Name: Studium der Auswirkungen von Zigarettenrauch auf Pseudomonas-Infektion in Lungenepithelzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Erfahren Sie, wie Zigarettenrauchextrakt die Pseudomonas-Bakterienlast in Lungenepithelzellen beeinflusst. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Untersuchungen zur Interaktion zwischen Rauch und bakteriellen Pathogenen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde teilweise von einem National Institutes of Health R01 Zuschüsse HL125435 und HL142997 (zu CZ) unterstützt.

1. 100% CSE Vorbereitung
<ol><li>Zeichnen Sie 10 ml serumfreie Zellkulturmedien (DMEM/F12 für BEAS-2B-Zellen; Atemwegsepithelzellbasalmedium für HSAEC-Zellen) in eine 60 ml Spritze.</li>
	<li>Legen Sie eine entsprechend getrimmte 1 ml Pipettespitze als Adapter zur Haltung der Zigarette (3R4F) an der Düse der Spritze an.</li>
	<li>Entfernen Sie den Filter der Zigarette. Befestigen Sie eine Zigarette am Tip-Adapter und verbrennen Sie die Zigarette.</li>
	<li>Zeichnen Sie 40 ml rauchhaltige Luft in 10 ml serumfreie Medien. Mischen Sie den Rauch mit dem Medium durch kräftiges Schütteln (30 s pro Unentschieden).</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 1.4 ca. 11x in 7 min, bis die Zigarette vollständig ausgebrannt ist.</li>
	<li>Filtern Sie die 10 ml geräucherten Medien mit einem 0,22 m-Filter, um Mikroorganismen und unlösliche Partikel auszuschließen. Transfer in ein geschlossenes steriles Rohr. Bereiten Sie die 100% CSE nicht mehr als 30 min vor dem nachfolgenden Test vor.</li>
</ol>2. Pseudomonas-Kultur
<ol><li>Gefrorene P. aeruginosa (Stamm PAO1) oder P. fluoreszens Migula (Stamm PAO143) in eine Tryptic Soy Broth (TSB) Agarplatte für die Nachtkultur bei 37 °C impfen lassen. HINWEIS: Um genügend Bakterien für die Kultivierung zu erhalten, verbreiten Sie so viele Bakterien wie möglich auf die TSB-Agarplatte.</li>
	<li>Sammeln Sie einen bakteriellen Abstrich und inkubieren in 20 ml TSB mit 5% Glycerin als Kohlenstoffquelle.</li>
	<li>Schütteln Sie die bakterielle Suspension in einem 37 °C Inkubator bei 200 Rpm für 1 h, bis der OD600-Wert = 0,6. VORSICHT: Lassen Sie die Schüttelgeschwindigkeit nicht mehr als 200 Umdrehungen an pm. Höhere Schüttelgeschwindigkeiten können die Morphologie der bakteriellen Flagella schädigen und die bakterielle Invasion in Lungenepithelien beeinträchtigen. Ebenso begrenzen Sie die Schüttelzeit auf 1 h, um hochinvasive Bakterien zu erhalten. Messen Sie den OD600-Wert, um die Anzahl der Bakterien zu schätzen. Eine OD600 = 1 entspricht 109 Koloniebildenden Einheiten (CFU)/ml.</li>
</ol>3. Menschliche Lungenepithelzellkultur und CSE-Behandlung
<ol><li>Kultur menschliche BEAS-2B-Zellen in HITES-Medium (500 ml DMEM/F12, 2,5 mg Insulin, 2,5 mg Transferrin, 2,5 mg Natriumselenit, 2,5 mg Transferrin, 10 M Hydrocortison, 10 M β-Estradiol, 10 mM HEPES und 2 mM L-Glutamin) ergänzt durch 10% fetales Rinderserum (FBS) wie zuvor beschrieben24.</li>
	<li>Kultur menschliche primäre kleine Atemwegsepithelzellen (HSAEC) im Atemwegsepithelzellkulturmedium (500 ml Airway Cell Basal Medium, 500 g/ml HSA, 0,6 m Linolsäure, 0,6 g/ml Lecithin, 6 mM L-Glutamin, 0,4 % Extrakt P, 1,0 M Epinephrin, 5 g/ml Transferrin, 10 nM T3, 1 g/ml Hydrocortison, rh EGF 5 ng/mL und 5 g/ml Rh Insulin. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5%CO2.</li>
	<li>Dissoziieren Sie die Zellen mit 1 ml 0,25% Trypsin für 5 min, bis sich die Zellen vollständig von der Unterseite der Platte lösen.</li>
	<li>Fügen Sie 10 ml komplettes HITES-Medium hinzu, um Trypsin zu neutralisieren und die Zellen in einem 15 ml-Rohr zu sammeln. Zentrifuge bei 4 °C bei 300 x g für 5 min. VORSICHT: Überwachen Sie sorgfältig die Zeit für die Trypsin-Verdauung durch Mikroskopie, da Überverdauung zum Zelltod führen kann.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 2 ml HITES-Medium mit 10% FBS wieder aus.</li>
	<li>Pipette 10 l der oben genannten Zellsuspension auf die Platte und legen Sie sie in einen automatisierten Zellzähler, um die Konzentration in Zellen/ml zu erhalten.</li>
	<li>Platte BEAS-2B Zellen in einer Konzentration von 3 × 105 Zellen/ml in 6 Brunnenplatten in einem Gesamtvolumen von 2 ml in HITES Medium ergänzt mit 10% FBS für Die Nachtkultur.</li>
	<li>Behandeln Sie die Zellen mit ca. 80% Konfluenz oder 5 x 105 Zellen/ml, mit 4% CSE für 3 h. Ändern Sie vor der CSE-Behandlung das Medium mit HITES-Medium mit 1% FBS.</li>
