Isolierung von Geweben des Zentralnervensystems und zugehörigen Hirnhäuten für die nachgeschaltete Analyse von Immunzellen

In dieser Arbeit werden zwei optimierte Protokolle für die Untersuchung von residenten und peripher abgeleiteten Immunzellen innerhalb des zentralen Nervensystems, einschließlich des Gehirns, des Rückenmarks und der Hirnhäute, vorgestellt. Jedes dieser Protokolle trägt dazu bei, die Funktion und Zusammensetzung der Zellen zu bestimmen, die diese Kompartimente unter stationären und entzündlichen Bedingungen besetzen.

Die schnelle Isolierung von ZNS-Geweben einschließlich der Hirnhäute ermöglicht eine umfassende Analyse des Phänotyps, der Funktion und der Lokalisation von Immunzellen bei homöostatischen und pathogenen Zuständen. Die beiden demonstrierten Methoden ermöglichen die schnelle Extraktion von ZNS-Geweben mit den Hirnhäuten, ideal für die nachgelagerte Analyse mit Einzelzelltechniken und histologischen Methoden. Obwohl sich die repräsentativen Ergebnisse auf die Analyse von Immunzellen konzentrieren, können diese beiden Methoden zur Analyse von ZNS-residenten Zellen verwendet werden, einschließlich Mikroglia, Astrozyten, Perizyten, Endothelzellen, Stromazellen und Neuronen.

Beginnen Sie mit der Isolierung von Gehirn- und Rückenmarksproben von euthanasierten Mäusen. Nachdem Sie den Kopf entfernt haben, machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie in der Haut und drehen Sie ihn über die Augen, um den Schädel zu befreien. Schnitt am Nasenbein, um den Unterkiefer vom Schädel zu lösen.

Entfernen Sie dann den Unterkiefer, die Zunge und die Augen. Schneiden Sie entlang der lateralen Aspekte des Schädels, um das Gewebe entlang des äußeren Gehörgangs freizugeben und zu kürzen. Um die Rückenmarksprobe zu entnehmen, trennen Sie den Brustkorb von der Wirbelsäule, indem Sie mit einer scharfen Schere parallel zur Wirbelsäule schneiden.

Machen Sie einen kleinen Schnitt im unteren Lendenbereich, um die Wirbelsäule zu isolieren, und kürzen und entfernen Sie dann alle verbleibenden Muskeln entlang der Wirbelsäule, um die Wirbel freizulegen. Wenn Sie eine Entkalkung durchführen, überprüfen Sie den Knochen täglich, um festzustellen, ob er weich und biegsam ist. Entfernen Sie das Gewebe mit einer Pinzette aus der EDTA-Lösung, legen Sie es auf eine Petrischale und testen Sie vorsichtig die Knochenweichheit mit einer 25-Gauge-Nadel.

Dringt die Nadel leicht in den Knochen ein, ist der Entkalkungsprozess abgeschlossen. Um die Schädelkappe im Gehirn zu extrahieren, machen Sie einen Mittellinienschnitt in der Haut und drehen Sie die Haut über die Augen. Platzieren Sie die Schere innerhalb des Foramen magna und beginnen Sie, den Schädel seitlich entlang der Kortiken in Richtung Riechkolben zu schneiden, wobei Sie die Schnitte über dem äußeren Gehörgang und dem Unterkiefer halten.

Führen Sie die gleichen Schnitte auf der gegenüberliegenden Seite durch, wobei sich die Schnitte am Riechkolben treffen, um die Schädelkappe vom Gehirn zu befreien. Schälen Sie die Schädelkappe mit einer Pinzette ab und legen Sie sie in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen, das fünf Milliliter kaltes RPMI-Medium enthält, das mit 25 Millimolar HEPES ergänzt wird. Platzieren Sie eine gebogene Pinzette unter der Basis des Gehirns und heben Sie sie an, um das Gehirn von der Schädelkappe zu befreien.

