Echtzeit-Bildgebung der CCL5-induzierten Migration von periostalen Skelettstammzellen in Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt den Nachweis der CCL5-vermittelten periostalen Skelettstammzellmigration in Echtzeit mittels lebender tierexperimenteller Mikroskopie.

Das standardisierte Protokoll kann zur Beurteilung der endogenen Zellmigration verwendet werden und kann auf verschiedene Zelltypen sowie Skelettphänotypen angewendet werden. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, die Zellmigration in vivo für einzelne Zellen zu verfolgen, anstatt für eine Population von Zellen als Reaktion auf eine Verletzung und/oder Zytokinbehandlung. Bestätigen Sie vor Beginn des Eingriffs, dass die betäubte Maus nicht auf das Einklemmen der Zehen reagiert, und tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf.

Machen Sie als Nächstes einen queren, weniger als einen Zentimeter großen Schnitt von unmittelbar medial zum rechten Ohr zum linken Ohr und machen Sie einen zweiten Schnitt vom ersten Schnitt, etwa zwei bis drei Millimeter am rechten Auge vorbei in Richtung Nase. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut vom Periost zu trennen, und schneiden Sie mit einer Schere sanft durch das Bindegewebe, um die Haut vom Periost der Schädeldecke zu trennen. Tragen Sie mit einem sterilen Wattestäbchen eine Augensalbe auf die Oberseite des Hautlappens auf und falten Sie den Lappen vorsichtig über das linke Auge.

Der Schnittpunkt der sagittalen und koronalen Nähte sollte deutlich freigelegt werden. Spülen Sie die offene Oberfläche mit sterilem PBS, um den Bereich von Blut und Haarresten zu reinigen, und platzieren Sie die Spitze einer Abschrägung ein bis zwei Nadelbreiten in Richtung Nase von der koronalen Naht und ein bis zwei Nadelbreiten rechts von der sagittalen Naht. Drehen Sie die Spritze mit einem sehr geringen Druck nach unten vorsichtig einmal im Uhrzeigersinn und mehrmals gegen den Uhrzeigersinn.

Verwenden Sie dann eine 27-Gauge-Nadel, um die Mikrofraktur auf etwa 40 Mikrometer zu erweitern. Wenn Knochenfragmente zurückbleiben, spülen Sie die Mikrofraktur mit PBS. Wenn noch Knochenfragmente übrig sind, verwenden Sie eine 29-Gauge-Nadel, um die Fragmente vorsichtig herauszuschöpfen.

Verwenden Sie für die CCL5-Behandlung eine CCL5-Stammlösung mit 100 Nanogramm pro Milliliter und eine Basalmembranmatrix, um eine funktionierende Chemolockstofflösung mit 10 Nanogramm pro Milliliter zu erhalten. Um die Verletzung zu behandeln, beladen Sie eine 220-Mikroliter-Pipette mit fünf Mikrolitern der Lösung und tragen Sie zwei Mikroliter des Chemokins auf die Naht auf. Lassen Sie dann die Matrize verfestigen und bedecken Sie die Schädeldecke sanft mit dem Hautlappen, um sicherzustellen, dass das Gewebe während der einstündigen Chemokinbehandlung nicht austrocknet.

Für die intravitale Bildgebung der Migration von periostalen Stammzellen in Echtzeit üben Sie, bevor Sie die Maus zum Mikroskop bewegen, sanften Druck auf den Hinterkopf der Maus aus, um die visuelle Ebene der Schädeldecke zu überprüfen. Wenn die Ebene nicht waagerecht ist, drehen Sie die Maushalterung vorsichtig nach links oder rechts, um die Position anzupassen. Decken Sie anschließend den gesamten Schädeldach mit einem Hautlappen mit steriler 2%iger Methylcellulose in Wasser ab und platzieren Sie die Maus auf dem motorisierten Mikroskoptisch der XYZ-Achse.

Richten Sie die Maus mit dem Epifluoreszenzlicht so aus, dass sie dem Mikroskop zugewandt ist und dass der Schnittpunkt der koronalen und sagittalen Nähte der zentrierte Referenzpunkt des Tisches ist. Platzieren Sie dann eine Glasabdeckung auf dem Bildgebungsbereich und überprüfen Sie die Ausrichtung. Für die Zeitraffer-Bildgebung der Migration in und aus der Naht wählen Sie eine Wasserimmersionslinse mit geringer Vergrößerung, um die Schädeldecke zu scannen.

Erfassen Sie ein Referenzbild des Schnittpunkts zwischen sagittaler und koronaler Naht und verwenden Sie die SHG- und Fluoreszenzsignale der Zellen, lokalisieren Sie jede Verletzungsstelle und zeichnen Sie die XYZ-Koordinaten sowie die Abstände von den sagittalen und koronalen Nähten auf. Wählen Sie eine Stelle auf der koronalen oder sagittalen Naht für die Langzeitbildgebung aus und erhalten Sie während der Bildgebung ein detailliertes ZStack-Bild dieses Bereichs als Referenz. Verwenden Sie die Zeitraffer-Softwareeinstellungen, um mindestens eine Stunde lang alle eine Minute ein Bild aufzunehmen und das aktuelle Sichtfeld in der Zeit zwischen den Schnappschüssen mit dem ursprünglichen Sichtfeld zu vergleichen.

Wenn die Sichtfelder unterschiedlich sind, ermitteln Sie anhand des ZStack-Bildes, in welche Richtung das Sichtfeld angepasst werden muss. Kürzlich wurden Mx1-Tomaten-alpha-SMA GFP-Reportermäuse erzeugt, bei denen periostale Skelettstammzellen durch Mx1-positive alpha-SMA-positive duale Markierung markiert sind. Über einen Zeitraum von einer einstündigen Bildgebung, 24 Stunden nach der Nahtplatzierung, wird wenig bis keine Mx1-positive Alpha-SMA-positive Migration von periostalen Skelettstammzellen beobachtet.

Die CCL5-Chemokin-Behandlung eines Schädeldachdefekts 24 Stunden nach der Verletzung induziert eine gerichtlich deutliche Migration weg von der koronalen Naht und in Richtung der Verletzungsstelle. In dieser repräsentativen Analyse wanderte innerhalb einer Stunde nach der Bildgebung eine der Mx1-positiven alpha-SMA-positiven periostalen Skelettstammzellen etwa 50 Mikrometer in Richtung der Verletzung. Der wichtigste Aspekt dieses Protokolls, den Sie beachten sollten, ist die Beschränkung der CCL5-Behandlung auf die Verletzungsstelle, um die zellspezifische Migration zu stimulieren.

Sobald dieser Eingriff abgeschlossen ist, kann die lokalisierte Behandlung eine Woche lang fortgesetzt werden. Ein Mikro-CT kann verwendet werden, um die Heilung von Schädelverletzungen und Mineralablagerungen zu beurteilen.