</ol>4. Bakterielle Infektion
<ol><li>P. aeruginosa oder P. fluorescens Migula (1 × 107 KBE/ml) zu jedem Brunnen der MIT CSE behandelten Zellen hinzufügen und 1 h bei 37 °C bei 5%CO2brüten.</li>
	<li>Aspirieren Sie die Überräube und ersetzen Sie mit 2 ml frischem HITES Medium, um mit 4% CSE und 100 g/ml Gentamicin zu behandeln. HINWEIS: Gentamicin wird verwendet, weil es nicht in der Lage ist, menschliche Lungenepithelzellmembranen zu durchdringen. So kann es alle Bakterien im Medium abtöten, aber nicht diejenigen, die in die Lungenepithelzellen eingedrungen sind.</li>
	<li>Nach 1 h CSE/Gentamicin-Behandlung bei 37 °C in 5%CO2die Überwälten ansaugen und die Zellen 3x mit PBS für die anschließende bakterielle Konzentrationsbestimmung waschen. HINWEIS: Zur Bestätigung der verinnerlichten Bakterien wurden Zellen, die mit gfP-markierten P. fluoreszens Migula infiziert waren, unter fluoreszierender Mikroskopie beobachtet.</li>
</ol>5. Bestimmung der bakterienkonzentration nach der Tropfplattenmethode
<ol><li>Um die bakterielle Belastung in infizierten Zellen mit der Tropfplattenmethode zu bestimmen, waschen Sie die mit Gentamycin behandelten Zellen 2x mit 2 ml kaltem PBS.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml Zelllysepuffer (0,5% Triton X-100 in PBS) zu jedem Brunnen hinzu.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Zelllysate, die die verinnerlichten Bakterien in einem Gradienten (1:10, 1:100, und 1:10.000) enthalten, für die folgende Impfung auf die TSB-Agarplatte.</li>
	<li>Nach 16 h Inkubation, erhalten Sie die Ergebnisse der KBE durch Zählen der Bakterienkolonien.</li>
</ol>6. RT-qPCR Nachweis von bakteriellen 16S rRNA
<ol><li>Behandeln Sie die Pseudomonas-infiziertenLungenepithelzellen (ca. 1 x 106 Zellen/ml) mit Gentamycin, wie oben beschrieben. Das Medium ansaugen und die Zellen 2x mit 2 ml kaltem PBS waschen.</li>
	<li>0,35 ml des Guanidium-Thiocyanat-Lysepuffers pro Brunnen einer 6-Well-Platte hinzufügen. Sammeln Sie die Zellen mit einem Zellschaber. Das Lysat in ein Mikrozentrifugenrohr geben und sanft mit der Pipette mischen.</li>
	<li>Das gleiche Volumen (0,35 ml) frisch zubereitetes 70% Ethanol in das Lysat geben und gut vermischen. Übertragen Sie alle Proben in eine Spin-Spalte, die in einem 2 ml-Sammelrohr platziert ist. Zentrifuge bei 10.000 x g für 30 s bei 20–25 °C. Verwerfen Sie dann den Puffer im Auflistungsrohr.</li>
	<li>Waschen Sie die Säule mit 0,7 ml Waschpuffer 1. Zentrifugieren Sie die Säule bei 10.000 x g für 30 s. Waschen Sie die Säule 2x mit 0,5 ml Puffer, um die membrangebundene RNA zu waschen. Wiederholen Sie die Zentrifugation bei 10.000 x g für 2 min.</li>
	<li>Platzieren Sie die Säule in einem neuen 1,5 ml Sammelrohr. Fügen Sie 30–50 L RNase-freies Wasser hinzu. Zentrifuge bei 10.000 x g für 1 min. Sammeln Sie den Durchfluss und messen Sie die RNA-Konzentration.</li>
	<li>Führen Sie eine umgekehrte Transkriptionsreaktion gemäß dem Herstellerprotokoll durch. Mischen Sie 1 g Gesamt-RNA mit 10 ml Reaktionspuffer, 1 l Reverse-Transkriptase und RNase-freiem Wasser für eine 20-L-Reaktion. Führen Sie die Umgekehrte Transkriptionsreaktion bei 37 °C für 1 h und dann 95 °C für 5 min.</li>
	<li>Mischen Sie die cDNA-Vorlagen (1 l jeder Reverse-Transkriptionsreaktion oben), 5 l des Master-Mix, der SYBR-Farbstoff enthält, 1 l von je 200 nM-spezifischen Primern und Wasser in einem 20-L-Gemisch für die folgende PCR-Analyse gemäß den Empfehlungen des Herstellers. ANMERKUNG: Im Folgenden sind die Primer für die 16S rRNA von P. aeruginosa: vorwärts 5-CAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3"; reverse 5-TAAGATCTCAAG GATCCCAACGGC-3. GAPDH wurde als Ladesteuerung mit folgenden Primern verwendet: vorwärts: 5-GGCATGGACTGGTCATGA-3; Rückseite: 5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3..</li>
	<li>Verwenden Sie die vergleichende CT-Methode, um den Ausdruck zu bestimmen.</li>
</ol>7. Nachweis von fluoreszierenden Pseudomonas mit Durchflusszytometrie
<ol><li>Behandeln Sie die oben fluoreszierenden Pseudomonas-infiziertenLungenepithelzellen (ca. 1 x 106 Zellen/ml) mit Gentamycin, wie zuvor beschrieben. Das Medium ansaugen und die Zellen 2x mit 2 ml kaltem PBS waschen.</li>
	<li>Analysieren Sie die Proben mit einem Durchflusszytometer bei einer Wellenlänge von 509 nm für die Detektion von GFP. Beenden Sie jeden Lesewert mit 100.000 Zählungen. Analysieren Sie die erfassten Daten mit zugehöriger Software.</li>
</ol>

