Name: Modellierung altersassoziierter neurodegenerativer Erkrankungen bei Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Erfahren Sie Methoden zur Untersuchung altersassoziierter neurodegenerativer Erkrankungen bei Caenorhabditis elegans. Diese Techniken ermöglichen die Analyse zellulärer Mechanismen neuronaler Degeneration.

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Wir danken Chaniotakis M. und Kounakis K. für die Videoaufnahme und -bearbeitung. K.P. wird durch ein Stipendium der Hellenischen Stiftung für Forschung und Innovation (HFRI) und des Generalsekretariats für Forschung und Technologie (GSRT) finanziert. N.T. wird durch Zuschüsse des Europäischen Forschungsrats (ERC – GA695190 – MANNA), der Rahmenprogramme der Europäischen Kommission und des griechischen Bildungsministeriums finanziert.

1. Nekrotische Zelltod-induziert durch hyperaktive Ionenkanäle
HINWEIS: Gain-of-Funktionsmutationen in der Genfamilie von Degenerinen, einschließlich mec-4 und deg-3 unter anderem, führt zur Erzeugung von hyperaktiven Ionenkanälen, die den nekrotischen Zelltod von sechs Für die Mechanosensation bei Würmern erforderlichen Mürrezeptorneuronen auslösen3. Nekrose, die durch die aberrante Stimulation von Degenerinen induziert wird, weist mehrere mechanistische und morphologische Ähnlichkeiten mit der Exzitotoxizität bei Säugetieren auf. Die Aufrechterhaltung des Energiestoffwechsels und der Kalziumhomöostase spielt eine entscheidende Rolle für das neuronale Überleben während der Nekrose11. Die folgenden Stämme können verwendet werden, um den nekrotischen Zelltod zu überwachen, der durch hyperaktive Ionenkanäle, mec-4(u231)X und deg-3(u662)Vausgelöst wird.
<ol><li>Wartung, Synchronisation und Vorbereitung mutierter Würmer zur Untersuchung des nekrotischen Zelltodes<ol>
<li>Tag 1: L4-Larven von mec-4(u231) oder deg-3(u662) mutierten Nematoden auf Nematode Growth Media (NGM; Tabelle 1) Platten, die mit Escherichia coli (OP50) mit einem sezierenden Stereomikroskop gesät wurden.</li>
		<li>10 L4 Nematoden pro gesäter NGM-Platte platzieren und bei der Standardtemperatur von 20 °C anbauen.</li>
		<li>Tag 5: Waschen Sie die Platten mit 1 ml M9 Puffer (Tabelle 1) und sammeln Sie die Tiere in einem 1,5 ml Rohr.</li>
		<li>Zentrifuge bei 10.000 x g für 30 s und entfernen Sie den Überstand.</li>
		<li>Fügen Sie 0,5 ml Bleichlösung (7 mlH2O, 1 ml 5 N NaOH und 2 ml Bleichmittel) hinzu. ANMERKUNG: Bleichlösung verliert allmählich ihre Effizienz; daher sollte es täglich vorbereitet werden.</li>
		<li>Wirbel und überwachen regelmäßig, bis sich die Würmer aufgelöst haben. HINWEIS: Vermeiden Sie Bleichen für Zeiträume von mehr als 5 min, da die Lebensfähigkeit der Embryonen beeinträchtigt wird.</li>
		<li>Zentrifuge bei 10.000 x g für 30 s und entfernen Sie den Überstand.</li>
		<li>Zweimal das Pellet (Eier) mit 1 ml M9-Puffer waschen.</li>
		<li>Nach dem Waschen die Eier in 200 l M9-Puffer wieder aufhängen und 25 min bei 34 °C in einem Wasserbad bebrüten.</li>
		<li>Bewahren Sie eine separate Gruppe von Kontrollproben (Eier) bei 20 °C auf.</li>
		<li>Pipette 100 l Kontroll- oder Hitzeschock-behandelte Eier und legen Sie sie auf nicht gesäte NGM-Platten. Jeder Teller enthält mindestens 100-200 Eier.</li>
		<li>Die Eier bei 20 °C bis zum Schlüpfen inkubiert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montage von L1-Larven zur Untersuchung mit Differentialinterferenzkontrast (DIC; Nomarsky) Mikroskopie<ol>
