Neuronale Differenzierung von Maus embryonalen Stammzellen In vitro
2. Juni 2020
Hier haben wir eine kostengünstige und einfach zu bedienende Methode etabliert, die eine schnelle und effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Neuronen leitet. Diese Methode eignet sich für die Popularisierung unter Laboratorien und kann ein nützliches Werkzeug für die neurologische Forschung sein.
Die neuronale Differenzierung aus Maus-Assays ist ein hervorragendes Modell, um die Schlüsselmechanismen der Neurogenese zu veranschaulichen. Wir demonstrieren eine optimierte Methode für die Neurogenese von Embryoiden unter Verwendung einer unternehmenseigenen Toro-Screening-Strategie. Diese Technik hat die Vorteile einer hohen Effizienz, niedriger Kosten und einfacher Bedienung und eignet sich für die Popularisierung im Labor.
Es ist ein mächtiges Werkzeug für die neurowissenschaftliche Forschung. Um die Differenzierung mit dem ersten Protokoll durchzuführen, säen Sie 20.000 embryoide Stammzellen der Maus in zwei Millilitern basalem Differenzierungsmedium in jede Vertiefung einer mit 0,1 %ige Gelatine beschichteten Sechs-Well-Platte. Waschen Sie die Zellen nach der Zelladhäsion mit zwei Millilitern PBS und geben Sie zwei Milliliter basales Differenzierungsmedium in jede Vertiefung, dann legen Sie die Zellen wieder in den Inkubator.
Lassen Sie die Zellen acht Tage lang differenzieren und wechseln Sie das Medium alle zwei Tage. Um das zweite Protokoll durchzuführen, geben Sie 1,5 Millionen embryoide Stammzellen der Maus in eine nicht klebende Bakterienschale in 10 Millilitern basalem Differenzierungsmedium und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, um die Bildung von Embryoidkörpern zu ermöglichen. Nach zwei Tagen werden die Zellaggregate in 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen umgefüllt und durch die Schwerkraft abgesetzt.
Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 10 Milliliter frisches basales Differenzierungsmedium hinzu, um die Embryoidkörper wieder zu suspendieren. Pflanzen Sie sie dann wieder in eine neue, nicht klebende Schale und brüten Sie sie weitere zwei Tage lang aus. Sammeln und säen Sie etwa 50 Embryoidkörper in zwei Millilitern basalem Differenzierungsmedium pro Vertiefung auf eine mit Gelatine beschichtete Platte mit sechs Vertiefungen.
Für die Retinsäure-Induktion geben Sie zwei Mikroliter RA-Stamm in jede Vertiefung bis zu einer Endkonzentration von einem Mikromolaren. Stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator und differenzieren Sie die Zellen für weitere vier Tage. Um eine Differenzierung mit Protokoll drei durchzuführen, wiederholen Sie das zweite Protokoll, aber lassen Sie nur zwei Tage für die embryonale Körperbildung und sechs Tage für die RA-Induktion ein.
Die Qualitätskontrolle der Bildung von Embryoidkörpern sollte mit Hilfe der Mikroskopie durchgeführt werden. Nur wer über helle Kerne verfügt, kann im nachfolgenden Prozess erfolgreich differenzieren. Für Protokoll vier säen Sie 20.000 embryonale Stammzellen von Mäusen pro Vertiefung in die mit Gelatine beschichteten Platten und befolgen Sie das erste Protokoll.
Nachdem Sie die Zellen vier Tage lang differenzieren ließen, geben Sie zwei Mikroliter des gesamten trans RA-Stammes in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte für weitere vier Tage. Um Protokoll fünf durchzuführen, wiederholen Sie Protokoll vier, beginnen Sie jedoch nach nur zwei Tagen der Differenzierung mit der RA-Induktion. Für Protokoll sechs werden 1,5 Millionen Stammzellen in eine nicht klebende Bakterienschale in 10 Milliliter N2B27-Medium zwei gepflanzt und die Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert, um die Bildung von Embryoidkörpern zu ermöglichen.
Nach zwei Tagen sammeln Sie Zellaggregate wie zuvor beschrieben und suspendieren Sie die Embryoidkörper mit 10 Millilitern frischem N2B27 Medium zwei. Pflanzen Sie sie in eine neue, nicht klebende Bakterienschale um und lassen Sie sie weitere zwei Tage lang differenzieren. Am vierten Tag sammeln und säen Sie etwa 50 Embryoidkörper pro Vertiefung auf gelatinebeschichtete Platten mit sechs Vertiefungen mit zwei Millilitern N2B27 Medium zwei.
Geben Sie zwei Mikroliter aller trans RA-Brühe in jede Vertiefung und induzieren Sie die Differenzierung für weitere vier Tage. Um das siebte Protokoll durchzuführen, säen Sie etwa 20.000 Zellen in zwei Millilitern basalem Differenzierungsmedium pro Vertiefung auf die gelatinebeschichteten Platten. Nach der Zelladhäsion und zwei Wäschen mit PBS fügen Sie zwei Milliliter N2B7-Medium, zwei in jede Vertiefung, hinzu und lassen Sie die Zellen acht Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid differenzieren.
