Name: Blockierung des Lymphflusses durch Suieren von afferenten Lymphgefäßen bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Lernen Sie die chirurgische Blockade des Lymphflusses durch Nähen afferenter Lymphgefäße bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle über den Blockadezeitpunkt mit minimalem Schaden an lymphatischen Endothelzellen.

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Die Autoren danken Ava Zardynezhad für das Korrekturlesen des Manuskripts. Diese Arbeit wird vom Canadian Institute of Health Research (CIHR, PJT-156035) und der Canada Foundation for Innovation for SL (32930) und der National Natural Science Foundation of China für Yujia Lin (81901576) unterstützt.

Alle Tierarbeit muss vom Institutionellen und staatlichen Ethik- und Tierschutzausschuss genehmigt werden.  Dies ist eine Nicht-Überlebens-Operation.
1. Herstellung von Materialien
<ol><li>Bereiten Sie 100 ml 70% Ethanol vor, indem Sie 70 ml 100% Ethanol mit 30 ml sterilem Wasser mischen. Autoclave alle chirurgischen Werkzeuge vor der Operation und halten Sie die Werkzeuge in 70% Ethanol vor und während der Operation, um die Sterilisation aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Bereiten Sie ein Injektionsgerät vor.<ol>
<li>Schneiden Sie 30 cm Polyethylenschläuche (0,28 mm Durchmesser) ab. Schließen Sie die Spitze einer 30 G x 1/2 Nadel (Nadel A) an ein Ende der Polyethylenschläuche an. Lösen Sie vorsichtig eine weitere 30 G x 1/2 Nadel (Nadel B) und verbinden Sie die gebrochene Seite mit dem anderen Ende der Polyethylenschläuche.</li>
		<li>Nadel A an einer 1 ml Tuberkulinspritze befestigen. HINWEIS: Für diese Polyethylenschläuche entspricht 1,6 cm Flüssigkeit in den Schläuchen 1 l20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie ein 10:1 Ketamin/Xylazin-Gemisch (10 mg/ml Ketamin und 1 mg/ml Xylazin) in Saline (bakteriostatisch 0,9% [w/v] Natriumchlorid) vor. Bereiten Sie die Lösung vor Gebrauch frisch vor.</li>
</ol>2. Vorbereitung des Tieres auf die Operation
HINWEIS: Verwenden Sie Mäuse im Alter von 6 bis 10 Wochen. Sowohl weibliche als auch männliche Mäuse können verwendet werden. In dieser Studie wurden 6-10 Wochen alte, C57BL/6 weibliche Mäuse verwendet. Diese Methode kann für andere Mäusestämme angepasst werden.
<ol><li>Anästhesisieren Sie die Maus, indem Sie 250 l des Ketamin/Xylazin-Gemischs intraperitoneal injizieren. Warten Sie, bis die Maus vollständig eingeschlafen ist. Stellen Sie sicher, dass die Maus nicht auf eine Zehenklemme reagiert, um die vollständige Anästhesisierung zu erkennen.</li>
	<li>Rasieren Sie Fell um die Beine mit Haarschneidern.</li>
	<li>Tragen Sie die Enthaarungscreme um das Bein auf und warten Sie 5 min. Das Restfell und die Enthaarungscreme mit einem feuchten Gewebe abwischen und das Bein mit sterilem Wasser reinigen. Sprühen Sie 70% Ethanol um das Bein, um den Operationsbereich zu sterilisieren. Das Ethanol ist auf die Einschnittstelle beschränkt.</li>
</ol>3. Chirurgische Naht von afferenten Lymphgefäßen
HINWEIS: Das rechte Bein ist vernärmt, und das linke Bein wird als Scheinkontrolle verwendet. Das lymphatische Nahtprotokoll (Schritte 3.1-3.8) dauert 20 bis 30 min.
<ol><li>Halten Sie die Maus an einer anfälligen Position und fixieren Sie sie mit chirurgischem Klebeband, um den Operationsbereich am rechten Bein freizulegen.</li>
	<li>Intradermally injizieren 5 l von 1% Evans blauer Farbstoff oder 9 cm der Flüssigkeit des Injektionsgeräts Schläuche in das Fußpolster. Massieren Sie das Fußpolster sanft, um Evans blau in die Lymphgefäße einzudringen. HINWEIS: Die Insulinspritze ist für die Injektion kleiner Volumen nicht einfach zu kontrollieren. Das Volumen kann mit dem Injektionsgerät genauer gesteuert werden. Lymphgefäße werden durch blauen Farbstoff unter der Haut visualisiert. Mit umfangreichem Training können beide afferenten Lymphgefäße mit bloßem Auge als transparente Gefäße im Fettgewebe gesehen werden, parallel zur Arterie Saphenous. Mit umfangreicher Schulung ist es möglich, die Gefäße zu befestigen, ohne Evans Blue Farbstoff zu injizieren, wenn es Bedenken hinsichtlich möglicher Störungen durch den Farbstoff gibt.</li>
