Orthotope Transplantation von Brusttumoren als präklinische Modelle für Brustkrebs

Dieses Protokoll beschreibt die orthotope Transplantation von Brusttumorfragmenten in das Brustfettpolster und bietet wertvolle Ansätze zur Untersuchung der Tumorbiologie, des Wirkstoffansprechens und des Mechanismus der Arzneimittelresistenz. Diese Technik ist minimal-invasiv und gewährleistet die korrekte Platzierung des Tumorgewebes innerhalb des Brustfettpolsters, die Zugänglichkeit für die Zählung pro Messung und die Aufrechterhaltung der Mobilität der Tiere. Diese Technik ermöglicht die Transplantation von Dutzenden von Tieren aus dem Intertransplantat eines einzigen Patienten für die gleichzeitige Bewertung mehrerer Krebstherapiekandidaten in einem präklinischen Studienformat.

Diese Methode ist der subkutanen Gewebeimplantation zur Erstellung von Intergraphenmodellen überlegen und kann auch eingesetzt werden, wenn orthotope Implantate nicht möglich sind. Die schwierigsten Dinge sind das Ausüben des entsprechenden Drucks, um das Fettpolster von der Körperwand zu lösen und die Gewebetasche zu bilden. Die Visualisierung des Peelings des Fettpolsters und die rissige anatomische Platzierung des Gewebefragments helfen Ihnen, eine erfolgreiche Durchführung des Eingriffs zu gewährleisten.

Zum Auftauen von kryokonservierten Gewebefragmenten von Brusttumoren für die Transplantation. Tauen Sie zunächst ein Kryofläschchen aus der Lagerung von flüssigem Stickstoff mit den interessierenden Tumorfragmenten in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf, wobei Sie gelegentlich leicht schnippen. Wenn die Fragmente aufgetaut sind, mischen Sie die Fragmente mit vorsichtiger Inversion und trocknen Sie die Außenseite der Durchstechflasche.

Besprühen Sie das Fläschchen mit 70 % Ethanol und stellen Sie es in eine Sicherheitshaube für das Fläschchen. Übertragen Sie den Inhalt des Kryofläschchens in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie dann 10 Milliliter kaltes DMEM hinzu und drehen Sie das Röhrchen zum Mischen um.

Lassen Sie die Fragmente absetzen und ersetzen Sie einen Überstand zweimal durch 10 Milliliter Aliquot, also frisches kaltes DMEM. Lege dann das Rohr auf Eis. Um eine Brusttumorgewebeprobe zu entnehmen, besprühen Sie die Tumorregion der tumortragenden Maus mit 70%Ethanol und verwenden Sie eine gezackte Pinzette, um die den Tumor umgebende Haut zu kneifen und anzuheben.

Verwenden Sie eine Schere, um einen kleinen Schnitt zu machen, und trennen Sie den Tumor von der Haut, wobei Sie darauf achten, dass die Haare nicht verunreinigt werden. Schneiden Sie das restliche Fettpolstergewebe der Maus von der äußeren Oberfläche des Tumors ab und legen Sie den Tumor in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern kaltem DMEM. Den präparierten Tumor in einer Biosicherheitshaube in eine sterile 10 Zentimeter große Petrischale geben, die genügend DMEM enthält, um ein Austrocknen zu verhindern, und mit einer UV-sterilisierten Klinge den Tumor unter aseptischen Bedingungen in einen Kubikmillimeter schneiden.

Anschließend werden die Tumorfragmente in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit kaltem DMEM auf Eis überführt. Nachdem Sie bestätigt haben, dass Sie nicht auf den Pedalreflex reagieren, tragen Sie Salbe auf die Augen der betäubten Empfängermaus auf und rasieren Sie den Bauch um die vierte Gedächtnisdrüse. Desinfizieren Sie dann die exponierte Haut dreimal mit kreisenden Bewegungen und beginnend in der Mitte der Operationsstelle, während Sie sich nach außen zu den äußeren Rändern bewegen, mit einem chirurgischen Povidon-Jod-Peeling, gefolgt von der Entfernung des Peelings mit einem 70%igen Isopropylalkohol-Pad.

