In Vivo Targeting von neuronalen Vorläuferzellen in Ferret Neocortex durch Utero Elektroporation

Dieses Protokoll ermöglicht es uns, eine genetische Manipulation in vivo in einem wichtigen Tiermodell durchzuführen, das es uns ermöglicht, die Ausdehnung und Faltung eines sich entwickelnden Neocortex zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, eine hohe räumliche und zeitliche Spezifität zu verwenden, wenn sie auf jene neuronalen Stammzellen abzielt, die der Schlüsselzelltyp für die Entwicklung des Gehirns sind. Ziehen Sie vor Beginn des Verfahrens Glaskapillaren an einem Mikropipettenzieher und schneiden Sie mit Zangen den distalen Teil der Kapillare ab, um den Durchmesser der Kapillarspitze anzupassen.

Am embryonalen Tag 33 die entsprechende DNA-Konzentration in PBS hinzufügen, ergänzt mit 0,1%Fast Green mit sanftem Mischen, und legen Sie ein 3-stündiges, anästhesiertes, schwangeres weibliches Frettchen auf einen Operationstisch mit einem Heatpad. Bestätigen Sie den entsprechenden Sedierungsgrad, indem Sie die periokuläre Haut berühren und die Haut zwischen dem zweiten und dritten oder dritten und vierten Zehen beider Hinterbeine kneifen. Isofluran kann Nebenwirkungen verursachen, einschließlich Übelkeit und Schwindel.

Verwenden Sie bei der Handhabung von Isofluran in flüssiger Form die Schutzausrüstung. Verwenden Sie während der Operation geeignete Kanister, um das Gas zu fangen. Injizieren Sie das Tier subkutan mit Schmerzmittel, Antibiotikum und Glukose, und legen Sie Salbe auf die Augen des Tieres.

Verwenden Sie Clippers, um den Bauch zu rasieren, und reinigen Sie die exponierte Haut mit einer Wasser-, Seifen- und Jodlösung. Dann trocknen Sie die Haut mit Gazetupfer und desinfizieren Sie mit Alkohol und Jodpeelings. Denn bei der Utero-Elektroporation einen sterilen Vorhang über das Tier legen und mit einem Skalpell einen etwa 5-Zentimeter-Hautschnitt an der Linea alba machen.

Verwenden Sie eine Schere, um die Muskelschicht zu durchschneiden und Gaze-Tupfer um die Einschnittstelle zu legen. Die Gaze mit PBS befeuchten und die Gebärmutter auf die Tupfer legen. Mit einer Pipette mit langer Spitze eine der gezogenen Glaskapillaren mit 5 Mikroliter NIV DNA-Lösung pro embryonalen Embryo beladen.

Befestigen Sie die geladene Kapillare an einem Halter und verbinden Sie die andere Seite des Halters an ein Rohr und ein Mundstück. Suchen Sie den Kopf des ersten Embryos und platzieren Sie eine Faseroptik-Lichtquelle neben dem Kopf. Mit der pigmentierten Iris als Bezugspunkt, durchdringen Sie die Haut, Schädel, und Hirngewebe mit der Spitze der Glaskapillare und verwenden Mund Pipettierung, um die Lieferung von 3-5 Mikroliter der Injektionslösung in den Ventrikel einer der zerebralen Hemisphären zu erleichtern.

Da die injizierte Lösung 0,1% Fast Green enthält, führt eine erfolgreiche Injektion zu einer dunkelgrünen Färbung des injizierten Ventrikels, die nun als nierenförmige Struktur sichtbar ist. Legen Sie nach der Injektion die Pinzettenelektroden auf die Gebärmutter über dem Kopf des Embryos mit dem positiven Pol über dem zielgerichteten Bereich und dem negativen Pol unterhalb des injizierten Bereichs. Stellen Sie die Pulslänge des Elektropols auf 50 Millisekunden, die Pulsspannung auf 100 Volt, das Pulsintervall auf eine Sekunde und die Anzahl der Impulse auf fünf ein.

Wenn alle Parameter eingestellt sind, drücken Sie Pulse" und lassen Sie schnell mehrere Tropfen warmer PBS auf den elektroporated Embryo fallen. Wenn alle Embryonen elektropoiert wurden, kehren Sie die Gebärmutter in die Peritonealhöhle zurück und verwenden Sie eine 4-0 Naht, um die Muskelschicht mit dem Peritoneum zu schließen. Schließen Sie die Haut in ähnlicher Weise und bedecken Sie die Wunde mit Aluminiumspray.

Dann kehren Sie das Tier in seinen Käfig mit einer Wärmequelle und Überwachung bis zur vollen Rekumbency. Vier Tage nach der Elektroporation am embryonalen Tag 37 befinden sich die meisten Zielzellen und ihre Nachkommen noch in den Keimzonen und die Zellen werden selten weiter basal innerhalb der kortikalen Platte beobachtet. Die Vorläuferidentität kann durch Immunfluoresen auf Marker von Zykluszellen wie PCNA untersucht werden, während eine Untergruppe von Vorläufern, die sich einer Mitose unterziehen, durch Marker wie Phospho-Histon 3 nachgewiesen werden kann.

Am postnatalen Tag Null, acht Tage nach der Elektroporation, breitet sich die Nachkommenschaft der Zielzellen auf alle histologischen Schichten aus. Mit einer Kombination von Transkriptionsfaktormarkern können verschiedene Basalvorläuferpopulationen aufgedeckt werden. Sox2 ist beispielsweise ein Marker proliferativer Vorläuferzellen, einschließlich der basalen radialen Glia.

Und T-Box Gehirnprotein 2 ist ein Marker für neurogene Basalvorläufer, die hauptsächlich zwischengeschaltete Vorläufer sind. Am postnatalen Tag 16 hört ein Großteil der Zielzellen auf, sich zu teilen und in Neuronen und Glia zu differenzieren, wobei Frettchen postnatale Tag 16 Neocortex das charakteristische Faltmuster aufweist. Die inutero Elektroporation von Frettchenembryonen ist eine extrem leistungsfähige Methode, um die Funktion von Genen zu untersuchen.

Es hat uns erlaubt, Gene zu studieren, die an der Ausdehnung des Neocortex in der Evolution beteiligt waren, einschließlich menschenspezifischer Gene. Und mit dieser leistungsstarken Methode konnten wir in der Tat Schlüsselmerkmale herausfinden, wie die evolutionäre Ausdehnung des menschlichen Neocortex wahrscheinlich funktionierte.