<li>Bereiten Sie 2% Agarose-Pads vor.</li>
		<li>Verwenden Sie 1 ml M9-Puffer, um die Platten zu waschen und L1-Larvennematoden in 1,5 ml Rohren zu sammeln.</li>
		<li>Zentrifuge bei 10.000 x g für 30 s.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand und halten Sie das Pellet (Nematoden).</li>
		<li>Fügen Sie 100 l von 20 mM M9/Levamisol-Puffer hinzu, um die Nematoden zu anästhesieren. HINWEIS: Vermeiden Sie Natriumazid als Anästhetikum. Natriumazid löst mitochondriale Schäden und oxidativen Stress aus, was schließlich zur Zelltodinduktion führt</li>
		<li>Pipette 10 l M9/Levamisol-Puffer mit L1-Würmern und montieren sie auf 2% Agarose-Pads (Tabelle 1).</li>
		<li>Legen Sie vorsichtig einen Coverslip auf die Oberseite der Probe. HINWEIS: Versiegeln Sie den Deckelschlupf mit Nagellack, um die Feuchtigkeit während des gesamten Bildgebungsprozesses zu erhalten.</li>
		<li>Beobachten Sie Würmer mit differenziellem Interferenzkontrast (DIC; Nomarsky) Mikroskopie.</li>
		<li>Score Neurodegeneration der sechs Touch-Rezeptor-Neuronen durch Zählen von Zellen mit dem charakteristischen vakuolierten Aussehen pro Nematode.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Protein-Aggregat-induzierte Neurodegeneration
ANMERKUNG: Die folgenden Stämme können verwendet werden, um Proteinaggregate-induzierte Neurotoxizität zu untersuchen: (A) Überexpression von humanem UA44: Ist[baIn1; pdat-1-syn, pdat-1GFP] und (B) Überexpression des menschlichen Polyglutaminproteins (PolyQ) pan-neuronal, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]6,10.
<ol><li>Wartung, Synchronisation und Vorbereitung transgener Nematoden für Neurodegeneration assay<ol>
<li>Verwenden Sie ein sezierendes Stereomikroskop, um die Entwicklung und das Wachstum von C. elegans zu überwachen.</li>
		<li>Tag 1: Synchronisieren Sie die Population transgener Nematoden, indem Sie 15-20 L4-Larven jeder Sorte auf frisch OP50-saatierte NGM-Platten pflücken und übertragen. HINWEIS: Verwenden Sie mindestens drei Platten pro Sorte pro Bedingung.</li>
		<li>Inkubieren und lassen Sie die Nematoden bei der Standardtemperatur von 20 °C wachsen.</li>
		<li>Tag 2: Führen Sie die tägliche Vorkonditionierung für 30 Minuten durch Übertragung der Platten in einem Inkubator auf 34 °C. Dann kehren Sie die vorbedingungenmäßigen Nematoden bei der Standardtemperatur von 20 °C zurück. HINWEIS: Verschiedene genetische Hintergründe können empfindlich auf hohe Temperaturen für längere Zeit Exposition.</li>
		<li>(A) Bei der Untersuchung der Überexpression von humanem Synuclein in dopaminergen Neuronen, UA44: Ist[baIn1; pdat-1-syn, pdat-1GFP]: am Tag 9 7 Tage alte transgene Nematoden für den dopaminergen neuronalen Zelltod überwachen.</li>
		<li>(B) Bei der Untersuchung der Überexpression von humanem Polyglutaminprotein (PolyQ) panneuronal, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]: messen Sie an Tag 5 neuronale PolyQ-Aggregate im Kopfbereich von 4 Tage alten transgenen Tieren, die Q40::YFP exdrücken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montage der Proben für die mikroskopische Untersuchung<ol>
<li>Bereiten Sie 2% Agarose Pads (Tabelle 1).</li>
		<li>Fügen Sie in der Mitte des Agarose-Pads 10 l von 20 mM M9/Levamisol-Pufferabfall hinzu.</li>
		<li>Wählen Sie die jeweiligen transgenen Nematoden und übertragen Sie sie in einem M9/Levamisol-Tropfen. HINWEIS: Platzieren Sie 20-30 Nematoden pro Tropfen.</li>