	<li>Wählen Sie unter einem Sezieren des Mikroskops eine Schnittstelle 5 mm vom unteren Rand der poplitealen Fossa aus. Machen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 5 mm) in der Haut mit einer Schere. Dehnen Sie den Einschnitt mit feinen Operationszangen und setzen Sie die sammelnden Lymphgefäße aus (Abbildung 1A). HINWEIS: Bei Bedarf kann ein kleines Hautfragment entfernt werden, um die Lymphgefäße freizulegen.</li>
	<li>Identifizieren Sie beide affekenden Lymphgefäße, die zu den pLNs unter dem Sezieren des Mikroskops führen (Abbildung 1B). HINWEIS: Es gibt zwei afferent lymphatische Gefäße vom Fußpolster bis zum pLN. Beide müssen vernässt werden, um den Lymphfluss vollständig zu blockieren.</li>
	<li>Mit einem Nadelhalter die Nahtnadel (0,7 metrisch oder kleiner) vorsichtig zwischen das affetische Lymphgefäß und die Arterie Saphenous einlegen und die Nadel vorsichtig um das afferent Lymphgefäß herausziehen. Ziehen Sie die Nahtschnur vorsichtig und lassen Sie ca. 2 cm der Nahtschnur zurück. Verwenden Sie den Nadelhalter, um die Schnur fest zu binden, um ein Lymphgefäß mit einem Chirurgenknoten zu verbinden (Abbildung 1C). HINWEIS: Das Gewebe unter dem Schnitt kann bei längerer Lufteinwirkung austrocknen. Wenn der Schnitt so klein wie möglich gemacht wird und die Naht schnell (d.h. innerhalb von 5 min) durchgeführt wird, wird verhindert, dass das Gewebe austrocknet. Bewahren Sie die Gewebefeuchtigkeit, indem Sie ein kleines Volumen von Saline mit einem Wattestäbchen auftragen.</li>
	<li>Massieren Sie das Fußpolster vorsichtig, um sicherzustellen, dass kein Evans Blue Farbstoff die Nahtstelle passiert und dann die überschüssige Schnur mit der Schere schneidet.</li>
	<li>Führen Sie die gleichen Nahtschritte (d. h. die Schritte 3.5 und 3.6) auf dem anderen affetienten Lymphgefäß aus (Abbildung 1D). Schließen Sie den Hautschnitt mit der gleichen Naht, die verwendet wurde, um die Gefäße in Schritt 3.5 zu nähen (Abbildung 1E).</li>
	<li>Für die Scheinkontrolle, intradermally injizieren 5 l von 1% Evans blauen Farbstoff am linken Fußpad und massieren das Fußpolster, um die Lymphgefäße zu visualisieren. Öffnen Sie die Haut mit einer Exzision und schließen Sie dann die Wunde, ohne das Gefäß zu nähen (Abbildung 1F).</li>
	<li>Optional die betätigten Mäuse für 2 x 4 h überwachen. Die Nahtseite des Beins sollte Ödeme mit Evans Blue zeigen, die auf den Oberschenkel ausgebreitet sind, während das Kontrollbein einen eingeschränkten Evans-Blaufarbstoff im Fußpolster zeigt. Wenn Mäuse erwachen, wird eine zusätzliche Ketamin/Xylazin-Mischung injiziert, um die Anästhesie bis zur Euthanasie zu erhalten.</li>
</ol>4. Verfolgung des Lymphflusses
<ol><li>Unmittelbar nach der Operation injizieren Sie intradermally 10 l von 2% Fluorescein isothiocyanat (FITC) im Fußpolster sowohl der Kontrolle als auch des lymphatischen genähten Beins.</li>
	<li>Euthanisieren Sie die Mäuse mit 400 L Ketamin/Xylazin-Mischung und führen Sie zervikale Dislokation durch, wenn die Mäuse vollständig anästhesisiert sind.</li>
	<li>Sammeln Sie pLNs aus der poplitealen Fossa und entfernen Sie vorsichtig das perinodale Fettgewebe um die pLNs unter dem Dissektionsmikroskop bei 2, 6 und 12 h nach der FITC-Injektion.</li>
	<li>Die pLNs mit der medullären Sinusfläche zur Seite des Kryomolds in optimaler Schnitttemperatur (OCT) Verbindung einbetten (Abbildung 1G,H).</li>
	<li>Bereiten Sie 20 m gefrorene Abschnitte mit einem Kryotom vor.</li>
	<li>Stellen Sie die Kryosektionen unter einem konfokalen Mikroskop ab, um die FITC-Verteilung zu bestimmen.</li>
</ol>

