Name: In Vivo Quantifizierung des Proteinumsatzes im Alter C. Elegans mit Photoconvertible Dendra2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Erfahren Sie die Quantifizierung des Proteinumsatzes in vivo bei C. elegans mit dem photokonvertierbaren Fluorophor Dendra2. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht die Untersuchung von Proteostase-Netzwerken im Alter.

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Wir würdigen die DFG (KI-1988/5-1 to JK, NeuroCure PhD fellowship by the NeuroCure Cluster of Excellence to MLP) für die Förderung. Wir würdigen auch die Imaging Core Facility des Leibniz-Forschungsinstituts für Molekulare Pharmakologie Berlin (FMP) für die Bereitstellung der Bildgebung. Darüber hinaus möchten wir uns bei Diogo Feleciano bedanken, der das Dendra2-System im Labor aufgebaut und Anweisungen gegeben hat.

1. Erzeugung von C. elegans, die neuronales Huntingtin-Dendra2-Fusionsprotein exdrücken
<ol><li>Klonen Sie das Gen, das für die POI kodiert, in einem Nematodenexpressionsvektor (d. h. pPD95_75, Addgene #1494), durch traditionelles Restriktionsenzym digest10, Gibson Assembly11oder jede Methode ihrer Wahl. Fügen Sie einen Promotor ein, um den Ausdruck in einem gewünschten Gewebe oder in einem gewünschten Entwicklungsstadium zu fördern. Setzen Sie das Dendra2-Fluorophor entweder N- oder C-terminal in den Rahmen mit dem POI ein.</li>
	<li>Generieren Sie transgene C. elegane, die das Fusionskonstrukt ausdrücken (z.B. durch Mikroinjektion)12. HINWEIS: Das Plasmid, das das Transgen trägt, bleibt als extrachromosomales Array erhalten. Die Integration des Konstrukts ist nicht notwendig, kann aber bei Bedarf13durchgeführt werden. In diesem Protokoll wurden C. elegans mit einem Plasmid mikroinjiziert, das das Fusionskonstrukt Huntingtin exon 1-Dendra2 (HTT-D2) unter der Kontrolle des panneuronalen Promotors Prgef-1trug. Das C. elegans Expression Backbone wurde aus Kreis et al.14gewonnen, das Huntingtin exon 1 mit Q25 oder Q97 wurde von Juenemann et al.15bezogen und Dendra2 wurde von Hamer et al.16bezogen.</li>
</ol>2. Altersabgleich und Aufrechterhaltung von C. elegans
<ol><li>Alter passen alle Nematoden durch Synchronisierung entweder mit alkalischer Hypochlorit-Lösung Behandlung17 oder über Eiablage für 4 h bei 20 °C. Für die Eiablage 10 gravid Erwachsene auf eine frisch gesäte Nematoden-Wachstumsmedienplatte (NGM) legen und 4 h vor dem Entfernen lassen. Die in dieser Zeitgelegten Eier führen zu synchronisierten Nematoden.</li>
	<li>Halten Sie experimentelle C. elegans auf Nematoden-Wachstumsmedien (NGM)-Platten, die mit der bakteriellen Nahrungsquelle E. coli OP50 gesät sind, nach Standard-Nematodenhaltung18.</li>
	<li>Nematoden bei 20 °C auf das gewünschte Stadium anbauen. Für dieses Protokoll sind die erforderlichen Altersgruppen die Tage 4 und 10. HINWEIS: Junge Erwachsene an Tag 4 können durch das Vorhandensein von Eiern in ihren Gonaden und ihre hohe Beweglichkeit identifiziert werden. Im Alter von Tag 10 Nematoden sind post-fruchtbar, und unterziehen Gewebe Verschlechterung und LokomotivenRückgang19.</li>
	<li>Für Tag 10 Nematoden, Durchgang täglich nach der L4-Stufe an Tag 3, einmal Nematoden fruchtbar sind, um eine gemischte Bevölkerung zu vermeiden.</li>
</ol>3. Herstellung von Mikroskopienschlitten für die Bildgebung
<ol><li>Bereiten Sie die Mikroskopie-Dias am Tag der Bildgebung vor. In einer Mikrowelle bei einer Konzentration von 3% (w/v) in ddH2O schmelzen allgemeine Sanarose schmelzen. Leicht abkühlen lassen.</li>
	<li>Schneiden Sie die Spitze einer 1 ml Pipettespitze und aspirieren Sie etwa 400 l geschmolzene Agarose. Legen Sie vorsichtig ein paar Tropfen Agarose auf eine saubere Glasrutsche und legen Sie sofort eine weitere Rutsche auf die Oberseite, um sicherzustellen, dass ein dünnes Pad Agarose zwischen den beiden erstellt wird. Trocknen lassen, bevor man sanft gleitet oder die Oberseite abrutscht.</li>
	<li>Legen Sie die Agarose-Pad-Rutschen in einen befeuchteten Behälter, um ein Austrocknen zu verhindern. Diese können innerhalb von 2-3 h verwendet werden. HINWEIS: Vermeiden Sie die Bildung von kleinen Blasen in der Agarose, da die Nematoden darin gefangen werden können.</li>
</ol>4. Definition konfokaler Mikroskopparameter
HINWEIS: Definieren Sie vor der Montage der Nematoden und der Datenerfassung alle Einstellungen für die konfokale Erfassungssoftware. Die Einstellungen können an die Bildverarbeitungshardware und Software der Wahl angepasst werden.