		<li>Legen Sie vorsichtig einen Coverslip auf die Oberseite der Probe. HINWEIS: Versiegeln Sie den Deckelschlupf mit Nagellack, um die Feuchtigkeit während des gesamten Bildgebungsprozesses zu erhalten.</li>
		<li>Fahren Sie mit der mikroskopischen Untersuchung der jeweiligen Proben fort.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erfassungsprozess und Datenanalyse von transgenen Nematoden, die in dopaminergen Neuronen mit-Synuclein und zytosolic GFP exzessieren<ol>
<li>Verwenden Sie ein Epifluoreszenzmikroskop in Kombination mit einer Kamera (z. B. EVOS FL Auto 2).</li>
		<li>Erkennen und erfassen Sie Z-Stack-Bilder des Kopfbereichs bei 20-facher Vergrößerung.</li>
		<li>Speichern und sammeln Sie die maximale Intensität Projektionsbilder.</li>
		<li>Fahren Sie mit der Analyse der erfassten Bilder fort.</li>
		<li>Untersuchen Sie die transgenen Würmer für die Neurodegeneration, indem Sie die folgenden zellulären Merkmale, (i) Denkodivenverlust von Neuronen, die GFP unter dem Promotor von dat-1, (ii) Neuronen zeigen, die Soma und/oder axonale Blebbing, Auswüchse oder dendritischen Verlust aufweisen, bewertet.</li>
		<li>Importieren und Analysieren der Daten mithilfe eines Softwarepakets (z. B. Excel).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Erfassungsprozess und Datenanalyse von transgenen Nematoden, die panneuronal PolyQ40 mit YFP verschmolzen
<ol><li>Verwenden Sie ein Epifluoreszenzmikroskop in Kombination mit einer Kamera (z. B. EVOS FL Auto 2).</li>
	<li>Erkennen und erfassen Sie Z-Stack-Bilder des Kopfbereichs bei 20-facher Vergrößerung.</li>
	<li>Speichern und sammeln Sie die maximale Intensität Projektionsbilder.</li>
	<li>Fahren Sie mit der Analyse der erfassten Bilder fort, indem Sie Die Fidschi-Software verwenden.</li>
	<li>Öffnen Sie Bilder mit Fidschi-Programm14.</li>
	<li>Wählen Sie den Befehl Kanäle teilen über das Dropdown-Menü Bild und Farbe aus. HINWEIS: Behalten Sie das Grüne Kanalbild bei.</li>
	<li>Verwenden Sie das Freihandauswahltool, um den fluoreszierenden Bereich manuell einzustellen (ROI; z.B. Kopf).</li>
	<li>Fügen Sie den jeweiligen ROI im ROI Manager über das Dropdown-Menü Analysieren und Tools hinzu.</li>
	<li>Subtrahieren Sie den Hintergrund auf 50 %, indem Sie Prozess und Hintergrund subtrahierenauswählen.</li>
	<li>Festlegen und Anwenden von Schwellenwerten über den Menübefehl Bild | Anpassen | Schwellenwert. Behalten Sie die gleichen Schwellenwerte während der gesamten Bildanalyse des gesamten Experiments bei und legen Sie sie fest.</li>
	<li>Wählen Sie den jeweiligen ROI aus dem ROI Manageraus.</li>
	<li>Analysieren Sie die Anzahl der Proteinaggregate mithilfe des Menübefehls Partikel analysieren und analysieren.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.5-3.12 für jedes aufgenommene Bild.</li>
	<li>Kopieren Sie die Anzeigewerte aus dem separaten Ergebnisfenster.</li>
	<li>Fügen Sie die Ergebnisse ein/importieren und analysieren Sie sie mithilfe eines Softwarepakets.</li>
</ol>4. Statistische Auswertung melden
<ol><li>Verwenden Sie mindestens 30 Nematoden für jede experimentelle Erkrankung. Führen Sie drei biologische Replikationen durch.</li>
	<li>Verwenden Sie statistische Analysesoftware, um entweder Studenten-t-Test(Vergleich zwischen zwei Gruppen) oder ANOVA (Vergleich zwischen mehreren Gruppen) für statistische Analysen mit p < 0,05 als signifikant durchzuführen.</li>
</ol>