Entnehmen Sie die Wirbelsäule und das Rückenmarksgewebe, indem Sie parallel zur Wirbelsäule schneiden, um den Brustkorb von der Wirbelsäule zu trennen. Machen Sie dann einen kleinen Schnitt im unteren Lendenbereich, um die Wirbelsäule zu isolieren. Trimmen und entfernen Sie alle verbleibenden Muskeln entlang der Wirbelsäule, um die Wirbel freizulegen.

Platzieren Sie anschließend die extra feine chirurgische Schere in der Wirbelsäule und schneiden Sie entlang des seitlichen Randes der Säule. Schneiden Sie die gegenüberliegende Seitenkante komplett ab, um die Wirbelsäule in einen vorderen und einen hinteren Teil zu teilen. Lösen Sie das Rückenmark mit einer Pinzette langsam und vorsichtig von der Wirbelsäule ab und legen Sie es in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen, das fünf Milliliter kaltes RPMI mit 25 Millimolar HEPES enthält.

Übertragen Sie dann den vorderen und hinteren Teil der Wirbelsäule in eine andere Röhre. Um die Hirnhäute von der Schädelkappe zu entfernen, nehmen Sie die Schädelkappe aus dem RPMI-Medium und verwenden Sie eine scharfe Pinzette, um den äußeren Rand zu ritzen. Schälen Sie die Hirnhäute vom Rand der Schädelkappe, kratzen Sie, um die duralen und arachnoidalen Hirnhäute zu entfernen, und legen Sie die Hirnhäute auf eine Petrischale.

Um die Hirnhäute aus der Wirbelsäule zu entfernen, nehmen Sie die Säule aus dem Medium und ritzen Sie mit einer scharfen Pinzette um die Ränder der Wirbelsäule herum, um die Hirnhäute zu befreien. Lösen Sie mit einer gebogenen Pinzette die Hirnhäute vom Rand der Wirbel ab und legen Sie die Hirnhäute auf eine Petrischale. Legen Sie ein Nylon-Netzsieb in ein konisches 50-Milliliter-Rohr.

Um eine Zellsuspension herzustellen, geben Sie die Hirnhäute in ein Sieb und fügen Sie drei Milliliter mit HEPES ergänztes RPMI hinzu, dann verwenden Sie einen Kolben aus einer Fünf-Milliliter-Spritze, um das Gewebe und das Medium durch das Sieb zu mahlen. Gießen Sie das Gehirn- oder Rückenmarksgewebe mit dem Medium in eine 100-Millimeter-Petrischale und bewegen Sie das Gewebe mit einer Pinzette nach unten. Zerkleinern Sie das Hirngewebe mit einer sterilen Rasierklinge und sammeln Sie das Gewebe am Boden der Platte.

Geben Sie drei Milliliter RPMI, ergänzt mit 10 % FCS, in die Petrischale, verwenden Sie dann eine serologische 10-Milliliter-Pipette, um das Gewebe im Medium zu resuspendieren und in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen zu übertragen. Geben Sie Kollagenase Typ 1 und DNase 1 in das Gewebe und inkubieren Sie die Röhrchen 40 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Drehen Sie die Röhren alle 15 Minuten um, um das Gewebe gründlich mit den Enzymen zu vermischen.

Nach der Inkubation geben Sie EDTA in jedes Röhrchen für eine Endkonzentration von 0,01 molar und inkubieren Sie die Röhrchen weitere fünf Minuten lang, um die Kollagenase zu inaktivieren. Geben Sie neun Milliliter RPMI, ergänzt mit 10 % FCS, in jedes Röhrchen und zentrifugieren Sie die Röhrchen dann fünf Minuten lang bei 450 g bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie eine Pasteurpipette mit einem Vakuum, um den Überstand abzusaugen, und achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu berühren.