<ol><li>Öffnen Sie die konfokale Software und definieren Sie die Laser-Imaging-Einstellungen. Stellen Sie den Lichtpfad für Anregung/Emission für den grünen Dendra2 auf 486-553 nm und für den roten Dendra2 auf 580-740 nm ein. Passen Sie die Leistung und Verstärkung beider Kanäle/Laser entsprechend der Intensität des Fluorophors an. Ändern Sie nicht die digitale Verstärkung oder den Versatz und stellen Sie das Loch als vollständig geöffnet ein.</li>
	<li>Definieren Sie das Erfassungs-Setup: Wählen Sie einen sequenziellen Kanalmodus aus und wechseln Sie die Spur jedes Frames. Legen Sie den Scanmodus als Frame und die Rahmengröße auf 1.024 x 1.024 mit einem Linienschritt von 1 fest. Legen Sie die Mittelung auf 2 und den Mittelwert nach Methode und Modus der unidirektionalen Linie fest. Stellen Sie die Bittiefe auf 8 Bit ein.</li>
	<li>Definieren Sie die mehrdimensionalen Erfassungseinstellungen für die Konvertierung von Dendra2. Für die Umwandlung und Dasbleichung verwenden Sie den 405 nm Diodenlaser mit 60% Energieleistung. Wenn verfügbar, aktivieren Sie den sicheren BleichgaAsP, um die Detektoren zu schützen.</li>
	<li>Wählen Sie eine Zeitreihe von zwei Zyklen mit einem Intervall von 0,0 ms dazwischen und normalem Start und Stopp aus. Beginnen Sie mit dem Bleichen nach dem Scannen 1 von 2 und wiederholen Sie 30 Iterationen. Hören Sie auf zu bleichen, wenn die Intensität auf 50% sinkt.</li>
	<li>Definieren Sie die Geschwindigkeit der Erfassung/Pixelverweilung so schnell (z. B. maximal = 12) für die Konvertierung und mittlere Geschwindigkeit (z. B. Medium = 5) für die Aufnahme eines Fangbildes. HINWEIS: Die hier definierten Bleichparameter sind Richtlinien. Für andere Dendra2-markierte POIs müssen die Laserleistungseinstellungen und Bleichiterationen und -werte empirisch festgelegt werden.</li>
</ol>5. Montage von C. elegans auf Mikroskopie-Dias
HINWEIS: Wenn möglich, legen Sie ein Montage-Stereomikroskop in der Nähe des konfokalen Mikroskop-Setups und montieren Sie die Nematoden kurz vor der Bildgebung.