<ol><li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necrotic+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).</li>
<li>Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemistry+of+neuronal+necrosis%3A+rogue+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).</li>
<li>Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+mechanotransduction%3A+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).</li>
<li>Berkowitz, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+C.+elegans+dopamine+neuron+degeneration+assay+for+the+validation+of+potential+Parkinson%27s+disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson's disease genes.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
<li>Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+proteins+at+the+pathogenic+threshold+display+neuron-specific+aggregation+in+a+pan-neuronal+Caenorhabditis+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model.</a> Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).</li>
<li>Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+disruption+of+cellular+protein+folding+in+models+of+polyglutamine+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases.</a> Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson%27s+disease+protein+alpha-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).</li>
<li>Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+cellular+proteostasis+in+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways of cellular proteostasis in aging and disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).</li>
<li>Labbadia, J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+proteostasis+in+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The biology of proteostasis in aging and disease.</a> Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).</li>
<li>Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+dopamine+neuron+degeneration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling dopamine neuron degeneration in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 793, 129-148 (2011).</li>
<li>Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+heat-shock+proteins+protect+from+heat-stroke-associated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration.</a> Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).</li>
<li>Kourtis, N., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+heat+shock+proteins+and+neurodegeneration%3A+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22BioMolecular+Concepts%22%5BJournal%5D)">Small heat shock proteins and neurodegeneration: recent developments.</a> BioMolecular Concepts. 9 (1), 94-102 (2018).</li>
<li>Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormetic+heat+stress+and+HSF-1+induce+autophagy+to+improve+survival+and+proteostasis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans.</a> Nature Communications. 8, 14337(2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+during+ageing+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans.</a> Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).</li>
<li>Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+required+for+necrotic+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Hier stellen wir allgemein zugängliche Methoden für Wachstum, Synchronisation und mikroskopische Untersuchung einiger vielseitiger C. elegans-Modelle zur Untersuchung der altersabhängigen Neurodegeneration vor und beschreiben sie. Insbesondere bewerten und sezieren wir die zellulären und molekularen Grundlagen des altersbedingten neuronalen Abbaus unter Verwendung von hyperaktivierter Ionenkanal-induzierter Nekrose und Protein-Aggregat-induzierter Neurotoxizität1,<sup class="xr...