<ol><li>Vogelmeier, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Strategy+for+the+Diagnosis%2C+Management%2C+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Lung+Disease+2017+Report.+GOLD+Executive+Summary%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).</li>
<li>Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+lung+cancer+worldwide%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Care+Journal%22%5BJournal%5D)">Risk factors for lung cancer worldwide.</a> European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).</li>
<li>Lugade, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+exposure+exacerbates+lung+inflammation+and+compromises+immunity+to+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).</li>
<li>Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+Smoke+Induces+and+Alters+Immune+Responses+in+the+Lung+Triggering+Inflammation%2C+Allergy%2C+Asthma+and+Other+Lung+Diseases%3A+A+Mechanistic+Review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review.</a> International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).</li>
<li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelated+role+of+cigarette+smoking%2C+oxidative+stress%2C+and+immune+response+in+COPD+and+corresponding+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).</li>
<li>Morse, D., Rosas, I. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+smoke-induced+lung+fibrosis+and+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema.</a> Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).</li>
<li>Rigotti, N. A., Clair, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+tobacco+use%3A+the+neglected+cardiovascular+disease+risk+factor%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor.</a> European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).</li>
<li>Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco-related+carcinogenesis+in+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Review%22%5BJournal%5D)">Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer.</a> Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).</li>
<li>Papi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+and+airway+inflammation+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease+severe+exacerbations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).</li>
<li>Garcia-Vidal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+in+patients+hospitalised+for+COPD+exacerbation%3A+a+prospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study.</a> European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).</li>
<li>Murphy, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).</li>
<li>Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPD+exacerbations%3A+defining+their+cause+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">COPD exacerbations: defining their cause and prevention.</a> Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).</li>
<li>Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exacerbations+of+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Chronic+Obstructive+Pulmonary+Disease%22%5BJournal%5D)">Exacerbations of COPD.</a> International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, Spec Iss 21-30 (2016).</li>
<li>Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+infection+and+the+pathogenesis+of+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Bacterial infection and the pathogenesis of COPD.</a> Chest. 117 (5), Suppl 1 286-291 (2000).</li>
<li>Weinreich, U. M., Korsgaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+colonisation+of+lower+airways+in+health+and+chronic+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease.</a> Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).</li>
<li>Hook, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+staphylococcal+aggregation+protects+against+lethal+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).</li>
<li>Ross, K. F., Herzberg, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+immunity+in+mucosal+epithelial+cells%3A+fortifying+the+barrier+against+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infection%22%5BJournal%5D)">Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection.</a> Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).</li>
<li>Bedi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+agonists+attenuate+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa.</a> FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).</li>
<li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+p21%28CIP1%2FWAF1%29+and+B+cell+lymphoma+leukemia-x%28L%29+expression+and+reduced+apoptosis+in+alveolar+macrophages+from+smokers%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).</li>
<li>Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+decreases+airway+epithelial+FABP5+expression+and+promotes+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection.</a> PLoS One. 8 (1), 51784(2013).</li>
<li>Thorne, D., Adamson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+in+vitro+cigarette+smoke+exposure+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">A review of in vitro cigarette smoke exposure systems.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).</li>
<li>Keyser, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+for+assessment+of+dose+in+in+vitro+evaluations+using+a+VITROCELL%28R%29+VC10%28R%29+smoke+exposure+system%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system.</a> Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).</li>
<li>Del Arroyo, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+modulation+of+glutamate+release+in+activated+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils.</a> EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).</li>
<li>Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+modulates+p300+and+Sirt1+to+promote+PRMT1+stability+via+an+SCF%28Fbxl17%29-recognized+acetyldegron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron.</a> Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).</li>
<li>Bauman, S. J., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+vesicles+associate+with+and+are+internalized+by+human+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells.</a> BMC Microbiology. 9, 26(2009).</li>
<li>Ichikawa, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+pseudomonas+aeruginosa+with+epithelial+cells%3A+identification+of+differentially+regulated+genes+by+expression+microarray+analysis+of+human+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).</li>
<li>Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis%3A+An+essential+issue+for+in+vitro+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiologyopen%22%5BJournal%5D)">Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays.</a> Microbiologyopen. 7 (2), 00588(2018).</li>
<li>Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+extract+modulates+Pseudomonas+aeruginosa+bacterial+load+via+USP25%2FHDAC11+axis+in+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).</li>
<li>Feldman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+flagella+in+pathogenesis+of+Pseudomonas+aeruginosa+pulmonary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection.</a> Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Agitation%2C+Aeration+and+Temperature+on+Production+of+a+Novel+Glycoprotein+GP-1+by+Streptomyces+kanasenisi+ZX01+and+Scale-Up+Based+on+Volumetric+Oxygen+Transfer+Coefficient%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient.</a> Molecules. 23 (1), 125(2018).</li>
<li>Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminoglycosides%3A+activity+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Aminoglycosides: activity and resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-1+receptor+antagonists+prevent+the+development+of+pulmonary+emphysema+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats.</a> European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).</li>
<li>Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+anti-emphysema+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+in+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Animal models for anti-emphysema drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+model+of+primary+human+pediatric+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells.</a> Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).</li>
<li>Amatngalim, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+epithelial+differentiation+by+cigarette+smoke+dysregulates+respiratory+host+defence%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence.</a> European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009(2018).</li>
<li>Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+airway+organoid+engineering+as+a+step+toward+lung+regeneration+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling.</a> Biomaterials. 113, 118-132 (2017).</li>
<li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die bakterielle Invasion in Lungenepithelzellen ist ein entscheidender Schritt bei der Pathogenese bakterieller Infektionen. Der Prozess der bakteriellen Invasion in die Zellen kann in die folgenden drei Schritte unterteilt werden: Erstens, die Bakterien kontaktieren und haften an der Oberfläche der Epithelzelle mit ihren Flagella. Zweitens werden die Bakterien entweder verinnerlicht oder in die Zellmembran eindringen. Schließlich replizieren und besiedeln die Bakterien die Zellen, wenn sie erfolgreich zellulären Abwehrm...