<ol><li>Zeichnen Sie auf der Glasabdeckung auf der gegenüberliegenden Seite des Agarose-Pads ein Fenster mit vier Quadraten mit einem permanenten Marker und nummerieren Sie es.</li>
	<li>Pipette 15 L Levamisol in der Mitte des Agarose-Pads. Die Konzentration von Levamisol variiert je nach Alter der Nematode: Wenn Bild4 Nematoden 2 mM Levamisol verwenden; wenn Bildtag 10 Nematoden 0,5 mM Levamisol verwenden.</li>
	<li>Vier Nematoden mit einem Drahtpickinz in die Flüssigkeit geben. Mit Hilfe einer Wimpernpickung bewegen Sie jeden einzelnen Nematoden vorsichtig auf ein Fensterquadrat. Schwenken Sie die Wimpern, so dass jede Spur von E. coli OP50 verdünnt wird und ihr fluoreszierender Hintergrund die Signalaufnahme nicht beeinträchtigt.</li>
	<li>Warten Sie, bis die Nematoden fast aufhören, sich zu bewegen, und legen Sie vorsichtig einen Deckelschlupf auf die Flüssigkeit, um die Nematoden in der Schicht von Levamisol zwischen dem Agarose-Pad und dem Deckelschlupf zu immobilisieren.</li>
	<li>Platzieren Sie die umgekehrte Folie auf der konfokalen Bühne, um die Nematoden abzubilden.</li>
</ol>6. Umwandlung des grünen Dendra2: Datenerfassung zum Zeitpunkt Null
HINWEIS: Die Puls-Chase-Experimente beginnen damit, das Dendra2-Fusionsprotein irreversibel von einem grün emittierenden Fluorophor in ein rotes zu wandeln.
<ol><li>Mit dem Okular des Mikroskops, lokalisieren Sie die erste Nematode mit einem 20-fachen Objektiv unter grüner Fluoreszenz. Konzentrieren Sie sich auf den Kopf oder Schwanz und wechseln Sie in den konfokalen Modus.</li>
	<li>Starten Sie das Live-Laserscannen mit dem 488 nm blauen Laser, um den grünen Dendra2 im grünen EGFP-Kanal (ex/em = 486-553 nm) zu visualisieren. Wählen Sie ein einzelnes Neuron aus und rücken Sie es in den Fokus. Zoomen Sie in 3x und erhöhen Sie das Ziel desLaserstrahls 4. HINWEIS: Wählen Sie ein Neuron pro Nematode. Jedes Neuron bildet eine Probe oder einen Datenpunkt.</li>
	<li>Finden Sie die maximale Projektionsebene und, je nach Helligkeit des Fluorophors, erhöhen oder verringern Sie die Verstärkung oder Laserleistung, um ein gesättigtes, aber nicht überbelichtetes Bild zu erhalten, das durch den Farbbereichsindikator identifizierbar ist. Sobald dies definiert ist, beenden Sie den Scanvorgang. HINWEIS: Bestrahlen Sie die Probe nicht zu lange oder mit zu viel Leistung, da die Anregung mit sichtbarem blauen 488 nm Licht auch Dendra2 umwandeln kann, wenn auch langsam und weniger effizient4.</li>
	<li>Öffnen Sie in der Software die Registerkarte, um die Interessengebiete (ROIs) auszuwählen und einen ersten ROI um das ausgewählte Neuron zu zeichnen. Definieren Sie eine größere zweite Region von Interesse, die den Kopf der Nematode und den ersten ROI umfasst.</li>
	<li>Wählen Sie in den Bleicheinstellungen aus, ob der erste ROI erfasst, gebleicht und analysiert werden soll. Wählen Sie aus, ob der zweite ROI erfasst und analysiert, aber nicht gebleicht werden soll.</li>
	<li>Stellen Sie die Geschwindigkeit des Scannens auf das Maximum (d. h. schnelle Pixelverweilung) ein und starten Sie das Experiment, um die ausgewählten Dendra2-Neuronen zu konvertieren. HINWEIS: Sobald das Experiment abgeschlossen ist, führt das aufgenommene Bild zu zwei Bildern: einem vor und einem nach der Konvertierung. Für den grünen Kanal sollte das erste Bild ein höheres grünes Signal haben, das im zweiten Bild durch die Konvertierung des grünen Dendra2 abnimmt. Für den roten Kanal sollte das erste Bild negativ sein und kein Signal anzeigen, wobei ein rotes Signal im Nachversionsbild erscheint. Wenn das grüne Signal nicht nachlässt, ist die Konvertierung nicht erfolgt, und die Einstellungen, z. B. die 405-Laserleistung oder die Anzahl der Iterationen, sollten geändert werden. Wenn es ein rotes Signal im ersten Bild gibt, dann war die 488 nm Laserleistung zu hoch und ein Teil des grünen Dendra2 wurde bereits in Rot umgewandelt. In diesem Fall sollte ein neues Neuron/Nematode ausgewählt werden.</li>