In den letzten zwei Jahrzehnten wurde C. elegans weithin als Modellorganismus verwendet, um die molekularen Mechanismen des nekrotischen Zellsterbens zu untersuchen. C. elegans bietet ein außergewöhnlich gut charakterisiertes und kartiertes Nervensystem, eine transparente Körperstruktur und ein vielfältiges Repertoire an genetischen und bildgebenden Methoden zur Überwachung der in vivo zellulären Funktion und des Überlebens während des gesamten Alterns. So wurden bereits mehrere genetische Modelle von C. elegans der Neurodegeneration entwickelt, um die neuronale Lebensfähigkeit zu bewerten. Insbesondere sind gut beschriebene und verwendete Nematodenmodelle die hyperaktive Ionenkanal-induzierte Nekrose1,2,3 und der Zelltod, ausgelöst durch erhöhte Proteinaggregation4,5,6,7,8,9,10 und Hitzehub11,12, unter anderem.
Die kurzfristige Exposition gegenüber subtödlichen Temperaturen führte zu einer Resistenz gegen den nekrotischen Zelltod, ausgelöst durch einen anschließenden Hitzestress sowohl bei Nematoden als auch bei Säugetierneuronen11. Interessanterweise schützt die tägliche Vorkonditionierung von Nematoden bei einer milden erhöhten Temperatur vor Neurodegeneration, die durch verschiedene Reize wie ionisches Ungleichgewicht (z.B. mec-4(u231) und/oder deg-3(u662)) und Proteinaggregation (z.B. Synuclein und PolyQ40)11,13verursacht wird.
Hier beschreiben wir vielseitige Methoden, mit denen C. elegans verwendet wird, um die altersabhängige Neurodegeneration in etablierten Modellen menschlicher Krankheiten zu überwachen und zu bewerten, wie z. B. exzitotoxizitätsgesteuerter Zelltod, Parkinson und Huntington. Darüber hinaus unterstreichen wir die neuroprotektive Rolle der Wärmevorkonditionierung in mehreren Modellen der Neurodegeneration. Eine Kombination dieser Techniken zusammen mit genetischen und/oder pharmakologischen Screens wird zur Identifizierung und Charakterisierung neuartiger Zelltodmodulatoren mit potenziellem therapeutischem Interesse führen.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biozym</td><td>8,40,004</td><td></td></tr><tr><td>AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dehydrat (CaCl2?2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>SERVA Elektrophorese</td><td>17101.01</td><td></td></tr><tr><td>deg-3(u662)V oder deg-3(d)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Halten Sie Tiere bei 20 & Grad; C</td></tr><tr><td>DIC Mikroskop (Nomarsky)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Axio Vert A1</td></tr><tr><td>Präparier-Stereomikroskop</td><td>Nikon Corporation</td><td></td><td>SMZ645</td></tr><tr><td>Epifluoreszenzmikroskop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>EVOS Cell Imaging Systems</td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50 Stamm</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Greiner Petri Schüsseln (60 mm x 15 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5237</td><td></td></tr><tr><td>Bildanalysesoftware</td><td>Fidschi</td><td></td><td>https://fiji.sc</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>EMD Millipore</td><td>1.37.010</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>EMD Millipore</td><td>1.04.873</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>mec-4(u231)X oder mec-4(d)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Halten Sie Tiere bei 20 μd; C</td></tr><tr><td>Objektträger (75 mm x 25 mm x 1 mm)</td><td>Marienfeld, Lauda-Königshofen</td><td>10 006 12</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas (18 mm x 18 mm)</td><td>Marienfeld, Lauda-Königshofen</td><td>01 010 30</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Office 2011 Excel-Softwarepaket</td><td>Microsoft Corporation, Redmond, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD Millipore</td><td>1.06.586</td><td></td></tr><tr><td>Nematoden-Wachstumsmedium (NGM)-Agarplatten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nystatin-Stammlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3503</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>BD, Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>EMD Millipore</td><td>1,06,40,41,000</td><td></td></tr><tr><td>Standardausrüstung zur Herstellung von Agarplatten ( Autoklav, Petrischale, etc.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standardausrüstung für die Wartung von Würmern (Platindrahtpickel, Inkubatoren usw.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software für statistische Analyse</td><td>GraphPad Software Inc., San Diego, USA</td><td></td><td>GraphPad Prism Softwarepaket</td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Tetramisol hydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>UA44: Is[baIn1; pdat-1&alpha;-syn, pdat-1GFP]</td><td></td><td></td><td>Auf Anfrage: G. Caldwell (Universität von Alabama, Tuscaloosa AL)</td></tr></tbody></table>