<ol><li>Pflicke, H., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preformed+portals+facilitate+dendritic+cell+entry+into+afferent+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Preformed portals facilitate dendritic cell entry into afferent lymphatic vessels.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2925-2935 (2009).</li>
<li>Schmid-Schonbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microlymphatics+and+lymph+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Microlymphatics and lymph flow.</a> Physiological Reviews. 70, 987-1028 (1990).</li>
<li>Skalak, T. C., Schmid-Schonbein, G. W., Zweifach, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+morphological+evidence+for+a+mechanism+of+lymph+formation+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">New morphological evidence for a mechanism of lymph formation in skeletal muscle.</a> Microvascular Research. 28, 95-112 (1984).</li>
<li>Johnston, M. G., Hay, J. B., Movat, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+prostaglandin+production+in+various+inflammatory+lesions%2C+measured+in+draining+lymph%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Kinetics of prostaglandin production in various inflammatory lesions, measured in draining lymph.</a> The American Journal of Pathology. 95, 225-238 (1979).</li>
<li>Eisenhoffer, J., Yuan, Z. Y., Johnston, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+the+L-arginine+pathway+plays+a+role+in+the+regulation+of+pumping+activity+in+bovine+mesenteric+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Evidence that the L-arginine pathway plays a role in the regulation of pumping activity in bovine mesenteric lymphatic vessels.</a> Microvascular Research. 50, 249-259 (1995).</li>
<li>Gasheva, O. Y., Zawieja, D. C., Gashev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contraction-initiated+NO-dependent+lymphatic+relaxation%3A+a+self-regulatory+mechanism+in+rat+thoracic+duct%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Contraction-initiated NO-dependent lymphatic relaxation: a self-regulatory mechanism in rat thoracic duct.</a> Journal of Physiology. 575, 821-832 (2006).</li>
<li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor-C+stimulates+the+lymphatic+pump+by+a+VEGF+receptor-3-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor-C stimulates the lymphatic pump by a VEGF receptor-3-dependent mechanism.</a> American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 293, 709-718 (2007).</li>
<li>Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic-cell+trafficking+to+lymph+nodes+through+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels.</a> Nature Reviews. Immunology. 5, 617-628 (2005).</li>
<li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li>
<li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li>
<li>Kastenmuller, W., Torabi-Parizi, P., Subramanian, N., Lammermann, T., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatially-organized+multicellular+innate+immune+response+in+lymph+nodes+limits+systemic+pathogen+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A spatially-organized multicellular innate immune response in lymph nodes limits systemic pathogen spread.</a> Cell. 150, 1235-1248 (2012).</li>
<li>Gerner, M. Y., Torabi-Parizi, P., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategically+localized+dendritic+cells+promote+rapid+T+cell+responses+to+lymph-borne+particulate+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Strategically localized dendritic cells promote rapid T cell responses to lymph-borne particulate antigens.</a> Immunity. 42, 172-185 (2015).</li>
<li>Moussion, C., Girard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+control+lymphocyte+entry+to+lymph+nodes+through+high+endothelial+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells control lymphocyte entry to lymph nodes through high endothelial venules.</a> Nature. 479, 542-546 (2011).</li>
<li>Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph-borne+chemokines+and+other+low+molecular+weight+molecules+reach+high+endothelial+venules+via+specialized+conduits+while+a+functional+barrier+limits+access+to+the+lymphocyte+microenvironments+in+lymph+node+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192, 1425-1440 (2000).</li>
<li>Mebius, R. E., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+high+endothelial+venules+in+mouse+lymph+nodes+stimulated+by+oxazolone%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">The function of high endothelial venules in mouse lymph nodes stimulated by oxazolone.</a> Immunology. 71, 423-427 (1990).</li>
<li>Mebius, R. E., Streeter, P. R., Breve, J., Duijvestijn, A. M., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+afferent+lymphatic+vessel+interruption+on+vascular+addressin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The influence of afferent lymphatic vessel interruption on vascular addressin expression.</a> Journal of Cell Biology. 115, 85-95 (1991).</li>
<li>Mebius, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GlyCAM-1%2C+an+endothelial+ligand+for+L-selectin%2C+is+affected+by+afferent+lymphatic+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of GlyCAM-1, an endothelial ligand for L-selectin, is affected by afferent lymphatic flow.</a> Journal of Immunology. 151, 6769-6776 (1993).</li>
<li>Drayton, D. L., Liao, S., Mounzer, R. H., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+organ+development%3A+from+ontogeny+to+neogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymphoid organ development: from ontogeny to neogenesis.</a> Nature Immunology. 7, 344-353 (2006).</li>
<li>Tomei, A. A., Siegert, S., Britschgi, M. R., Luther, S. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+flow+regulates+stromal+cell+organization+and+CCL21+expression+in+a+tissue-engineered+lymph+node+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fluid flow regulates stromal cell organization and CCL21 expression in a tissue-engineered lymph node microenvironment.</a> Journal of Immunology. 183, 4273-4283 (2009).</li>
<li>Liao, S., Jones, D., Cheng, G., Padera, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+quantitative+measurement+of+collecting+lymphatic+vessel+contraction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for the quantitative measurement of collecting lymphatic vessel contraction in mice.</a> Journal of Biological Methods. 1, 6(2014).</li>
<li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinodal+Adipose+Tissue+Participates+in+Immune+Protection+through+a+Lymphatic+Vessel-Independent+Route%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Perinodal Adipose Tissue Participates in Immune Protection through a Lymphatic Vessel-Independent Route.</a> Journal of Immunology. 201, 296-305 (2018).</li>
<li>Gardenier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diphtheria+toxin-mediated+ablation+of+lymphatic+endothelial+cells+results+in+progressive+lymphedema%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Diphtheria toxin-mediated ablation of lymphatic endothelial cells results in progressive lymphedema.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 1, 84095(2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die Blockierung des Lymphflusses wird breite Anwendungen bei der Manipulation der Antigenabgabe an die LN unter gesunden und kranken Bedingungen haben. Es ist möglich, diese Methode zu verwenden, um den Zeitpunkt der Antigenabgabe zu kontrollieren, um zu untersuchen, wie der kontinuierliche Lymphfluss die Immunantwort bei entleerenden LNs reguliert. Diese Methode der Lymphflussunterbrechung kann auch verwendet werden, um zu untersuchen, wie Lymphauswirkungen Zellkompartalisation, Zellaktivierung, Zellmigration und Zell-Z...