	<li>Unmittelbar nach der Konvertierung starten Sie das Live-Scannen mit dem grünen 561 nm Laser, um Dendra2 im roten Kanal zu visualisieren (ex/em = 580-740 nm). Finden Sie den Fokus und die entsprechende maximale Projektion des konvertierten Neurons mit dem Bereichsfarbindikator, um eine Überbelichtung zu vermeiden.</li>
	<li>Stellen Sie die Scanrate schnell auf eine niedrigere Pixelverweilgeschwindigkeit (z. B. 5x) ein und erfassen Sie ein Schnappschussbild beider Kanäle mit einer höheren Auflösung. Dieses Bild wird nach der Konvertierung als Zeitpunkt Null (T0) definiert. HINWEIS: Die Aufnahmegeschwindigkeit für das konvertierte Bild kann variiert werden. Nach der Auswahl muss diese Geschwindigkeit jedoch während der gesamten Datenerfassung konstant bleiben.</li>
	<li>Speichern Sie den Scan mit einem identifizierbaren Namen und/oder einer identifizierbaren Nummer, gefolgt von der Zeit-Null-Beschriftung (T0). HINWEIS: Es ist ratsam, auch das Bild des Konvertierungsexperiments (Schritt 6.6) zu speichern, um das Fehlen eines roten Signals vor der Konvertierung und sein Anschließendes Aussehen zu veranschaulichen.</li>
</ol>7. Bildgebung des konvertierten roten Dendra2 zur Datenerfassung zu einem ausgewählten zweiten Zeitpunkt
<ol><li>Um den Dendra2-Abbau im Laufe der Zeit zu verfolgen, definieren Sie einen zweiten Zeitpunkt, um das gleiche Nematoden/Neuron neu abzubilden. Wählen Sie den zweiten Zeitpunkt experimentell aus, um relevante biologische Fragen zu behandeln. Für das hier beschriebene Protokoll wird Dendra2 sowohl bei 2 h (T2) als auch bei 24 h (T24) nach der Konvertierung abgebildet.<ol>
<li>Am gewählten Zeitpunkt finden Sie das gleiche Nematoden/Neuron mit der Verwendung des Okulars und der roten Fluoreszenz.</li>
		<li>Öffnen Sie das T0-Bild des jeweiligen Nematoden/Neurons und laden/wiederverwenden Sie die Bildeinstellungen. Stellen Sie sicher, dass die Erfassungseinstellungen des Snapshots beim Erfassen der T0-, T2- und T24 h-Images genau gleich sind.</li>
		<li>Scannen Live im roten Kanal, bringen Sie das konvertierte rote Neuron in den Fokus. Da der rote Dendra2 im Laufe der Zeit abnimmt, zeigt die Reichweitenanzeige eine weniger intensive maximale Projektion. Ändern Sie keine Erfassungsparameter und erhalten Sie einen Snapshot mit der gleichen Geschwindigkeit (z. B. 5x) wie das erste Bild.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um den Abbau von Dendra2 nach 4 h oder länger zu verfolgen, retten Sie die Nematoden nach der Konvertierung.<ol>
<li>Entfernen Sie den Dia sofort nach dem Konvertieren und der Abbildung der vier Nematoden aus dem Mikroskop. Entfernen Sie vorsichtig den Coverslip und heben Sie mit einem Drahtpickel jede Nematode aus dem Agarose-Pad.</li>
		<li>Legen Sie jede Nematode einzeln auf eine entsprechend gekennzeichnete und identifizierbare NGM-Platte.</li>
		<li>Montieren Sie das Nematode zum zweiten Zeitpunkt wieder auf ein frisches Agarosepad und fahren Sie mit der Abbildung des umgebauten roten Dendra2 nach den Anweisungen in Abschnitt 6 fort.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Bildanalyse des konvertierten Dendra2
HINWEIS: Die Analyse des Abbaus von Dendra2 wird mit Fidschi/ImageJ Software20durchgeführt.