Das Rauchen von Zigaretten beeinträchtigt die öffentliche Gesundheit von Millionen von Menschen weltweit. Viele schädliche Krankheiten, einschließlich Lungenkrebs und chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), werden berichtet, dass im Zusammenhang mit Zigarettenrauchen1,2. Zigarettenrauchen erhöht die Anfälligkeit für akute mikrobielle Infektionen in den Atemwegen3,4,5. Darüber hinaus belegen immer mehr Beweise, dass Zigarettenrauchen die Pathogenese vieler chronischer Erkrankungen verstärkt6,7,8. Zum Beispiel kann Zigarettenrauchen virale oder bakterielle Infektionen erhöhen, die COPD-Exazerbation verursachen9. Unter den bakteriellen Krankheitserregern, die ätiologisch zur akuten Exazerbation von COPD beitragen, verursacht ein opportunistischer gramnegativer Bacillus-Erreger, Pseudomonas aeruginosa,Infektionen, die mit schlechten Prognosen und höheren Sterblichkeiten korrelieren10,11. CopD-Exazerbation verschlimmert die Krankheit durch Beschleunigung der pathologischen Progression. Es gibt keine wirksamen Therapien gegen COPD-Exazerbation außer dem antisymptomatischen Management12. COPD-Exazerbation fördert die Sterblichkeit der Patienten, verringert die Lebensqualität und erhöht die wirtschaftliche Belastung der Gesellschaft13.
Die Atemwege sind ein offenes System, das kontinuierlich verschiedenen mikrobiellen Krankheitserregern ausgesetzt ist, die extern vorkommen. Opportunistische bakterielle Krankheitserreger werden in der Regel in den oberen Atemwegen nachgewiesen, aber manchmal in den unteren Atemwegenbeobachtet 14,15. In Tiermodellen kann P. aeruginosa in alveolaren Säcken schon nach 1 h nach der Infektion16nachgewiesen werden. Als wichtiger Abwehrmechanismus eliminieren Immunzellen wie Makrophagen oder Neutrophilen die Bakterien in den Atemwegen. Lungenepithelzellen, als erste physiologische Barriere, spielen eine einzigartige Rolle in der Wirtsabwehr gegen mikrobielle Infektionen. Lungenepithelzellen können mikrobielle Invasion, Kolonisation oder Replikation unabhängig von Immunzellen regulieren17. Einige Moleküle, die in Epithelzellen gefunden werden, einschließlich PPARg, üben antibakterielle Funktionen aus und regulieren dadurch die bakterielle Besiedlung und Replikation in Lungenepithelzellen18. Zigarettenrauchen kann die Moleküle verändern und die normale Abwehrfunktion in den Lungenepithelzellen19,20beeinträchtigen. Jüngste Studien berichteten über die direkte Exposition von Zigarettenrauch gegenüber Lungenepithelzellen mit Roboter-Raucherapparat21,22. Die Exposition gegenüber Rauch kann jedoch auf andere Weise durchgeführt werden, einschließlich der Anwendung von CSE. Die Herstellung von CSE ist ein reproduzierbarer Ansatz mit möglichen Anwendungen in anderen Zelltypen, einschließlich vaskulärer Endothelzellen, die indirekt Zigarettenrauch ausgesetzt sind.
Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von Zigarettenrauchextrakt, um die bakterielle Belastung in Lungenepithelzellen zu verändern. CSE erhöht die bakterielle Belastung von P. aeruginosa, und es kann zum Wiederauftreten von bakteriellen Infektionen in der Regel bei COPD Exazerbation gesehen beitragen. Zur Herstellung von CSE wird eine konventionelle Methode verwendet. Lungenepithelzellen werden in ihrem exponentiellen Wachstumsstadium mit 4% CSE für 3 h behandelt. Alternativ können monolayer-kultivierte Lungenepithelzellen in einer luft-flüssigen Schnittstelle direkt Zigarettenrauch ausgesetzt werden. CSE-behandelte Zellen werden dann mit Pseudomonas bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 10 herausgefordert. Die Bakterien werden mit einer bestimmten Schüttelgeschwindigkeit vermehrt, um sicherzustellen, dass die Morphologie ihrer Flagella intakt bleibt, um ihre volle invasive Kapazität zu behalten. Gentamycin wird eingesetzt, um die im Kulturmedium zurückgelassenen Bakterien abzutöten und so die potenzielle Kontamination bei der anschließenden Bestimmung der Bakterienbelastung zu reduzieren. Das Protokoll verwendet auch GFP-markierte Pseudomonas, die als ein leistungsfähiges Werkzeug bei der Untersuchung Pseudomonas Infektion in verschiedenen Modellen verwendet wurde. Ein repräsentativer Stamm ist P. fluorescens Migula23. Der Grad der Infektion oder bakterielle Belastung nach der CSE-Behandlung wird auf drei Arten bestimmt: die Fallplattenmethode mit Koloniezählung, quantitative PCR mit Pseudomonas 16S rRNA-spezifischen Primern oder die Durchflusszytometrie in Zellen, die mit fluoreszierenden Pseudomonasinfiziert sind. Dieses Protokoll ist ein einfacher und reproduzierbarer Ansatz, um die Wirkung von Zigarettenrauch auf bakterielle Infektionen in Lungenepithelzellen zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>50-ml-Spritze</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Basalmedium für Atemwegsepithelzellen</td><td>ATCC</td><td>PCS-300-030</td><td></td></tr><tr><td>Bakterienschüttler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit für das Wachstum von Bronchialepithelzellen</td><td>ATCC</td><td>PCS-300-040</td><td></td></tr><tr><td>Zellzähler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Echtzeit-PCR-System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA-zu-DNA-KIT mit hoher Kapazität</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4387406</td><td></td></tr><tr><td>HITES Medium</td><td>ATCC</td><td>ATCC 30-2004</td><td></td></tr><tr><td>humane BEAS-2B-Zellen</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>humane primäre Epithelzellen der kleinen Atemwege</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-300-030</td><td></td></tr><tr><td>LSRII Durchflusszytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikkon konfokales Mikroskop</td><td>Nikkon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OD Reader</td><td>USA Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Primer</td><td>ITD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>ATCC</td><td>ATCC 47085</td><td>PAO1-LAC</td></tr><tr><td>Pseudomonas fluorescens Migula</td><td>ATCC</td><td>ATCC 27853</td><td>P.aeruginosa GFP Zigaretten</td></tr><tr><td>in Forschungsqualität (3R4F)</td><td>Universität von Kentucky</td><td>TP-7-VA</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Transprent PET Transwell Einsatz</td><td>Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptische Sojabrühe</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