Nach der Differenzierung der ersten Phase mit Protokoll drei werden etwa 500.000 embryonale Stammzellderivate der Maus in zwei Millilitern basalem Differenzierungsmedium pro Vertiefung auf die mit 0,1 % gelatinebeschichteten Platten ausgeimpft. Teilen Sie die Derivate nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen ein, um drei Phase-II-Differenzierungsprotokolle zu testen. Inkubieren Sie die Platte sechs Stunden lang, waschen Sie dann die Zellen zweimal mit zwei Millilitern PBS und fügen Sie je nach Protokoll zwei Milliliter basales Differenzierungsmedium N2B27 Medium eins oder N2B27 Medium zwei in jede Vertiefung hinzu.
Legen Sie die Klingen in den Inkubator und lassen Sie die Zellen weitere 10 Tage lang differenzieren, wobei Sie alle zwei Tage das entsprechende Medium wechseln. Sieben Protokolle wurden getestet, um das optimale Protokoll für die Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in allgemeinen Vorläuferzellen oder NPCs zu bestimmen. Die Protokolle wurden sowohl an A2lox-Schlössern als auch an 129 Zellen getestet und der Differenzierungsstatus jeder Gruppe mit einem Lichtmikroskop überwacht.
Die meisten A2lox- und 129-Derivate zeigten gut gestapelte und neuritähnliche Morphologien unter Protokoll drei, was auf die Bildung von NPCs hinweist. Die Zellen, die mit Protokoll zwei differenziert wurden, schienen jedoch apoptotisch zu sein, was auf den Mangel an Nährstoffen in den embryoiden Körpern zurückzuführen sein könnte. Um die Bildung von NPCs weiter zu bestätigen, wurden Nestin-positive Zellen mit Hilfe eines Immunfluoreszenzassays nachgewiesen.
Protokoll drei führte zu dem höchsten Prozentsatz an Nestin-positiven Zellen mit bis zu 78 bzw. 69 % in A2lox bzw. 129 Derivaten. Es wurden drei Protokolle für die Differenzierung von NPCs in Neuronen getestet. Es wurde festgestellt, dass Protokoll drei die Differenzierung am effektivsten induziert.
Die meisten A2lox- und 129-Derivate in Phase-2-Protokoll drei wiesen verlängerte neuronenähnliche Strukturen mit klaren Neuriten und Zellkörpererweiterungen auf. Immunfluoreszenz-Assays bestätigten ferner die Erzeugung von Neuronen mit einem Prozentsatz von Beta-Tubulin drei positiven Zellen von bis zu 68 bzw. 59% in A2lox bzw. 129 Derivaten unter Verwendung des Protokolls drei. Bei diesem Verfahren ist es wichtig sicherzustellen, dass Maus-Assays vor der Differenzierung gesund und undifferenziert sind.
Darüber hinaus sollte nach der Bildung in Bohrkörpern und vor der Differenzierung in der zweiten Phase eine strenge Qualitätskontrolle durchgeführt werden. Diese Technik stellt ein Standardmodell für Forscher der Neurobiologie und Entwicklungsbiologie dar und soll ein leistungsfähiges Werkzeug zur Veranschaulichung der Schlüsselmechanismen der Neurogenese sein.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine optimierte und kostengünstige Methode zur Differenzierung embryonaler Stammzellen in Neuronen vor. Mithilfe von Maus-Embryoid-Körper-Assays zeigt die Technik eine hohe Effizienz und Einfachheit, wodurch sie sich ideal für den breiten Einsatz im Laborbereich der neurologischen Forschung eignet.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zelluläre Differenzierung
- Stammzellbiologie
Hintergrund
- Die neuronale Differenzierung ist entscheidend für das Verständnis der Neurogenese.
- Embryonale Stammzellmodelle eignen sich effizient zur Untersuchung der Zellentwicklung.
- Optimierte Protokolle können die Ausbeute und Vitalität differenzierter Zellen verbessern.
Zweck der Studie
- Etablierung einer standardisierten, effizienten Methode zur Herleitung von Neuronen aus embryonalen Stammzellen.
- Verbesserung der Anwendbarkeit dieser Methode in verschiedenen Laboren.
- Beurteilung unterschiedlicher Protokolle hinsichtlich optimaler Ergebnisse bei der Zelldifferenzierung.
Verwendete Methoden
- Zellkultur in mit Gelatine beschichteten Platten und nicht-adsorbierenden bakteriellen Schalen.
- Maus-embryonale Stammzellen als biologisches Modell für Differenzierung.
- Sieben Differenzierungsprotokolle mit variablen Bedingungen für die Bildung embryonaler Körperchen und die Induktion durch retinsäure.
- Überwachung der Differenzierung mittels Mikroskopie und Immunfluoreszenz-Assays.
- Maßnahmen zur Qualitätskontrolle der Vitalität embryonaler Körperchen und des Differenzierungserfolgs.
Hauptergebnisse
- Protokoll drei ergab den höchsten Prozentsatz an Nestin-positiven neuronalen Vorläuferzellen (78 % in A2lox und 69 % in 129-Derivaten).