<ol><li>Öffnen Sie Fidschi und ziehen Sie die .lsm-Datei in die Fidschi-Leiste. Öffnen Sie das Direkt nach der Konvertierung aufgenommene T0-Bild und das Bild desselben Nematodens, das am ausgewählten Zeitpunkt nach der Konvertierung aufgenommen wurde (T2 oder T24 h). HINWEIS: Um den Abbau des zu Dendra2 verschmolzenen Proteins zu verfolgen, muss nur der rote Kanal analysiert werden.</li>
	<li>Legen Sie die Messparameter aus dem Menü fest: Analysieren | Messen einstellen. Wählen Sie die Funktionen Fläche und integrierte Dichte aus.</li>
	<li>Wählen Sie das Bild aus, das mit dem roten Kanal erhalten wurde. Wählen Sie das Polygonauswahlwerkzeug in der Fidschi-Leiste aus.</li>
	<li>Identifizieren Sie das konvertierte Neuron auf dem T0-Bild und zeichnen Sie mit dem Auswahltool einen ROI um sie herum.<ol>
<li>Um die Konturen des Neurons richtig zu identifizieren, markieren Sie die Intensitätsschwellen, indem Sie aus dem Balken Bild | Anpassen | Schwellenwert. Ziehen Sie den Balkencursor, um den Schwellenwert abzugrenzen und diesen Bereich mit dem Polygonwerkzeug zu verfolgen. Um einen genauen ROI zu erzeugen, ist es auch möglich, die Kontur des ausgewählten Neurons aus dem grünen Kanal zu verwenden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobald die Auswahl im Fenster des roten Kanals vorgenommen wurde, drücken Sie Analysieren | Maßnahme. Ein Popupfenster mit dem Namen Ergebnisse wird angezeigt und enthält die ROI-Werte für Area, IntDenund RawIntDen.</li>
	<li>Führen Sie den gleichen Auswahl- und Messprozess für das Bild des zweiten Zeitpunkts (T2 oder T24 h) durch.</li>
	<li>Kopieren Sie die erhaltenen Werte in eine Tabellenkalkulationssoftware, wobei Sie darauf achten, die Werte nach der Konvertierung bei T0 und nach der Konvertierung bei T2 oder T24 h entsprechend aufzuzeichnen.</li>
</ol>9. Berechnung des Verhältnisses der Dendra2-Degradation
<ol><li>Um das Abbauverhältnis zu berechnen, weisen Sie zunächst einen Wert von 1 (oder 100%) zu. zeit, um die Degradation vom Zeitpunkt Null (d.h. kurz nach der Konvertierung, wenn alle roten Dendra2 konvertierten ist noch vorhanden). Dies ergibt sich aus der Aufteilung des Wertes von IntRawDen von T0 selbst.</li>
	<li>Um die Reduktion des roten Dendra2-Intensitätssignals im Zeitverlauf und den Abbau zu berechnen, dividieren Sie den Wert von RawIntDen des zweiten Zeitpunkts (z. B. T2 oder T24 h) durch den Wert des RawIntDen von T0. Die resultierende Zahl sollte kleiner als 1 sein. Diese Werte können auch als Prozentsätze ausgedrückt werden, indem T0 als 100 % definiert wird.</li>
	<li>Wiederholen Sie Abschnitt 7 für jede konvertierte Nematode. Für eine grafische Darstellung des Abbaus von Dendra2, diagrammen Sie ein Streudiagramm oder Balkendiagramm mit den Prozent- oder Verhältniswerten der Fluoreszenzabnahme, die in der y-Achse erhalten wurde. Wenden Sie die gewünschte statistische Analyse an und veranschaulichen Sie sie im Diagramm.</li>
</ol>

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<li>Feleciano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+Between+Chaperone-Mediated+Protein+Disaggregation+and+Proteolytic+Pathways+in+Aging+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+real-time+monitoring+of+protein+degradation+at+the+single+cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level.</a> BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).</li>
<li>Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+measurement+of+membrane+receptor+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">High resolution measurement of membrane receptor endocytosis.</a> Journal of Biological Methods. 5 (4), 105(2018).</li>
<li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+imaging+of+multiple+fluorescent+proteins+with+highly+overlapping+emission+spectra+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells.</a> Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Um die Funktion eines Proteins zu verstehen, ist es wichtig, seine Synthese, Seinen Standort und seine Degradation zu verstehen. Mit der Entwicklung neuartiger, stabiler und heller FPs ist die Visualisierung und Überwachung von POIs einfacher und effizienter geworden. Genetisch exprimierte Fusions-PAFPs wie Dendra2 sind einzigartig positioniert, um die Stabilität eines POI zu untersuchen. Bei der Exposition gegenüber lila-blauem Licht bricht Dendra2 an einer genauen Stelle innerhalb eines Dreiklangs konservierter Aminosä...