modellierung altersassoziierter neurodegenerativer erkrankungen bei caenorhabditis elegans

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Die Bekämpfung menschlicher neurodegenerativer Pathologien und die Bewältigung ihrer allgegenwärtigen sozioökonomischen Auswirkungen werden zu einer globalen Priorität. Ungeachtet ihrer nachteiligen Auswirkungen auf die Lebensqualität des Menschen und das Gesundheitssystem ist die Mehrheit der neurodegenerativen Erkrankungen des Menschen nach wie vor unheilbar und nicht vermeidbar. Daher wird die Entwicklung neuartiger therapeutischer Interventionen gegen solche Krankheiten zu einer dringenden Dringlichkeit. Die altersassoziierte Verschlechterung der neuronalen Schaltkreise und -funktion wird in so unterschiedlichen Organismen wie dem niederschwelligen Wurm Caenorhabditis elegans und dem Menschen evolutionär konserviert, was Ähnlichkeiten in den zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen bedeutet. C. elegans ist ein hochformbares genetisches Modell, das ein gut charakterisiertes Nervensystem, Körpertransparenz und ein vielfältiges Repertoire an genetischen und bildgebenden Verfahren zur Beurteilung der neuronalen Aktivität und Qualitätskontrolle während des Alterns bietet. Hier führen wir Methoden mit einigen vielseitigen Nematodenmodellen ein, einschließlich hyperaktivierter Ionenkanal-induzierter Nekrose (z. B. deg-3(d) und mec-4(d)) und Proteinaggregat (z. B. Syunclein und Polyglutamat)-induzierte Neurotoxizität, um die zelluläre und molekulare Untermauerung altersbedingter Neuronenzugung zu überwachen und zu sezieren. Eine Kombination dieser Tier-Neurodegeneration-Modelle, zusammen mit genetischen und pharmakologischen Screens für Zelltodmodulatoren, wird zu einem beispiellosen Verständnis des altersbedingten Abbaus der neuronalen Funktion führen und kritische Einblicke mit breiter Relevanz für die menschliche Gesundheit und Lebensqualität liefern.