Die räumliche Organisation des Lymphsystems bietet strukturelle und funktionelle Unterstützung, um extrazelluläre Flüssigkeit effizient zu entfernen und Antigene und Antigen-präsentierende Zellen (APCs) zu den entwässernden LNs zu transportieren. Die ersten lymphatischen Gefäße (auch Lymphkapillaren genannt) sind aufgrund ihrer diskontinuierlichen interzellulären Verbindungen, die die effektive Sammlung von Flüssigkeiten, Zellen und anderen Materialien aus den umliegenden extrazellulärenRäumen1 erleichtern, sehr durchlässig. Die ersten lymphatischen Gefäße verschmelzen zu sammelnden Lymphgefäßen, die enge interzelluläre Verbindungen, eine kontinuierliche Kellermembran und lymphatische Muskelabdeckung haben. Das Sammeln von Lymphgefäßen ist verantwortlich für den Transport der gesammelten Lymphe zu den entwässernden LNs und schließlich die Rückkehr der Lymphe in den Kreislauf2,3. Die sammelnden Lymphgefäße, die Lymphe in die entwässernden LN treiben, sind die afferent lymphatischen Gefäße4,5,6,7. Die Behinderung der affektiven Lymphgefäße kann den Lymphfluss in die LNs blockieren, was eine nützliche Technik bei der Untersuchung der Funktion des Lymphflusses ist.
Frühere Studien haben gezeigt, dass Lymphfluss eine wichtige Rolle beim Transport von Antigenen und APCs spielt, sowie bei der Aufrechterhaltung der LN-Homöostase. Es ist allgemein bekannt, dass gewebeabgeleitete APCs, typischerweise aktivierte migrierende dendritische Zellen (DCs), durch die affemenden Lymphgefäße zu den LN reisen, um T-Zellen zu aktivieren8. Die Idee, dass Freiform-Antigene, wie Mikroben oder lösliche Antigene, passiv mit Lymphe zu den LN fließen, um LN-residente APCs zu aktivieren, hat sich in den letzten zehn Jahrendurchgesetzt 9,10,11,12. Freiform-Antigene, die mit Lymphe reisen, dauern Minuten nach der Infektion, um zu den LN zu gelangen, und die LN-Resident-Zellaktivierung kann innerhalb von 20 min nach der Stimulation auftreten. Dies ist viel schneller als die Aktivierung von migrierenden DCs, die mehr als 8 h benötigt, um in die entwässernde LN9einzusteigen. Neben dem Transport von Antigenen zur Einleitung des Immunschutzes trägt die Lymphe auch Zytokine und DCs zu den LN, um ihre Mikroumgebung zu erhalten und die Immunzellhomöostase13,14zu unterstützen. Zuvor zeigte die Blockierung des Lymphflusses durch Das Aifaktum der affepfenden Lymphgefäße, dass Lymphe erforderlich ist, um den HEV-Phänotyp aufrechtzuerhalten, der zur Unterstützung der homöostatischen T-Zelle und der B-Zelle erforderlich ist, die bis zum LN15,16,17. CCL21 ist ein kritisches Chemokin, das die Dc- und T-Zellenpositionierung im LN8,18leitet. Die Blockierung des Lymphflusses unterbricht die CCL21-Expression im LN und unterbricht möglicherweise die Positionierung und/oder Interaktion von DC- und T-Zellen im LN19. So kann die Blockierung des Lymphflusses den Antigen-/DC-Zugang zu den entwässernden LN direkt oder indirekt abschaffen, indem die LN-Mikroumgebung gestört wird, die die Immunantworten in der LN reguliert. Um die Funktion des Lymphflusses besser untersuchen zu können, wird ein experimentelles Protokoll vorgestellt (Abbildung 1), um den Lymphfluss bei Mäusen zu blockieren, indem die affemenden Lymphgefäße vom Fußpad zum pLN durchnäht werden. Diese Methode kann eine wichtige Technik für zukünftige Studien über die lymphatische Funktion bei gesunden und kranken Bedingungen sein.