studium der auswirkungen von zigarettenrauch auf pseudomonas-infektion in lungenepithelzellen

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Zigarettenrauchen ist die Hauptursache für Lungenemphysem und chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD). Zigarettenrauchen fördert auch die Anfälligkeit für bakterielle Infektionen in den Atemwegen. Die Auswirkungen des Zigarettenrauchens auf bakterielle Infektionen in menschlichen Lungenepithelzellen müssen jedoch noch gründlich untersucht werden. Beschrieben ist ein detailliertes Protokoll für die Herstellung von Zigarettenrauchextrakten (CSE), die Behandlung von menschlichen Lungenepithelzellen mit CSE, und bakterielle Infektion und Infektionsbestimmung. CSE wurde nach einem konventionellen Verfahren hergestellt. Lungenepithelzellen wurden mit 4% CSE für 3 h behandelt. CSE-behandelte Zellen wurden dann mit Pseudomonas bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 10 infiziert. Die bakteriellen Belastungen der Zellen wurden durch drei verschiedene Methoden bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass CSE die Epithelbelastung in Lungenepithelzellen erhöhte. Dieses Protokoll bietet daher einen einfachen und reproduzierbaren Ansatz, um die Wirkung von Zigarettenrauch auf bakterielle Infektionen in Lungenepithelzellen zu untersuchen.

Ein Diagramm wird verwendet, um das Protokoll in Abbildung 1zu veranschaulichen. Lungenepithel-BEAS-2B-Zellen wurden mit CSE behandelt und mit Pseudomonasherausgefordert. Pseudomonas im Kulturmedium wurden durch das zugesetzte Gentamycin getötet und die Zellen wurden dem Fallplattentest, dem RT-qPCR-Nachweis von Pseudomonas Ribosom 16S-RNA und der Durchflusszytometrie unterzogen. Im Vergleich zur Kontrolle erhöhte die CSE-Behandlung die bakterielle Infektion bei Fa...