Fügen Sie dem Zellpellet drei Milliliter isotonische Dichtegradientenlösung zu 100 % hinzu und fügen Sie dann zusätzliches RPMI 10 %FCS-Medium hinzu, um das endgültige Volumen auf 10 Milliliter zu bringen und das Zellpellet wieder zu resuspendieren. Drehen Sie das Röhrchen um und mischen Sie es gut, dann führen Sie eine serologische Pipette mit einem Milliliter 70%iger isotonischer Dichtegradientenlösung in den Boden des Röhrchens ein. Lege die Lösung langsam unter und achte darauf, dass keine Blasen entstehen.

Nehmen Sie die serologische Pipette aus dem Röhrchen und achten Sie darauf, den Gradienten nicht zu stören. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 800 g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius und aspirieren Sie dann den Überstand einschließlich der Myelin-Trümmerschicht, bis zwei bis drei Milliliter im Röhrchen verbleiben. Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um die Zellschicht zwischen dem Dichtegradienten von 30 % und 70 % zu ernten, und übertragen Sie sie in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen.

Fügen Sie RPMI 10 %FCS-Medien hinzu, um das endgültige Volumen auf 15 Milliliter zu bringen, und zentrifugieren Sie die Zellen dann fünf Minuten lang bei 450 g bei vier Grad Celsius. Dieses Protokoll wurde verwendet, um B- und T-Zellen in den Hirnhäuten, im Gehirn und im Rückenmark während der progressiven Multiplen Sklerose zu beurteilen. Das Gating wurde durchgeführt, um CD45-hochperipher abgeleitete infiltrierende Immunzellen von CD45-niedrigen Mikroglia und CD45-negativen Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten zu unterscheiden.

Im Rückenmark und im Hirngewebe von scheinbehandelten Mäusen waren nur wenige CD45-hohe Zellen vorhanden. Der gleiche Gating-Cutoff für eine hohe CD45-Expression wurde in den Hirnhäuten verwendet, um CD45-Zellen mit hohem Immungehalt zu identifizieren und nicht-immune Zellen auszuschließen. In allen TMEV-IDD-ZNS-Geweben wurden im Vergleich zu scheinbehandelten Mäusen erhöhte Prozentsätze von CD45-hochimmunen Zellen beobachtet.

Während der chronischen TMEV-IDD war der Anteil von B-Zellen unter den CD45-hochimmunen Zellen im Gehirn und Rückenmark im Vergleich zum meningealen Kompartiment höher. Entkalkte Gehirne und Rückenmark wurden abgebildet, um die Lokalisation von B- und T-Zellen innerhalb des ZNS-Kompartiments zu identifizieren. Die konventionelle Extraktion des Gehirns aus der Schädeldecke ergab eine intakte Pia-Schicht, die restlichen Hirnhautschichten wurden jedoch ausgeschlossen.

Sowohl im entkalkten Gehirn als auch im Rückenmark waren alle Hirnhautschichten intakt. Isotyp-geschaltete B-Zellen und T-Zellen wurden mit IgG- bzw. CD3-Expression lokalisiert. Die Kofärbung von IgG mit ER-TR7 zeigte, dass B-Zellen im ZNS-Parenchym und in den Hirnhäuten vorhanden waren, während zelluläre Aggregate innerhalb der ER-TR7-positiven Hirnhäute mehrere IgG-positive B-Zellen und CD3-positive T-Zellen enthielten.

Ein kritischer Schritt in diesen Protokollen ist die sorgfältige Extraktion des ZNS-Gewebes, die für die Verbesserung der Reinheit von Einzelzellsuspensionen und für die Gewinnung von histologischem Gewebe mit hochwertiger Morphologie unerlässlich ist. Die beschriebenen Techniken ermöglichen eine umfassende Analyse von Zellen, die das ZNS-Kompartiment besetzen, ideal für die Untersuchung des Zellphänotyps, der Funktion und der Lokalisation unter Homöostase und während der Krankheitspathogenese.