<table><tbody><tr><td><stark>0,9 % Natriumchlorid-Kochsalzlösung</td><td>Baxter</td><td>JB1323<</td><td></td></tr><tr><td>stark>100 % Ethanol</stark></td><td>Greenfield Global</td><td></td><td>University of Calgary Vertriebsdienstleistungen UN1170.</td></tr><tr><td>Enthaarungscreme</td><td>Nair</td><td></td><td>Nair Sensitive Formula Haarentfernungscreme; Ich mit Süßmandelöl und Babyöl, 200-ml. Oder ein ähnliches Produkt.</td></tr><tr><td>Evans Blue Farbstoff</td><td>Sigma Life Science</td><td>E2129-10G</td><td>Für 1 ml Evans Blue Farbstoff 0,1 g Evans Blue zu 10 ml PBS hinzufügen. Die Evens Blue Lösung wird durch 0,22 mm Filter filtriert und in 1 ml Aliquoten steril gehalten.</td></tr><tr><td>Fluorescein-Isothiocyanat-Isomer I (FITC)</td><td>Sigma Life Science</td><td>F7250-1G</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Dumont #3</td><td>WPI</td><td>500337</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Dumont #5</td><td>WPI</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>Injektionsgerät</td><td></td><td></td><td>Verbinden Sie ein Ende des Polyethylenschlauchs mit 30G & mal; &frac12; Nadel. Befestigen Sie eine 1-ml-TB-Spritze an der Nadel. Lösen Sie den Nadelschaft von einem weiteren 30G & mal; &frac12; Nadel. Stecken Sie das stumpfe Ende des 30G &m; &frac12; Nadelschaft in das andere Ende des Schlauchs stecken. Der Innendurchmesser dieses Schlauches beträgt 0,28 mm. Somit sind 1,6 cm Flüssigkeit im Schlauch 1 μl.</td></tr><tr><td>Insulinspritze</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>IRIS Pinzette gerade</stark></td><td>WPI</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>IRIS Schere</td><td>WPI</td><td>14218-G</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Narketan</td><td>DIN 02374994</td><td>Die Lieferanten von Ketamin und Xylazin stehen in der Regel unter institutioneller und staatlicher Regulierung.</td></tr><tr><td>Nadeln (26Gx3/8)</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>Nadeln (30Gx1/2)</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Paton Nadelhalter</td><td>ROBOZ</td><td>RS6403</td><td>gerade, ohne Lock; Gezackte</td></tr><tr><td><starke>phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma Life Science</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylen-Schlauch</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisches Klebeband (1,25 cm x 9,1 m )</td><td>Transpore</td><td>1527-0</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisches Klebeband (2,5 cm x 9,1 m )</stark></td><td>Transpore</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td>Naht</td><td>Davis and Geck CYANAMID Canada</td><td>11/04</td><td>0,7 metrische monofile Polypropylen</td></tr><tr><td>Spritze (1ml)</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)309659</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VANNAS Schere</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>14122-G</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Rompun</td><td>DIN02169606</td><td>Die Lieferanten von Ketamin und Xylazin unterliegen in der Regel institutionellen und staatlichen Vorschriften.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td>Olympus S261 (522-STS OH141791) mit Lichtquelle: Olympus Highlight 3100</td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td>SP8</td></tr></tbody></table>