Beschrieben hier ist ein Protokoll zu untersuchen, wie Zigarettenrauch-Extrakt bakterielle Besiedlung in Lungenepithelzellen beeinflusst.

Studium der Auswirkungen von Zigarettenrauch auf Pseudomonas-Infektion in Lungenepithelzellen

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

Dieses Protokoll verwendet drei Ansätze, um festzustellen, ob Zigarettenrauch die bakterielle Belastung von Pseudomonas in Lungenepithelzellen beeinflusst. Diese Methode kann auf Endothelzellen oder andere Zelltipps erweitert werden. Die Vorbereitung der Zigarettenrauchextraktion, bakterielle Infektion und die Bestimmung mit einer bakteriellen Belastung sind in diesem Video ausführlich beschrieben.Dieses Verfahren ist für die neuen Benutzer sehr einfach zu befolgen. Zeichnen Sie 10 Milliliter serumfreies Zellkulturmedium in eine 60-Milliliter-Spritze. Befestigen Sie das schmale Ende einer Trimmung auf eine Milliliter-Pipettenspitze an der Düse der Spritze, als Adapter, um die Zigarette zu halten.Entfernen Sie den Filter von der Zigarette und befestigen Sie die Zigarette am Adapter. Nicht mehr als 30 Minuten vor der Durchführung des Testes verbrennen Sie die Zigarette und ziehen 40 Milliliter Rauch, der Luft in die Spritze. Mischen Sie den Rauch mit dem Medium, indem Sie die Spritze kräftig schütteln.Wiederholen Sie den Ziehvorgang, bis die Zigarette vollständig ausgebrannt ist, was etwa 11 Ziehungen in etwa sieben Minuten erfordert. Um Mikroorganismen und unlösliche Partikel aus dem Medium zu entfernen, filtern Sie es durch einen 0,22-Mikron-Filter. Dann übertragen Sie das Medium in ein geschlossenes steriles Rohr.Impfen Sie eine tryptische Sojabrühe oder TSB-Schneckenplatte mit einem ausgewählten Pseudomonas-Stamm. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie eine Tube mit 20 Milliliter TSB mit 5% Glycerin als Kohlenstoffquelle vor.Sammeln Sie einen Abstrich von der Schneckenplatte und impfen Sie das TSB. Inkubieren Sie die Pseudomonas-Suspension in einem 37 Grad Celsius-Shaker bei 200 RPM, für etwa eine Stunde, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,6 beträgt. Nach der Kultivierung von Lungenepithelzellen, wie im Manuskript beschrieben, fügen Sie den Zellen einen Milliliter 0,25% Trypsin hinzu.Nach etwa fünf Minuten, wenn sich die Zellen vollständig von der Unterseite der Platte gelöst haben, fügen Sie 10 Milliliter komplettes Heights-Medium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Übertragen Sie die Zellen in eine 15 Milliliter-Röhre. Dann zentrifugieren Sie die Zellen für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und 300 Mal G.Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.Setzen Sie dann die Zellen mit 10% FBS wieder in Milliliter des Höhenmediums aus. Pipette 10 Mikroliter der Epithelzellsuspension auf eine neue Platte. Verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler, um die Zellkonzentration zu erhalten.Die Lungenepithelzellen mit einer Konzentration von dreimal 10 bis fünf Milliliter, bei einem Gesamtvolumen von zwei Millilitern Medium pro Brunnen, verplatten. Inkubieren Sie die Platten über Nacht. Wenn die Zellen etwa 80 % Konfluenz erreichen, ersetzen Sie das Medium durch Das Medium Heights medium plus 1%FBS.Dann 4%CSE in die Brunnen geben und die Platten drei Stunden lang bebrüten. Fügen Sie jedem Brunnen der MIT CSE behandelten Lungenepithelzellen eine Pseudomonas hinzu. Dann inkubieren Sie die Platten für eine Stunde bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.Als nächstes ersetzen Sie das Medium in den sechs Brunnenplatten durch zwei Milliliter frisches Heights-Medium, das 4%CSE und 100 Mikrogramm pro Milliliter Gentamycin enthält. Nach dem Inkubieren der Platten für eine Stunde bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid, aspirieren Sie das Medium aus den Brunnen. Waschen Sie die mit Gentamycin behandelten Zellen zweimal mit zwei Millilitern kalter PBS.Bakterienlast in den Lungenepithelzellen kann dann durch die Tropfplattenmethode, qRT-PCR oder Durchflusszytometrie