Für die Transplantation der Tumorgewebefragmente in das vierte leistende Brustfettpolster bedecken Sie das Tier mit einem sterilen fenestrierten chirurgischen Tuch und verwenden Sie eine gezackte Pinzette, um die Haut an der vierten Brustwarze zu kneifen und anzuheben. Mit der stumpfen Seite der Spitzen nach unten machst du mit einer Schere einen etwa einen Zentimeter langen parasagittalen Schnitt von der Brustwarze Nummer vier zum Kopf hin. Verwenden Sie einen Wattestäbchen-Applikator, um die Haut auf der medialen Seite des Schnitts vom Bauchfell zu trennen, und ziehen Sie das Gedächtnisfettpolster Nummer vier vorsichtig von der Haut ab.

Verwenden Sie eine sterile 27-Gauge-Nadel, um die Haut nahe am Körper des Tieres zu befestigen, und verwenden Sie eine gezackte Pinzette, um das Fettpolster sanft vom Körper weg zu strecken. Lokalisieren Sie den leistenförmigen Lymphknoten am Schnittpunkt der großen Gefäße der Drüse und kauterisieren Sie vorsichtig die Gefäße medial des Lymphknotens und des Fettes, das an die vierten und fünften Fettpolster angrenzt. Schneiden Sie mit einer Mikropräparierschere jedes kauterisierte Gefäß nacheinander auf, bis der Abschnitt des Fettpolsters, der den Lymphknoten enthält, entfernt ist, und greifen Sie mit einer stumpfen Pinzette nach dem Fettpolster.

Führen Sie mit der anderen Hand und einer gebogenen Bewegung die geschlossene Spitze einer abgewinkelten feinen Pinzette in die Mitte des Fettpolsters über dem verbleibenden Gefäß in der Nähe der Wand des Peritenoneums ein. Ziehen Sie die Spitzen zurück und stecken Sie die Spitzen wieder in das ursprüngliche Loch, indem Sie die Pinzette öffnen, um das Loch in eine kleine Tasche zu dehnen. Entferne die Pinzette aus dem Loch und führe damit ein Stück Tumorfragment in die Tasche ein.

Öffnen Sie langsam die Spitzen, um das Tumorfragment in die Fettpolstertasche freizugeben und ziehen Sie die Pinzette vorsichtig zurück. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass das Fragment in die Fettpolstertasche eingebracht wurde, beginnen Sie mit der Basis des Schnitts, und sammeln Sie es auf jeder Seite des Schnitts mit einer gezackten Pinzette und heben Sie die Haut leicht an. Locken Sie die Kanten des Schnitts mit einer Krallenzange ab und drücken Sie die Kanten zusammen, um oben eine durchgehende Oberfläche zu bilden.

Halten Sie die beiden Seiten mit der gezackten Pinzette fest, platzieren Sie mit einem gewickelten Clip-Applikator einen Clip in der Mitte des Schnitts und setzen Sie das Tier in einen sauberen Käfig auf einer wärmenden Oberfläche mit Überwachung, bis es vollständig liegt. In der Regel können patienteneigene Xenotransplantate oder gentechnisch veränderte Mausmodelltumoren etwa zwei bis acht Wochen nach der Transplantation abgetastet werden. Die H&E-Färbung kann durchgeführt werden, um die Tumorpathologie zu analysieren, während die Immunhistochemie verwendet werden kann, um Marker für eine bestimmte Zelllinie von Interesse oder die Lebensfähigkeit und den Funktionsstatus der Zellen zu überwachen.

Es ist darauf zu achten, dass das Tumorfragment sicher in der Tasche sitzt, damit es nicht herausfällt und im Unterhautraum wächst. Sobald die Tumore gewachsen sind, kann eine medikamentöse Behandlung verabreicht werden, um das Ansprechen des Tumors zu beurteilen. Die Tumore können auch entfernt werden, um das Metastasierungspotenzial der Krebszellen zu bestimmen.

Diese Grundtechnik wird seit den 1950er Jahren verwendet. Unsere Modifikation bietet eine effizientere und weniger invasive Methode, um in größeren Maßstäben Entwicklungsbiologie in Krebsstudien durchzuführen.