blockierung des lymphflusses durch suieren von afferenten lymphgefäßen bei mäusen

Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice

Lymphgefäße sind entscheidend für die Aufrechterhaltung des Gleichgewichts der Gewebeflüssigkeit und die Optimierung des Immunschutzes durch den Transport von Antigenen, Zytokinen und Zellen zu entwässernden Lymphknoten (LNs). Unterbrechung des Lymphflusses ist eine wichtige Methode bei der Untersuchung der Funktion von Lymphgefäßen. Die affeken Lymphgefäße vom murinen Fußpolster bis zu den poplitealen Lymphknoten (pLNs) sind als die einzigen Wege für die Lymphdrainage in die pLNs klar definiert. Das Abtinnen dieser affemenden Lymphgefäße kann selektiv den Lymphfluss zu den pLNs verhindern. Diese Methode ermöglicht Störungen des Lymphflusses mit minimalen Schäden an den lymphatischen Endothelzellen in den entwässernden pLN, den affepfen den Lymphgefäßen sowie anderen Lymphgefäßen in der Umgebung. Diese Methode wurde verwendet, um zu untersuchen, wie Lymphe hohe endotheliale Venule (HEV) und Chemokinexpression in der LN beeinflusst und wie Lymphe durch das Fettgewebe fließt, das die LN umgibt, wenn es keine funktionellen Lymphgefäße gibt. Mit der zunehmenden Anerkennung der Bedeutung der lymphatischen Funktion wird diese Methode breitere Anwendungen haben, um die Funktion von Lymphgefäßen bei der Regulierung der LN-Mikroumgebung und der Immunantworten weiter zu entwirren.

Lymphgefäßnaht wurde in früheren Studien15,16,17,19verwendet, wo es als wichtiges Werkzeug diente, um die Funktion des Lymphflusses zu untersuchen, bevor die Molekularbiologie der Lymphgefäße besser verstanden wurde. Die Blockierung des Lymphflusses unterbricht die LN-Homöostase, was dazu führt, dass HEVs die kritische Genexpression verlieren, die für eine optimale Lymphozytenhoming an die LN<s...

Ein Protokoll zur Blockierung des Lymphflusses durch chirurgische Saat ierung von afferent lymphatischen Gefäßen wird vorgestellt.

Blockierung des Lymphflusses durch Suieren von afferenten Lymphgefäßen bei Mäusen

Lymphatic vessels are critical in maintaining tissue fluid balance and optimizing immune protection by transporting antigens, cytokines, and cells to ...

