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform zum Screening von bis zu 10 Autoantikörpern pro Mulde und erhöht so die Durchsatzleistung, ohne dass eine Umformatierung erforderlich ist.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Ermöglicht die Abstimmung mit krankheitsrelevanten Systemen, indem Autoantikörper erfasst werden, die mit dem klinischen Fortschreiten von Typ-1-Diabetes und komorbiden autoimmunen Erkrankungen assoziiert sind.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen durch Identifizierung von Patienten mit hochpenetranten Autoantikörperprofilen, die eine Multiorgan-Autoimmunität vorhersagen.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Verringert die Uneindeutigkeit bei der Interpretation immunologischer Mechanismen durch gleichzeitige Messung von Autoantikörpern gegen Inselzellen, Schilddrüse, Darm und Interferonsignalwege.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Assay fungiert als Brücke von der Entdeckung zur translationellen Anwendung und ermöglicht ein frühes Immun-Phenotyping, das die Identifizierung von Leitverbindungen sowie die präklinische Validierung durch multiplexe Autoantikörper-Profilierung unterstützt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem sie Muster der Ko-Expression von Autoantikörpern mit pathogenen Wegen bei der Entstehung von Autoimmunerkrankungen verknüpft.
- Screening: Liefert quantitative, reproduzierbare Ergebnisse, die den Vergleich von Immunantworten unter verschiedenen Behandlungsbedingungen oder genetischen Hintergründen ermöglichen.
- Analytik: Bietet normalisierte Zählraten pro Sekunde als Messgröße, die statistische Vergleiche der Autoantikörperspiegel zwischen Patienten- und Kontrollkollektiven ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Übertragung, indem Biomarker-Panels in menschlichen Proben validiert werden, die einer krankheitsassoziierten immunologischen Dysregulation entsprechen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Immunoassay-Plattform, die über die ursprüngliche 7-Plex-Konfiguration hinaus auf andere Autoimmun- oder entzündliche Erkrankungspanels anpassbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem falsch-negative Ergebnisse durch gleichzeitige Messung von Autoantikörpern reduziert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert Standardisierung und Reproduzierbarkeit, indem Variabilität zwischen den Wells durch immobilisierte Antigenpräsentation eliminiert wird.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitaleffizienz, indem sieben diagnostische Tests in einen einzigen Arbeitsschritt integriert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung therapeutischer Kandidaten basierend auf biomarkerdefinierten Patientenpopulationen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Gestaltung von Immunoassays und der Linkerchemie zur Antigen-Immobilisierung.
- Benötigt einen Plattenreader, der Elektrochemilumineszenz-Detektion im 96-Loch-Format ermöglicht.
- Erfordert die Standardisierung von Blockier- und Waschprotokollen über verschiedene Standorte hinweg bei multizentrischen Studien.
- Erfordert die Anpassung der Antigenkonzentrationen, wenn die Methode auf neue Autoantikörper-Ziele über die ursprünglichen sieben hinaus ausgeweitet wird.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit optimierter Linker-Antigen-Paare, um Kreuzreaktivitäten im Multiplex-Format zu vermeiden.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:50
Mixed Linker-Coupled Antigen Solution
2:26
Serum Sample Incubation with Labeled Antigen
3:30
Multiplex Plate Preparation
3:57
Serum/Antigen Incubate Transfer
4:58
Results: Representative Autoantibody Level Evaluation
6:03
Conclusion
