Herstellung von Zellextrakten durch Cryogrinding in einer automatisierten Gefriermühle

Hefe ist ein beliebter Modellorganismus, nicht nur für genetische Studien, sondern auch für biochemische Studien von Proteinen und anderen Makromolekülen, die aus wilden Und mutierten Hefestämmen extrahiert wurden. Aufgrund ihrer harten Zellwände stellt Forscher jedoch vor einer großen Herausforderung, dass sie effizient von Hefezellen lysiert, ohne den Zellgehalt zu schädigen. Die Isolierung intakter biologischer Makromoleküle ist in der Regel kritisch und hängt von der Temperatur ab.

Die Herstellung der Extrakte bei niedriger Temperatur stellt sicher, dass die intrazellulären Proteasen und Nukleasen inaktiv bleiben, was zu einer zuverlässigen Isolierung von intaktem Protein, Nukleinsäuren und anderen Makromolekülen für eine ausreichende Lyse führt. Verschiedene Methoden stehen zur Gewinnung von Hefeextrakten durch enzymatische, chemische und physikalische Lyse zur Verfügung. Allerdings ist die enzymatische Lyse aufgrund der Anforderung von gereinigten Enzymen, die Zellwand zu verdauen, teuer, wodurch die Verwendung einer kleineren Anzahl von Zellen eingeschränkt wird.

Weiterhin müssen die enzymatischen Reaktionen genau überwacht werden, um eine Überverdauung und vorzeitige Lyse der Zellen zu verhindern. Chemische Methoden mit starken Denaturing-Mitteln, obwohl wirksam, führen zur Denaturierung von Proteinen und sind daher nicht für die Isolierung von Proteinkomplexen oder funktionellen Enzymen geeignet. Physikalische Methoden, wie Lyse unter hohem Druck in einer französischen Presse, können in der Kälte bei vier Grad Celsius durchgeführt werden, aber das ist nicht kalt genug, um den Abbau und die Denaturierung aller einheimischen Proteine zu verhindern.

Andere beliebte physikalische Methoden sind die Verwendung eines Mörsers und Stößel, Mixer oder Kaffeemühle, um Hefezellen resuspended in einem Lysepuffer und gefroren als Tröpfchen oder Schleifen und Mischung von Glasperlen und Hefe in einer schnellen Vorbereitung Perlenschlagmühle oder eine Lyse durch Beschallung zu mahlen. Das manuelle Schleifen ist jedoch arbeitsintensiv und die resultierende Proteinausbeute kann je nach den verwendeten Techniken während der Lyse durch Beschallung oder Schleifen in einem Mixer, Kaffeeschleifer oder Perlenschlagmühle erheblich variieren, was zu einer Proteindenaturierung und -degradation führt. Um daher eine Hefezelllyse mit Proteinen in ihrem nativen Zustand mit minimaler Denaturierung und Abbau für Anwendungen wie Reinigungen funktioneller Proteinkomplexe, biochemische Assays oder den Nachweis flüchtiger posttranslationaler Modifikationen zu erhalten, ist es wichtig, eine leicht skalierbare Lysemethode zu verwenden, die die Wärmeerzeugung minimiert und gleichzeitig eine effiziente Lyse unabhängig von der Zellmenge ermöglicht.

Hier beschreiben wir eine Methode, die den Einsatz einer Kryo-Gefriermühle für die Lyse von Zellen in flüssigem Stickstoff bei minus 196 Grad Celsius beinhaltet, um gefrorene Zellextrakte zu erzeugen, wodurch die Rückgewinnung intakter funktioneller Makromoleküle wie Proteine oder DNA und RNA bei sehr niedrigen Temperaturen ermöglicht wird, was DieNaturierung und Abbau minimiert. Diese Methode kann leicht für die Verwendung mit jeder Art von Zell- oder Gewebeproben von jeder Art angepasst werden, einschließlich forensischer und sogar alter Proben, die von archäologischen Stätten geborgen oder im Permafrost eingefroren gefunden wurden. Die Gefriermühle verwendet eine supraleitende elektromagnetische Schleifkammer, die einen festen Metallstab in einer Polycarbonat-Datei, die die zu pulverisierende Probe enthält, schnell hin und her bewegt.

Diese physikalische Zelllysemethode ermöglicht eine effizientere Lyse und führt reproduzierbar zu einem Extrakt von besserer Qualität. Hefezellen wurden in einer Konzentration von 10 Millionen Zellen pro Mil angebaut. Diese Hefezellen wurden vorgekühlte Zentrifugenflasche platziert und für 10 Minuten bei 2, 400 G gesponnen. Sobald der Spin abgeschlossen ist, dekant den Überstand, ohne die Pelletzellen zu stören.

Dieses Pellet wurde in einer kleinen Menge eiskaltem Wasser resuspended, etwa die Hälfte des anfänglichen Volumens der Kultur, um die Zellen zu waschen. Die resuspendierten Zellen wurden wieder für weitere 10 Minuten bei 2, 400 G nach unten gesponnen. Sobald die nächste Drehung abgeschlossen ist, dekantieren wir wieder den ganzen Überstand, ohne das Pellet zu stören. Dieses Pellet wird dann resuspendiert und 15 ML eiskalte Lysepuffer.