Diese Methode unterbricht den Lymphfluss mit minimalen Schäden an lymphatischen Endothelzellen, und mit präziser Kontrolle des Blockade-Timings kann es verwendet werden, um zu untersuchen, wie sich der Lymphfluss auf die Homöostase und Immunantworten im Lymphknoten auswirkt. Jingna Xue, eine Studentin aus meinem Labor, hilft bei der Demonstration des Verfahrens. Um ein Injektionsgerät vorzubereiten, schneiden Sie etwa 30 Zentimeter Polyethylenschläuche.Schließen Sie die Nadelspitze A an ein Ende des Schlauches an. Entfernen Sie vorsichtig eine andere Nadel, und verbinden Sie die gebrochene Seite an das andere Ende der Polyethylen-Schläuche. Dann Nadel A an einer Ein-Milliliter-Tuberkulinspritze befestigen.Unmittelbar vor der Anwendung eine 10:1 Ketamin-Xylazin-Mischung in Saline zubereiten. Nach der Anästhesisierung der Maus durch Injektion von 250 Mikrolitern des Ketamin/Xylazin-Gemischs intraperitoneal, sorgen Sie für eine vollständige Anästhesie mit einer Zehenprise. Rasieren Sie das Fell um die Beine mit Haarschneidern, dann tragen Enthaarungscreme um das Bein.Nach fünf Minuten das Restfell und die Enthaarungscreme mit einem feuchten Gewebe abwischen und dann das Bein mit sterilem Wasser reinigen. Sprühen Sie 70% Ethanol um das Bein, um den Operationsbereich zu sterilisieren. Platzieren Sie die Maus in einer anfälligen Position, und verwenden Sie chirurgisches Klebeband, um den Operationsbereich auf dem rechten Bein freizulegen.Intradermally injizieren fünf Mikroliter von 1%Evans blauen Farbstoff, oder neun Zentimeter der Flüssigkeit aus dem Injektionsapparat Schläuche in den rechten Fußpolster der Maus. Massieren Sie das Fußpolster sanft, um der Flüssigkeit zu helfen, in die Lymphgefäße einzudringen. Unter einem Sezieren mikroskop, lokalisieren Sie eine Einschnittstelle fünf Millimeter vom unteren Rand der poplitealen Fossa.Mit einer Schere, machen Sie einen kleinen Schnitt etwa fünf Millimeter in der Länge. Verwenden Sie dann feine Operationszangen, um den Schnitt zu dehnen und die sammelnden Lymphgefäße freizulegen. Identifizieren Sie beide affekenden Lymphgefäße, die zu den poplitealen Lymphknoten führen.Mit einem Nadelhalter die Nahtnadel vorsichtig zwischen die affemenden Lymphgefäße und die saftige Arterie einlegen. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig um die affemenden Lymphgefäße heraus. Ziehen Sie vorsichtig die Nahtschnur und lassen Sie etwa zwei Zentimeter der Nahtschnur zurück.Verwenden Sie den Nadelhalter, um den Knoten eines Chirurgen zu binden. Massieren Sie das Fußpolster vorsichtig, um sicherzustellen, dass kein Evans blauer Farbstoff die Nahtstelle passiert, und schneiden Sie dann die überschüssige Schnur mit der Schere. Nähen Sie die anderen affefenden Lymphgefäße, dann schließen Sie den Hautschnitt mit der gleichen Naht, die für die Lymphgefäße verwendet wurde.Für die Scheinkontrolle, intradermally injizieren fünf Mikroliter von 1%Evans blauen Farbstoff in den linken Fußpolster, und massieren Sie das Fußpolster. Öffnen Sie die Haut mit einem Schnitt, und schließen Sie dann die Wunde, ohne das Gefäß zu nähen. Bei der Überwachung der Maus nach der Operation sollte das rechte Bein Ödem zeigen, wobei Evans blauer Farbstoff sich auf den Oberschenkel ausbreitet, während das Kontrollbein Evans blauen Farbstoff zeigt, der auf das Fußpolster beschränkt ist.Unmittelbar nach der Operation injizieren Sie intradermally 10 Mikroliter von 2%FITC sowohl im rechten Fußpolster als auch in der linken. Zwei, sechs und 12 Stunden nach der FITC-Injektion sammeln Sie die poplitealen Lymphknoten aus der Fossa von eingeschläferten Mäusen. Entfernen Sie vorsichtig das perinodale Fettgewebe um die pLNs.Die pLNs in eine optimale Schnitttemperaturverbindung mit dem medullären Sinusbereich zur Seite der Kryoform einbetten. Verwenden Sie ein Kryotome, um 20-Mikron gefrorene Abschnitte vorzubereiten. Um die FITC-Verteilung in den pLNs zu bestimmen, stellen Sie die Kryo-Abschnitte unter einem konfokalen Mikroskop ab.Konfokale Bilder, die zwei, sechs und 12 Stunden nach der FITC-Injektion aufgenommen wurden, zeigen eine erheblich reduzierte FITC-Akkumulation in den poplitealen Lymphknoten, nachdem sie die affetienten Lymphgefäße genährt haben. Der Rest-FITC in den pLNs wurde bevorzugt in den Lymphknotennebenhöhlen angesammelt. Konfokale Bilder des perinodalen Fettgewebes zeigen, wenn Lymphgefäße durch Naht blockiert werden, FITC tritt in das Gewebe ein, wenn der Lymphknoten versäuftet, aber es ist nicht effektiv über die Lymphknoten verteilt.Beim Versuch dieser Methode ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass das Einsetzen der Nahtnadel zwischen dem Blutgefäß und dem Lymphgefäß entscheidend ist. Ein Scheitern dieses Schritts kann die Gefäße brechen. Nach der Durchführung dieser Methode ist es möglich, Mäuse mit Infektionen oder anderen Immunstimulationen zu immunisieren, um zu untersuchen, wie Lymphfluss den Immunschutz reguliert.Die Funktion des Lymphflusses ist nicht gut verstanden. Diese Methode kann verwendet werden, um Zellmigrationen im Lymphknoten in Abwesenheit von Lymphfluss zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Um den Verlauf einer Immunantwort im Laufe der Zeit innerhalb der gleichen Maus folgen, können Lymphknoten sequentiell durch eine Operation entfernt werden. Hier beschreiben wir, wie diese Technik durchgeführt werden kann.