Nekrotische Zelltod-induziert durch hyperaktive Ionenkanäle Mit den hier vorgestellten Verfahren wurden mec-4(u231) und deg-3u662) mutierte Embryonen entweder 25 min bei 34 °C inkubiert oder bei der Standardtemperatur von 20 °C gehalten. Beim Schlüpfen wurde die Anzahl der neuronalen Zellleichen im L1-Larvenstadium beider Gruppen bestimmt. Nekrotische Zelltod wird in Nematoden, die aus Hitzeschock vorkonditionierte Eier geschlüpft vermindert(Abbildung 1<...

Hier führen wir weithin zugängliche Methoden mit einigen vielseitigen Nematodenmodellen ein, einschließlich hyperaktivierter Ionenkanal-induzierter Nekrose und Protein-Aggregat-induzierter Neurotoxizität, um die zellulären und molekularen Grundlagen altersassoziierter neurodegenerativer Erkrankungen zu überwachen und zu sezieren.

Modellierung altersassoziierter neurodegenerativer Erkrankungen bei Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

In den letzten Jahrzehnten wurde die Lebensspanne der Menschen aufgrund der Verbesserung des Lebensstandards und der Fortschritte in der medizinischen Wissenschaft verlängert. Das Alter ist der größte Risikofaktor für viele lebensbedrohliche Krankheiten, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson und Huntington. Hier zeigen wir Methoden unter Verwendung einiger vielseitiger neuer Methodenmodelle, einschließlich hyperaktiver Ionenkanal-induzierter Nekrose und Proteinaggregate, die Neurotoxizität induzieren, um den zellulären molekularen Mechanismus der neuronalen Degeneration zu überwachen und zu sezieren.Peak gesunde Larven aus machen vier und machen drei Newton Nematoden auf Nematoden Wachstumsmedienplatte, Siebung mit E.Coli mit sezierenden Stereomikroskop. Platzieren Sie zehn und vier Nematoden, parasitäre Enzymplatte und wachsen Sie sie bei der Standardtemperatur von 20 Grad Celsius. Fünf Tage später die Platte mit 1 ml und 9 Puffer waschen und die Tiere in 1,5 ml Rohr sammeln.Zentrifugieren Sie 30 Sekunden lang bei 30.000 g und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie 0,5 ml Beschichtungslösung hinzu. Die Beschichtungslösung wird bei Raumtemperatur gelagert.Wirbel und überwachen regelmäßig, bis sie sich alle aufgelöst haben. Vermeiden Sie die Beschichtung für Zeiträume von mehr als fünf Minuten. Zentrifugieren Sie 30 Sekunden lang bei 10.000 g und entfernen Sie den Überstand.Zweimal die Palette mit 1 ml und neun Puffern waschen. Zentrifugieren Sie 30 Sekunden lang bei 10000 g und entfernen Sie den Überstand. Nach dem Waschen die Eier in 200 MikroliterM9-Puffer wieder aussetzen und 25 Minuten bei 34 Grad Celsius in einem Wasserbad bebrüten.Pflegen Sie eine separate Gruppe von Eiern bei 20 Grad Celsius. Pipette 100 Mikroliter mit Kontroll- oder Hitzeschock behandelten Eiern und legen Sie sie auf ungesättigte 10 GN Platte. Jeder Teller enthält mindestens 100 bis 200 Eier.Die Eier bei 20 Grad Celsius bis zum Schlüpfen bebrüten. Verwenden sie und M9 Puffer, um Platten zu waschen und L1 Leben und Nematoden in 1,5 ml Tube zu sammeln. Zentrifuge bei 10.000 g für 30 Sekunden.Entfernen Sie den Überstand und behalten Sie die Palette bei. Fügen Sie 100 Mikroliter 20 Millimolar M9 LevangialPuffer hinzu, um die Nematoden zu anästhesieren. Pipette 10 Mikroliter M9-Levangialpuffer, die L1-Uhr enthalten und in 2%agar-ls Punkt setzen Sie sanft einen Deckelrutsch auf der Oberseite der Probe.Beobachten Sie die Uhr mit der DIC-Mikroskopie. Scanning Degeneration der 630 Rezeptorneuronen durch Zählen von Zellen mit einem charakteristischen virtuellen unterstützten Aussehen dieses Nematoden. Synchronisieren Sie Nematoden, indem Sie 15 bis 20 L4-Larven von jeweils einem Stamm auf zuerst Bakterien C und dann GENETISCH veränderte Platten auswählen und übertragen.Inkubieren und lassen Sie die Nematoden bei der Standardtemperatur von 20 Grad Celsius wachsen. Führen Sie die tägliche Vorkonditionierung für 30 Minuten durch Übertragung der Platten in einem Inkubator auf 34 Grad Celsius. Dann kehren Sie die vorkonditionierten Nematoden bei der Standardtemperatur von 20 Grad Celsius zurück.Fügen Sie 10 Mikroliter von 20 Millimolar M9 Levangial Puffer Tropfen in der Mitte der Agar-ls-Spot. Wählen Sie die jeweiligen transgenen Nematoden aus und übertragen Sie sie in M9-Lewangialtropfen. Platzieren Sie 20 bis 30 Nematoden pro Tropfen.Legen Sie den Deckel vorsichtig auf die Oberseite der Probe. Versiegeln Sie den Deckelschlupf mit Nagellack, um die Feuchtigkeit während des gesamten Bildgebungsprozesses zu erhalten. Mit einem Fluoreszenzmikroskop in Kombination mit einer Kamera können Sie Ihre Studienbilder des Kopfbereichs mit 20 x Vergrößerung erkennen und erfassen.Überwachen Sie sieben Tage transgene Nematoden auf den tod von dopaminergen neuronalen Zellen. Messen Sie die neuronalen Policul-Aggregate im Kopfbereich von vier Tage alten transgenen Tieren, die 240 Fusionen mit lebenden Menschen ausdrücken. Nekrotische Zelltod induziert ehyperaktive Ionenkanäle ist die wichtigste in Nematoden, die ehemalige Hitzeschock Vorbedingung Eier hat.Hitzeschock-Voraussetzung, die eine Vorhersage gegen Alpha-Synuclein-induzierten Zelltod bei sieben Tage alten erwachsenen Hermaphrodit fördert und Q40-Proteinaggregate im Kopfbereich von vier Tage alten Erwachsenen verringert. Das Altern ist eine Folge von Schäden, die durch die allmähliche Degeneration der Zell- und Gewebehomöostase verursacht werden. Daher ist das Verständnis der Manipulation des altersbedingten neuronalen Abbaus oberste Prioritäten.Die vorgestellten Techniken in Kombination mit genetischen und pharmakologischen Untersuchungen könnten zu einer Meldung normaler Zelltodmodulatoren mit potenziellem therapeutischem Interesse führen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben Methoden, um Aspekte der amylopathies in der Schnecke zu...

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Modell-System für Amylopathy Study

Um die Beziehung zwischen Proteinhomöostase, Stress und Alterung zu untersuchen, haben wir Veränderungen in der Proteinfaltung beobachtet, indem wir die Proteindysfunktion, die Proteinlokalisierung in der Zelle und die Proteinstabilität auf organismischer, zellulärer und Proteinebene verfolgt haben, wobei wir das genetisch manipulierbare Metazoon Caenorhabditis elegans als Modellsystem verwendet haben.