Stellen Sie sicher, dass das Pellet vollständig resuspendiert ist. Die resuspendierten Zellen sollten auf Eis in einem vormarkierten Rohr bleiben, bis sie für den nächsten Schritt bereit sind. Tragen Sie beim Umgang mit flüssigem Stickstoff wie Schutzbrillen, Handschutz und Laborlacken immer persönliche Schutzausrüstungen.

Um unsere Geschicklichkeit zu maximieren, tragen wir oft ein Paar weiße Thermohandschuhe, die zwischen zwei Paar Nitrilhandschuhen eingeklemmt sind. Wechseln Sie die äußeren und Nitril Handschuhe häufig, wie sie leicht reißen, nachdem sie flüssigen Stickstoff ausgesetzt. In unserem Labor übertragen wir einen Aliquot von flüssigem Stickstoff in einen kleinen Fünf-Liter-Flüssigstickstoffbehälter.

Flüssiger Stickstoff wird dann in ein 50 ML Rohr gegossen, das auf Trockeneis vorgekühlt wurde. Sobald die 50 ML Tube voller flüssigen Stickstoff ist, fügen wir den Hefeextrakt langsam, tropfenweise, in 1,5 Milliliter-Schritten in die Röhre. Um die Bildung von großen Popcornpellets zu minimieren, wird die Hefesuspension in einer kreisförmigen Bewegung hinzugefügt.

Um die Bildung großer Popcornpellets weiter zu verhindern, verwenden wir große Zangen, um sicherzustellen, dass alle Pellets zwischen 0,3 und 0,5 Zentimeter durchmesser sind. Da flüssiger Stickstoff immer verdunstet, achten Sie darauf, das Rohr mit flüssigem Stickstoff nachzufüllen, bevor Sie jede 1,5 mil Aliquot Hefesuspension hinzufügen. Sobald die gesamte Hefesuspension zu Popcorn gemacht wurde, lassen Sie die Tube mit Popcorn ohne Deckel für zwei bis drei Minuten sitzen, um den gesamten restigen flüssigen Stickstoff verdampfen zu lassen.

Um sicher zu gehen, dass der gesamte flüssige Stickstoff verdampft ist, schließen Sie den Deckel fast vollständig und schütteln Sie sanft. Wenn es ein Zischen gibt, zeigt dies an, dass der flüssige Stickstoff noch nicht vollständig verdampft ist. Öffnen Sie den Deckel für eine weitere Minute oder so, damit der verbleibende flüssige Stickstoff verdampfen kann, bevor Sie den Deckel fest schließen.

Restflüssigkeit im Rohr kann eine Explosion verursachen, wenn der Deckel vorzeitig geschlossen wird. Dieses Hefe-Popcorn kann fast unbegrenzt in minus 80 Grad C gelagert werden. Für mindestens fünf Proben, stellen Sie sicher, dass Sie 30 bis 35 Liter flüssigen Stickstoff zur Verfügung haben. Füllen Sie die Gefriermühle bis zur vollen Linie und schließen Sie den Deckel, damit die Gefriermühle für ein paar Minuten vorgekühlt werden kann.

Denken Sie auch hier immer daran, persönliche Schutzausrüstung zu tragen, wenn Sie mit flüssigem Stickstoff umgehen. Die Polycarbonat-Schleiffläschchen, Edelstahl-Endstecker und der Schlagbügel müssen mit flüssigem Stickstoff vorgekühlt werden. Halten Sie diese Komponenten unter Wasser, bis der flüssige Stickstoff aufhört zu sprudeln.

Denken Sie daran, alle Popcornproben auf Trockeneis zu halten, bis der gesamte Schleifprozess abgeschlossen ist. Ziehen Sie den gesamten flüssigen Stickstoff aus den Schleiffläschchen heraus und übertragen Sie Ihr Popcorn in die Durchstechflasche. Vergessen Sie nicht, auch einen magnetischen Stoßstangen in die Schleifflasche zu legen.

Versiegeln Sie die Schleifflasche, indem Sie den Edelstahlstecker sorgfältig gleichmäßig am Ende der Schleifflasche platzieren. Wir knallen jedes Ende der Schleifflasche auf ein Holz-Brotbrett mit einer vibrationsabsorbierenden Gummiunterlage, um sicherzustellen, dass die Endstecker richtig platziert sind und die Schleiffläschchen fest versiegeln. Es ist wichtig, die Endstecker zu sichern, um sicherzustellen, dass sie sich nicht lösen und die Proben während des Schleifprozesses in der Gefriermühle verschütten können.

Legen Sie eine Schleifflasche in die Gefriermühle Schleifkammer und verriegeln. Schließen Sie den Gefrierwalzendeckel und schleifen Sie die Probe für drei Zyklen mit zwei Minuten pro Zyklus, bei einer Brechgeschwindigkeit von 14. Nach abschluss der Schleifzyklen entriegeln Sie die Durchstechflasche mit dem gefrorenen Pulverzelllysat.