- Beta-Tubulin-III-positive Neuronen wurden mit Raten von 68 % bzw. 59 % für A2lox- und 129-Derivate beobachtet.
- Die Qualitätskontrolle zeigte, dass gesunde embryoidale Körper für eine erfolgreiche Differenzierung entscheidend sind.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie stellt ein robustes Werkzeug für die Differenzierung embryonaler Stammzellen in Neuronen bereit und trägt so zur Verbesserung der Forschung in der Neurobiologie bei.
- Die beschriebenen Methoden können für weiterreichende Anwendungen in der Entwicklungsbiologie angepasst werden.
- Schafft Möglichkeiten für ein besseres Verständnis der neuronalen Entwicklung und verwandter Erkrankungen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Einrichtung zuverlässiger In-vitro-Modelle der Neurogenese ist entscheidend für die Zielvalidierung in Programmen zu neurodegenerativen Erkrankungen. Diese Methode stellt ein skalierbares und kosteneffizientes System zur Erzeugung von neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus embryonalen Stammzellen der Maus bereit und unterstützt die frühe mechanistische Entschärfung von Risiken. Der Ansatz ermöglicht reproduzierbare phänotypische Screening-Verfahren und die Entwicklung von Assays für Studien zur Modulation von Signalwegen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen in neurodevelopmentalen Signalwegen unter Verwendung eines definierten Differenzierungssystems.
- Operationaler Wert: Stellt eine nachwachsende Quelle von Nestin-positiven neuronalen Vorläuferzellen für Target-Engagement-Studien bereit.
- Predictiver Wert: Unterstützt die Biomarker-Korrelation durch quantifizierbare Endpunkte wie die Generierung von Beta-Tubulin-III-positiven Neuronen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte neuronale Populationen, die für die Wirkstoffscreening- und Signalwegmodulationsanalysen geeignet sind.
- Operativer Wert: Verwendet kostengünstige, einfach zu handhabende Protokolle, die mit Mehrfachplattenformaten für hohe Durchsatzraten kompatibel sind.
- Reproduzierbarkeitswert: Definierte Schritte zur Embryoidkörperbildung und Induktion durch Retinsäure gewährleisten eine Konsistenz von Charge zu Charge.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt krankheitsrelevante neuronale Zellen, die Schlüsselmechanismen der Neurogenese für die Zielvalidierung modellieren.
- Operativer Wert: Unterstützt die longitudinale Reifung in N2B27-Medium II für eine langfristige neuronale Pflege und funktionelle Analysen.
- Translationale Kontinuität: Verbindet die entdeckungsorientierte Differenzierung von Stammzellen mit präklinischen Arbeitsabläufen in der Neurobiologieforschung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein und ermöglicht die Verwendung von aus Stammzellen abgeleiteten neuronalen Modellen für die Überprüfung von Target-Hypothesen und die Bereitschaft von Assays vor Beginn der Lead-Identifizierung.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die mechanistische Risikominimierung, indem ein kontrolliertes System zur Untersuchung neurogener Pfade und Differenzierungsdynamiken bereitgestellt wird.
- Screening: Liefert quantifizierbare, mikroskopie- und immunfluoreszenzbasierte Messgrößen zur Bewertung von Substanzeffekten in Populationen neuraler Vorläuferzellen und Neuronen.
- Analytik: Erzeugt prozentuale Differenzierungseffizienz-Metriken (nestin+, beta-Tubulin III+), die die vergleichende Analyse von Bedingungen und die Auswahl aussichtsreicher Kandidaten unterstützen.
- Translationale Forschung: Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der Stammzellen-Differenzierung zur neuronalen Reifung für nachgeschaltete phänotypische und funktionelle Validierungen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare, standardisierte Differenzierungsplattform, die in mehreren Projekten der Neurobiologie und Entwicklungsbiologie eingesetzt werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung durch reproduzierbare Generierung von neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus mES-Zellen.
- Operationaler Wert: Verringert die technische Variabilität durch definierte Qualitätskontrolle embryoider Körper und zeitlich gesteuerte Induktion mit Retinsäure.
- Strategischer Wert: Verbessert die Effizienz von Go/No-Go-Entscheidungen, indem frühe biologische Endpunkte in einem physiologisch relevanten System bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen, indem eine mechanistische Risikominimierung in Neurogenese-Wegen ermöglicht wird.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur von Stammzellen, dem Umgang mit embryonalen Körpern und Techniken des Immunfluoreszenzassays.
- Benötigt Gelatine-beschichtete Platten, nicht-adhäsive Bakterienkulturschalen und kontrollierte Inkubatorbedingungen (37 °C, 5 % CO2).
- Erfordert die Standardisierung der Herstellung von Retinsäure-Stammlösungen und die Beurteilung der Qualität embryonaler Körper mittels Mikroskopie.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen beim Übertragen von Protokollen zwischen mES-Zelllinien (z. B. A2lox im Vergleich zu 129-Ableitungen).
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit einer strengen Qualitätskontrolle der Gesundheit embryonaler Körper vor der Induktion mit Retinsäure, um einen erfolgreichen Differenzierungsprozess sicherzustellen.