Das Proteom eines lebenden Organismus erneuert sich ständig. Proteine werden kontinuierlich abgebaut und entsprechend dem physiologischen Bedarf einer Zelle synthetisiert. Einige Proteine werden schnell eliminiert, während andere länger gelebt werden. Die Überwachung der Proteindynamik ist eine einfachere, genauere und weniger invasive Aufgabe bei der Verwendung genetisch kodierter fluoreszierender Proteine (FPs). FPs bilden sich autokatalytisch und können mit jedem Protein von Interesse (POI) verschmolzen werden, erfordern aber keine Enzyme, um Kofaktoren zu falten oder zu benötigen, außer Sauerstoff1. Eine neuere Generation von FPs wurde vor kurzem entwickelt, um die Farbe bei Bestrahlung mit einem Lichtimpuls von bestimmter Wellenlänge zu schalten. Diese photoaktivierbaren FPs (PAFPs) ermöglichen die Kennzeichnung und Nachverfolgung von POIs oder der Organellen oder Zellen, in denen sie sich befinden, und ihre quantitativen und/oder qualitativen Parameter zu untersuchen2. FPs ermöglichen es, die Bewegung, Die Richtung, die Bewegungsrate, den Diffusionskoeffizienten, die beweglichen oder unbeweglichen Fraktionen, die Zeit, zu der sie sich in einem Mobilfunkfach befindet, sowie die Fluktuationsrate zu verfolgen. Für bestimmte Organellen können Fortbewegung und Transport oder Spalt- und Fusionsereignisse bestimmt werden. Für einen bestimmten Zelltyp können die Position, die Division, das Volumen und die Form einer Zelle festgelegt werden. Entscheidend ist, dass die Verwendung von PAFPs tracking ohne kontinuierliche Visualisierung und ohne Interferenzen von neu synthetisierten Sonden ermöglicht. Studien sowohl an Zellen als auch an ganzen Organismen haben ERFOLGREICH PAFPs eingesetzt, um biologische Fragen in vivo zu behandeln, wie die Entwicklung von Krebs und Metastasen, die Montage oder Demontage des Zytoskeletts und DIE INTERAKTIONen zwischen RNA-DNA/Protein3. In diesem Manuskript werden Lichtmikroskopie und PAFPs verwendet, um die Fluktuationsraten des aggregationsanfälligen Proteins Huntingtin (HTT) in vivo in einem C. elegans Modell neurodegenerativer Erkrankungen aufzudecken.
Das hier beschriebene Protokoll quantifiziert die Stabilität und den Abbau des Fusionsproteins huntingtin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 ist eine monomere PAFP4 der zweiten Generation, die ihre Emissions-/Erregungsspektren als Reaktion auf UV oder sichtbares blaues Licht irreversibel von grün auf rot umstellt, mit einer Erhöhung ihrer Intensität um bis zu 4.000-fache5,6. Huntingtin ist das Protein, das für die Huntington-Krankheit (HUNTINGTON), eine tödliche erbliche neurodegenerative Störung, verantwortlich ist. Huntingtin exon-1 enthält eine Strecke von Glutaminen (CAG, Q). Wenn das Protein mit über 39Q exprimiert wird, wird es zu einem mutierten, toxischen und pathogenen Protein verkommen. Mutante HTT ist anfällig für Aggregation und führt zu neuronalen Zelltod und Degeneration, entweder als kurze oligomere Arten oder als größere hoch strukturierte Amyloide7.