Um zu verhindern, dass das Lysat austaut, arbeiten Sie schnell und vorsichtig, um einen der Endstecker mit dem Öffnungswerkzeug abzuschrauben. Sobald die Durchstechflasche geöffnet ist, entfernen Sie den Stoßstangen und übertragen Sie den gefrorenen Pulverextrakt schnell auf eine vorgekühlte Kunststoff-Wägeschale. So viel wie möglich vom gefrorenen Extrakt wiederherstellen, indem Sie die Durchstechflasche auf die Holzbrotplatte schlagen.

Sobald das gesamte Pulver aus der Durchstechflasche entfernt ist, übertragen Sie schnell alle Pulverextrakte in ein vorbeschriftetes 15-Mil-Rohr, das auf Trockeneis aufbewahrt wird. Obwohl es am besten ist, mit dem Auftauen und der Verwendung der Extrakte sofort fortzufahren, um den Proteinabbau zu minimieren, kann das gefrorene Pulverlysat bei Bedarf über Nacht bei minus 80 gelagert werden. Das Pulver lysieren langsam in einer Eisschlämme, die kontinuierlich mit einem magnetischen Rührstab in einem Eiskübel zirkuliert.

Um sogar das Auftauen zu erleichtern, entfernen Sie Eis, das sich häufig an der Außenseite der Rohre entwickelt, etwa alle fünf Minuten. Sobald die Extrakte beginnen, bei 1X Protease-Hemmer-Cocktail und 10 Mikromolar-Proteasom-Inhibitor MG132 zu tauen, um Proteinabbau zu verhindern. Sobald die Proben vollständig aufgetaut sind, was über eine Stunde dauern kann, drehen Sie die Proben bei 3, 220 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.

Diese Drehung wird den größten Teil des Zellabfalls aus dem Lysat entfernen. Wenn die Drehung abgeschlossen ist, übertragen Sie den Überstand in Polycarbonatflaschen, die auf Eis vorgekühlt wurden, und entsorgen Sie das Pellet. Zentrifugieren Sie das Supernat und Proben bei 16.000 G bei vier Grad Celsius für 20 Minuten, um den Extrakt zu klären.

Nachdem die Drehung abgeschlossen ist, erholen Sie nur den klaren Überstand vorsichtig aus der Mitte der Flüssigkeitssäule, ohne die trübe Schicht, die das Stück oben oder den pelletierten Schutt am Boden des Zentrifugenrohrs enthält, zu stören. Das klare Lysat in ein frisches vorgekühltes 15 Mil Rohr geben. Die verbleibende trübe Flüssigkeit kann kürzlich fünf Minuten lang mit der gleichen Geschwindigkeit geflüchtet werden, um die Rückgewinnung von etwas mehr des Großhandelslysats zu ermöglichen.

Die Extrakte sind nun für Experimente bereit, wie die Reinigung von Proteinkomplexen und die Immunpräzipitation. Wir verglichen zwei verschiedene Methoden der Hefezelllyse, nämlich Glasperlenfräsen bei vier Grad Celsius und eine automatisierte Kryoschleifmethode bei minus 196 Grad Celsius, um die relativ zurückgewonnenen Proteine und Zellextrakte zu bewerten, die mit beiden Methoden hergestellt wurden. Aus dieser Studie haben wir uns für einen angehenden Hefestamm entschieden, der ein Hochkopie-Plasmid trägt, das ein Tandem HIS-MYC mit Ubiquitin ausdrückt.

So können wir die Affinität der Rückgewinnung von markierten polyubiquitinierten Proteinen aus Großhandelsextrakten nach Derinitätsreinigung mit TALON Kobalt HIS-Tag-Affinitätsperlen bewerten, gefolgt von Western Blotting mit einem monoklonalen HIS-Tag-Antikörper. Polyubiquitinierte Proteine, die aufgrund ihres schnellen Abbaus durch die Ubiquitin-Proteasom-Maschinen normalerweise sehr kurzlebig sind und somit eine sehr gute Möglichkeit bieten, die Qualität der mit verschiedenen Methoden hergestellten Großhandelsextrakte zu vergleichen. Wie wir an der rechten Hälfte der Ponceau-Buntmembran sehen, haben wir in den Großhandelsextrakten, die durch das Kryo-Gefriermühlenprotokoll hergestellt werden, einen höheren Gesamtproteinertrag zurückgewonnen, wie die intensivere Ponceau-Färbung in der gesamten Großhandels-Extraktspur beurteilt.

Besonders deutlich wird dies im unteren und oberen Teil der Gefriermühle ganze Auszüge. Darüber hinaus beobachteten wir, wie die rechte Hälfte des HIS-Tags Western Blot zeigt, eine bessere Erholung des UBIquitinierten PROTEINS mit HIS-MYC-Tag, gefolgt von Einem Abziehen mit Talon-Perlen aus den Großhandelsextrakten, die durch kryogenes Schleifen hergestellt werden. Wir kommen zu dem Schluss, dass die kryogene Gefriermühle anderen Methoden zur Herstellung von Zellextrakten überlegen ist, insbesondere wenn funktionelle Makromoleküle für die nachgeschaltete Anwendung benötigt werden.