Murine Oberflächliche Lymphknoten Chirurgie

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Modell des Mausschwanz-Lymphödems: Eine In-vivo-Technik zur Erzeugung eines anhaltenden Lymphödems beim Mausschwanz

Dieses Video zeigt das chirurgische Isolierungsverfahren des leistendrainierenden Lymphknotens aus einem Mausmodell. Der Schnitt in der Bauchregion ermöglicht den Zugang zum Leistenlymphknoten, der operativ entnommen wird. Der entnommene durchscheinende leistende Lymphknoten kann für immunologische Untersuchungen verwendet werden.

Entnahme eines inguinalen drainierenden Lymphknotens aus einem Mausmodell

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Kanülierung des mesenterialen Lymphgangs in einem Rattenmodell zur Entnahme von Lymphflüssigkeit

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Lymphödem ist eine Schwellung der Extremität, die durch lymphatische Dysfunktion verursacht wird. Wir beschreiben ein chronisches murines Schwanzmodell des Lymphödems und die neuartige Verwendung der Gewebe-Nanotransfektionstechnologie (TNT) für die genetische Frachtabgabe an den Schwanz.

Ein Murinschwanz-Lymphödem-Modell

Dieses Protokoll beschreibt ein Überlebensverfahren für eine sichere und gut verträgliche musinare mesenterine lymphadenektomyat an jeder der vier Stationen entlang der mesenterischen Lymphknotenkette. Dieses Verfahren ist anpassungsfähig, um eine selektive Unterbrechung der lymphatischen Kommunikation mit dem distalen Dickdarm, dem proximalen Dickdarm und/oder dem Dünndarm zu ermöglichen.

Maus-mesenteriale Lymphadenektomie zur selektiven Störung der lymphatischen Kommunikation mit dem regionsspezifischen Darm

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die Schritte zur Anastomosierung entweder des tiefen zervikalen Lymphknotens oder seines afferenten Lymphgefäßes mit der hinteren Gesichtsvene bei der Ratte klar zu definieren, den Einfluss anderer Variablen zu minimieren und die Durchführung chirurgischer Forschung zu standardisieren.

Chirurgische Protokolle für die tiefe zervikale lymphovenöse Anastomose im Rattenmodell: Lymphknoten- und Lymphgefäßanastomosen

Das Manuskript demonstriert eine innovative Methode zur in-vivo-Untersuchung der Kontraktilität zervikaler lymphatischer Gefäße und des Lymphflusses bei Mäusen zur Untersuchung verschiedener physiologischer Funktionen zervikaler lymphatischer Gefäße (cLVs) sowie der therapeutischen Strategien zur Modulation der lymphatischen Regulationsmechanismen des Hirnabflusses und der Clearance.

Reproduzierbare Einrichtung für die in vivo Zwei-Photonen-Bildgebung der Kontraktilität der zervikalen Lymphgefäße und des Lymphflusses bei Mäusen

Lernen Sie die chirurgische Blockade des Lymphflusses durch Nähen afferenter Lymphgefäße bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle über den Blockadezeitpunkt mit minimalem Schaden an lymphatischen Endothelzellen.

Blockierung des Lymphflusses durch Suieren von afferenten Lymphgefäßen bei Mäusen

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