Verwendung von Caenorhabditis elegans als Modellsystem zur Untersuchung der Proteinhomöostase in einem mehrzelligen Organismus

Drosophila ist weithin als ein Modellsystem verwendet , Neurodegeneration zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, mit dem Degeneration, wie durch Vakuolenbildung im Gehirn bestimmt wird, kann quantifiziert werden. Es minimiert auch die Auswirkungen aufgrund der Versuchsdurchführung durch die Verarbeitung und sectioning Kontroll- und Versuchs Fliegen wie eine Probe.

Massen Histologie zu Quantifizieren Neurodegenerative Erkrankungen in<em&gt; Drosophila</em

Das Ziel der hier vorgestellten Methode ist Proteinaggregation während der normalen Alterung bei Modellorganismus C. Eleganszu erkunden. Das Protokoll stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, sehr unlöslichen großen Aggregaten, die mit zunehmendem Alter bilden zu studieren und zu klären, wie Änderungen in Proteostase Proteinaggregation auswirken.

Methoden zur Untersuchung Veränderungen inhärenten Proteinaggregation mit dem Alter in Caenorhabditis elegans

Hier stellen wir ein Protokoll zur einfachen Isolierung bestimmter Gruppen lebender neuronaler Zellen vor, die grünes fluoreszierendes Protein aus transgenen Caenorhabditis elegans-Linien exdrücken. Diese Methode ermöglicht eine Vielzahl von Ex-vivo-Studien, die sich auf bestimmte Neuronen konzentrieren und hat die Fähigkeit, Zellen für eine weitere kurzfristige Kultivierung zu isolieren.

Isolierung spezifischer Neuronenpopulationen von Roundworm Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll beschreibt zwei empfindliche Assays zur Unterscheidung zwischen leichter, mittelschwerer und schwerer motorischer Beeinträchtigung in C. elegans-Modellen der amyotrophen Lateralsklerose, mit allgemeinem Nutzen für C. elegans-Stämme mit veränderter Motilität.

Evaluation der motorischen Beeinträchtigung bei C. elegans Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

In diesem Artikel zeigen wir, wie man ein Sieben-Punkte-Scoring-System verwendet, um Veränderungen der dopaminergen Neuronen-Dendritenmorphologie bei C. eleganskonsistent zu quantifizieren. Dieses System ist für die Analyse dopaminerger Neurodegenerationsassays unter Verwendung genetischer, chemischer und altersbasierter Modelle neurodegenerativer Erkrankungen vorgesehen.

Quantifizierung der Dopaminergen Neuron morphologische Veränderung und Degeneration bei Caenorhabditis elegans

Hier stellen wir ein Protokoll zur Beurteilung der neuroprotektiven Aktivitäten von Testverbindungen in Caenorhabditis elegans vor, einschließlich Polyglutaminaggregation, neuronalem Tod und Chemovermeidungsverhalten, sowie eine beispielhafte Integration mehrerer Phänotypen.

Caenorhabditis elegans als Modellsystem zur Entdeckung bioaktiver Verbindungen gegen Polyglutamin-vermittelte Neurotoxizität

In diesem Interview beschreibt Dr. Lindquist Beziehungen zwischen Proteinfaltung, Prionen-Erkrankungen und neurodegenerativen Erkrankungen. Das Problem der Proteinfaltung ist der Kern der modernen Biologie. Zusätzlich zu ihren traditionellen biochemischen Funktionen können Proteine ​​vermitteln Übertragung von biologischen Informationen und kann daher als ein genetisches Material sein. Diese vor kurzem entdeckte Funktion von Proteinen hat wichtige Implikationen für das Studium der menschlichen...

Interview: Proteinfaltung und Studien für Neurodegenerative Erkrankungen

Die Produktion von C. elegans Transgene via Recombineering mit dem GalK Selektionsmarker

Erfahren Sie Methoden zur Untersuchung altersassoziierter neurodegenerativer Erkrankungen bei Caenorhabditis elegans. Diese Techniken ermöglichen die Analyse zellulärer Mechanismen neuronaler Degeneration.

Modellierung altersassoziierter neurodegenerativer Erkrankungen bei Caenorhabditis elegans

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