nachgewiesen werden. Fügen Sie jedem Brunnen der Lungenepithelzellen einen Milliliter Zelllysepuffer hinzu. Reparieren Sie serielle Verdünnungen des Zelllysats, die von eins bis 10 bis eins bis 10 000 reichen.Dann impfen Sie die TSB-Schneckenplatte. Bestimmen Sie nach 16 Stunden Inkubation, wie viele Kolonien bildende Einheiten in den Lungenepithelzellen vorhanden waren, indem Sie die Anzahl der Bakterienkolonien zählen. Fügen Sie 0,35 Milliliter des Guanidinium-Thiocyanat-Lysepuffers zu jedem Brunnen der Lungenepithelzellen hinzu.Sammeln Sie die Zellen mit einem Zellschaber. Das Lysat in ein Mikrozentrifugenrohr geben und sanft mit der Pipette mischen. 0,35 Milliliter frisch zubereitet zu 70% Ethanol in das Lysat geben und gut vermischen.Übertragen Sie alle Proben in eine Spin-Spalte, die in einem Zwei-Milliliter-Sammelrohr platziert ist. Zentrifugieren Sie das Sammelrohr 30 Sekunden lang bei 10.000 Mal G und 20 bis 25 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Puffer im Sammelrohr und waschen Sie die Säule mit 0,7 Milliliter Waschpuffer.Zentrifugieren Sie die Säule 30 Sekunden lang bei 10.000 mal G. Waschen Sie die Säule zweimal mit 0,5 Milliliter Puffer. Wiederholen Sie die Zentrifugation bei 10.000 mal G für zwei Minuten.Legen Sie die Säule in ein neues 1,5-Milliliter-Sammelrohr und fügen Sie 30 bis 50 Mikroliter RNase-freies Wasser hinzu. Nach der Zentrifugierung des Rohres bei 10.000 mal G für eine Minute, sammeln Sie den Durchfluss und messen Sie die RNA-Konzentration. Zur Vorbereitung auf eine 20 Mikroliter-Reverse-Transkriptionsreaktion wird ein Mikrogramm der gesamten RNA mit 10 Mikroliter Reaktionspuffer, einem Mikroliter Reverse-Transkriptase und RNase-freiem Wasser erstellt.Führen Sie die Umgekehrte Transkriptionsreaktion bei 37 Grad Celsius für eine Stunde und dann bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten, nach dem Herstellerprotokoll. Mischen Sie dann einen Mikroliter jeder cDNA-Probe mit fünf Mikrolitern des Master-Mixes, der Cyberfarbstoff enthält, und einem Mikroliter jeder 200 nanomolaren spezifischen Grundierung. Fügen Sie Wasser für ein Gesamtvolumen von 20 Mikroliter hinzu.Führen Sie pcR-Analysen gemäß den Empfehlungen des Herstellers durch. Und verwenden Sie dann die vergleichende CT-Methode, um den Ausdruck zu bestimmen. In BEAS-2B-Zellen änderte sich die Lebensfähigkeit nicht wesentlich, wenn Zellen drei Stunden lang mit 4%CSE behandelt wurden.Eine Stunde als Pseudomonas-Infektion hatte auch keinen wesentlichen Einfluss auf die Lebensfähigkeit. Schließlich nutzten sie Gentamycin, um Pseudomonas im Kulturmedium zu töten, hatten keinen statistisch signifikanten Einfluss auf die Zelllebensfähigkeit. Gemessen an der Tropfplattenmethode wurde die bakterielle Infektion in BEAS-2B-Zellen durch die Behandlung mit CSE erheblich erhöht.Dasselbe galt für die CSE-Behandlung von HSAEC. Die bakterielle Infektion von CSE-behandelten BEAS-2B-Zellen wurde auch mit RT-PCR bewertet, um die Menge an 16S rRNA zu quantifizieren, die auf eine Zunahme der Pseudomonas aeruginosa hindeutete. Die mit CSE behandelten und mit Pseudomonas fluoreszens Migula infizierten BEAS-2B-Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie mit 509 Nanometern analysiert.Das Ergebnis zeigte auch, dass die CSE-Behandlung die bakterielle Infektion erhöht. Die Ergebnisse der fluoreszierenden Mikroskopie zeigten, dass GFP-markierte Bakterien in einem Pseudomonas-Fluoreszens-Migula-Infektionsexperiment mit BEAS-2B-Zellen kolokalisiert wurden. Zellen könnten Zigarettenrauch ausgesetzt werden, wenn Roboter rauchen, was menschliches Verhalten nachahmen und es ermöglichen kann, die Auswirkungen von Zigarettenrauch direkt auf Lungenepithelzellen zu untersuchen.Diese Technik könnte verwendet werden, um einen Zigarettenrauch auf anderen Zellhähne im Zusammenhang mit einer Lungeninfektion zu erforschen. Der beschriebene Ansatz als Grundlage für die Entwicklung wirksamer Therapien gegen eine rauchende dorsale Lungenverletzung und C0PD extra