Das Nematode ist ein Modellsystem zur Untersuchung von Alterung und Neurodegeneration dank seiner einfachen Manipulation, isogenen Natur, kurzen Lebensdauer und seiner optischen Transparenz8. Um die Stabilität von HTT in vivo zu untersuchen, wurde ein Fusionskonstrukt im Nervensystem von C. elegansausgedrückt. Ein HTT-D2-Transgen, das entweder eine physiologische Dehnung von 25Qs (HTTQ25-D2) oder eine pathologische Strecke von 97Qs (HTTQ97-D2) enthält, wird während der gesamten Lebensdauer der Nematode panneuronal überexprimiert9. Durch die Unterwerfung von lebenden C. elegans einem kurzen und fokussierten Lichtpunkt wird ein einzelnes Neuron photoswitched und der konvertierte HTT-D2 im Laufe der Zeit verfolgt. Um die Menge an HTT-D2 abgebaut zu ermitteln, wird die Differenz zwischen dem roten Signal des frisch umwandelten HTT-D2 mit dem verbleibenden roten Signal von HTT-D2 nach einem bestimmten Zeitraum verglichen. Daher wird es möglich zu untersuchen, wie Huntingtin abgebaut wird, wenn es in seiner erweiterten und toxischen Form im Vergleich zu seiner physiologischen Form gefunden wird; wie vordere oder hintere Neuronen unterschiedlich auf das Vorhandensein von Q97 im Vergleich zu Q25 reagieren, insbesondere über längere Zeiträume; und wie der Zusammenbruch des Proteostase-Netzwerks (PN) während des Alterns zu den Unterschieden bei den Abbauraten beiträgt. Diese Ergebnisse beschreiben nur eine kleine Reihe von Beobachtungen zum Umsatz von HTT-D2. Mit dieser In-vivo-Anwendung können jedoch viele weitere biologische Fragen behandelt werden, die sowohl für den Bereich der Proteinaggregation als auch für die Proteostase relevant sind.

<table><tbody><tr><td>Agar-Agar Kobe I</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>5210.2</td><td>NGM-Komponente</td></tr><tr><td>Agarose, Universal Grade</td><td>Bio & Sell GmbH</td><td>BS20.46.500</td><td>Montageschieber</td></tr><tr><td>Bauteil BD Bacto Pepton</td><td>BD-Bionsciences</td><td>211677</td><td>NGM Bauteil</td></tr><tr><td>Deckgl&auml; ser-18x18mm</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0657.2</td><td>Deckgläser</td></tr><tr><td>EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Objektiv</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ 1.52p</td><td>NIH</td><td></td><td>Analysesoftware</td></tr><tr><td>Levamisolhydrochlorid</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4341</td><td>Anästhetikum</td></tr><tr><td>LSM710-ConfoCor3</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Laser Scanning Konfokales Mikroskop</td></tr><tr><td>Montage Stereomikroskop</td><td>Leica Camera AG</td><td></td><td>Montage Mikroskop</td></tr><tr><td>neuronal-HTTQ25-Dendra2</td><td>dieses Papier</td><td></td><td>C. elegans Stamm</td></tr><tr><td>neuronal-HTTQ97-Dendra2</td><td>dieses Papier</td><td></td><td>C. elegans Stamm</td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli</td><td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td><td>OP50</td><td>Nematoden Nahrungsquelle</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3957.2</td><td>NGM-Komponente</td></tr><tr><td>Standard-Objekttr&auml; ger</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0656.1</td><td>Objektträger</td></tr><tr><td>ZEN2010 B SP1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Konfokale Erfassungssoftware</td></tr></tbody></table>

in vivo quantifizierung des proteinumsatzes im alter c. elegans mit photoconvertible dendra2