studying-effects-cigarette-smoke-on-pseudomonas-infection-lung

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Pulmonale Epithelzellen aus den Atemwegen von Mäusen isoliert und kultiviert bei Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche als ein Modell der differenzierten respiratorischen Epithels. Ein Protokoll ist für die Isolierung, Kultivierung und Freilegen dieser Zellen zu Mainstream Zigarettenrauch beschrieben, um molekulare Antworten zu diesem Umweltgift zu studieren.

Isolierung von Maus respiratorischen Epithelzellen und der Exposition gegenüber Experimental Zigarettenrauch bei Air Liquid-Interface

Source: Li, T., et al. Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates how cigarette smoke extract weakens antimicrobial defense in lung epithelial cells by reducing AMP production, leading to increased bacterial invasion. The procedure measures intracellular bacterial load to assess the impact of smoke exposure on host-pathogen interactions.

Analyzing the Effects of Cigarette Smoke on Antimicrobial Defense in Lung Epithelial Cells

Wir beschreiben die Agar-Perlen Methode, um anhaltende langfristige chronische Pseudomonas aeruginosa-Infektion der Atemwege im Mausmodell zu etablieren.

Langzeitchronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway-Infektion bei Mäusen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, automatisierte Methoden zur Quantifizierung chronischer Lungenpathologien in einem Mausmodell der COPD bereitzustellen. Das Protokoll umfasst die Exposition von Mäusen gegenüber Zigarettenrauch (CS), die Messung der Lungenfunktion, das Aufblasen der Lunge und die Verwendung morphometrischer Methoden zur Messung von Emphysem und Umbau kleiner Atemwege bei Mäusen.

Automatisierte Messung von Lungenemphysem und Klein Airway Remodeling im Zigarettenrauch ausgesetzten Mäuse

Das Ziel dieses Protokolls ist es, menschliche organotypische 3D-Bronchial- und Nasengewebemodelle dem Mainstream-Zigarettenrauch (CS) an der Luft-Flüssig-Grenzfläche auszusetzen. Der Einfluss von CS auf das Gewebe wird dann mit Hilfe eines Cytochrom-P450-Aktivitätsassays, einer Zilienschlagmessung und eines systembiologischen Ansatzes untersucht.

Folgenabschätzung Wiederholte Exposition von organotypischen 3D bronchiale und nasale Zellkulturmodelle zu Whole Zigarettenrauch

Unter Verwendung optimierter ex vivo Assays aus humanen mononukleären Blutzellen (PBMC) haben wir gezeigt, dass ein brennbares Tabakprodukt die rezeptorvermittelten intrazellulär sekretierten Zytokine und die zytolytische Fähigkeit von Effektor-PBMCs deutlich unterdrückt. Diese Schnelltests können bei der Produktbewertung und dem Verständnis der potenziellen Langzeitwirkungen der Tabakexposition nützlich sein.

Methoden zur Zytotoxizität und Immunsuppression mit brennbarem Tabakwaren Vorbereitungen Bewerten

Während in vitro Studien von Wirt-Erreger-Interaktionen die Charakterisierung spezifischer Immunantworten ermöglichen, sind in vivo Modelle erforderlich, um die Auswirkungen komplexer Reaktionen zu beobachten. Unter Verwendung der Exposition von Candida albicans, gefolgt von einer Pseudomonas aeruginosa-vermittelten Lungeninfektion, etablierten wir ein Mausmodell für mikrobielle Interaktionen, die an der Pathogenität der beatmungsassoziierten Pneumonie beteiligt sind.

Studieren Mikrobielle Gemeinschaften<em&gt; In-vivo-</em&gt;: Ein Modell von Host-vermittelte Interaktion zwischen<em&gt; Candida albicans</em&gt; Und<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In den Atemwegen

Hier wird ein nützliches Protokoll zur Lungenfixierung vorgestellt, das einen stabilen Zustand für die histologische Auswertung von Lungenproben aus einem Mausmodell von Emphysem schafft. Der Hauptvorteil dieses Modells ist, dass es viele Lungen mit dem gleichen konstanten Druck ohne Lungenkollaps oder Deflation reparieren kann.

Lungenfixierung unter konstantem Druck zur Beurteilung von Emphysem bei Mäusen

Dieses Protokoll zeigt die Untersuchung der pathophysiologischen Wirkungen von Zigarettenrauch (CS) mit einem ganzheitigen Inhalationssystem (WBI) im eigenen Haus gebaut. Dieses System kann Tiere UNTER kontrollierten wiederholbaren Bedingungen CS aussetzen, um CS-vermittelte Wirkungen auf Lungenemphysem und Hämatopoese zu erforschen.

Zigarettenrauchexposition bei Mäusen mit einem Ganzkörper-Inhalationssystem

In dieser Arbeit wird eine reproduzierbare, kostengünstige und robuste Methode zur Isolierung und Expansion von primären Bronchialepithelzellen für das langfristige Biobanking und die Erzeugung differenzierter Epithelzellen durch Kultur an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche vorgestellt.

Isolierung von Bronchialepithelzellen aus reseziertem Lungengewebe für Biobanken und Etablierung gut differenzierter Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen

In dieser Arbeit beschreiben wir ein in vitro Modell zur Isolierung und Differenzierung von murinen Atemwegsepithelzellen, wobei der Schwerpunkt auf ihrer Akklimatisierung an chronischen Zigarettenrauchextrakt (CSE) liegt. Das Modell könnte verwendet werden, um die Multi-Omics-Auswirkungen von CSE umfassend zu charakterisieren, was möglicherweise Einblicke in die zellulären Reaktionen unter chronischer Rauchbelastung liefert.

In vitro Modell zur Untersuchung der Differenzierung und Veränderung von Multi-Omics an murinen Atemwegsepithelzellen, die mit Zigarettenrauchextrakt stimuliert wurden

Erfahren Sie, wie Zigarettenrauchextrakt die Pseudomonas-Bakterienlast in Lungenepithelzellen beeinflusst. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Untersuchungen zur Interaktion zwischen Rauch und bakteriellen Pathogenen.

Studium der Auswirkungen von Zigarettenrauch auf Pseudomonas-Infektion in Lungenepithelzellen

Weitere Videos entdecken