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Proteine werden in einer Zelle ständig synthetisiert und abgebaut, um die Homöostase aufrechtzuerhalten. Die Möglichkeit, den Abbau eines Proteins von Interesse zu überwachen, ist der Schlüssel, um nicht nur seinen Lebenszyklus zu verstehen, sondern auch Ungleichgewichte im Proteostase-Netzwerk aufzudecken. Diese Methode zeigt, wie man den Abbau des krankheitserregenden Proteins Huntingtin nachverfolgt. Zwei Versionen von Huntingtin, die zu Dendra2 verschmolzen sind, werden im Nervensystem C. elegans ausgedrückt: eine physiologische Version oder eine mit einer erweiterten und pathogenen Strecke von Glutaminen. Dendra2 ist ein photokonvertierbares fluoreszierendes Protein; Bei einem kurzen ultravioletten (UV) Bestrahlungsimpuls schaltet Dendra2 seine Anregungs-/Emissionsspektren von grün auf rot. Ähnlich wie bei einem Puls-Chase-Experiment kann der Umsatz des umgebauten Rot-Dendra2 unabhängig von der Interferenz durch neu synthetisiertes Grün-Dendra2 überwacht und quantifiziert werden. Mit konfokaler Mikroskopie und aufgrund der optischen Transparenz von C. elegansist es möglich, den Abbau von Huntingtin-Dendra2 in einem lebenden, alternden Organismus zu überwachen und zu quantifizieren. Neuronale Huntingtin-Dendra2 wird kurz nach der Umwandlung teilweise abgebaut und im Laufe der Zeit weiter gerodet. Die Systeme, die den Abbau kontrollieren, sind in Gegenwart von mutiertem Huntingtin mangelhaft und durch das Altern weiter beeinträchtigt. Neuronale Subtypen innerhalb desselben Nervensystems weisen unterschiedliche Umsatzkapazitäten für Huntingtin-Dendra2 auf. Insgesamt kann die Überwachung jedes Proteins von Interesse, das zu Dendra2 verschmolzen ist, wichtige Informationen nicht nur über seine Verschlechterung und die Akteure des beteiligten Proteostase-Netzwerks liefern, sondern auch über seinen Standort, seinen Menschenhandel und seinen Transport.

Zwei Nematodenstämme, die das Huntingtin-Exon-1-Proteinfragment im Rahmen mit dem photoconvertibleprotein Dendra2 exzessierten, wurden durch Mikroinjektion erhalten und die Plasmide wurden als extrachromosomales Array gehalten. Das Fusionskonstrukt wurde im gesamten C. elegans Nervensystem von der Entwicklung während des alternden Alterung ausgedrückt. Hier enthielt HTT-D2 entweder die physiologische 25 Polyglutamin-Dehnung (HTTQ25-D2, Abbildung 1<st...

Hier wird ein Protokoll zur Überwachung des Abbaus des mit dem photokonvertierbaren Fluorophor Dendra2 verschmolzenen Proteins Huntingtin vorgestellt.

In Vivo Quantifizierung des Proteinumsatzes im Alter C. Elegans mit Photoconvertible Dendra2

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Verfolgung und Quantifizierung des Abbaus eines Proteins von Interesse an lebenden und alternden C.elegans. Diese in vivo und nichtinvasive Technik erfordert nur wenig Mikroskopie eingerichtet, um Dendra2 zuverlässig in ein helles und stabiles Fluorophor umzuwandeln. Die Methode ist an Säugetiersysteme sowie Zebrafische anpassungsfähig.Zu studieren, in Umsatz innerhalb des Proteostatis-Netzwerks sowie Transport und Menschenhandel setzen. Achten Sie darauf, keine unerwünschte Konvertierung von Dendra2 beim Scannen mit dem Blaulichtlaser zu provozieren und die Erfassungseinstellungen und Konvertierungseinstellungen für jedes System und Fusion-Protein zu testen und zu optimieren. Beginnen Sie mit dem Anbau altersgerechter Nematoden bei 20 Grad Celsius auf das gewünschte Alter für das Experiment.Am Tag des bildgebenden Experiments entstand in einer Konzentration von 3% in doppelt destilliertem Wasser eine Schmelze-Allgemeinatrat-Agarose. Während die Agarose abkühlt, schneiden Sie die Spitze einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze, um die Aspiration von ca. 400 Mikrolitern der geschmolzenen Agarose zu erleichtern. Fügen Sie vorsichtig ein paar Tropfen Agarose auf eine saubere Glasrutsche und legen Sie sofort eine weitere Rutsche auf die Tropfen, um ein dünnes Pad Von-Agarose zwischen den beiden Glasstücken zu schaffen.Wenn die Agarose getrocknet ist, entfernen Sie vorsichtig die obere Rutsche. Wenn genügend Dias vorbereitet wurden, öffnen Sie die konfokale Mikroskop-Software und stellen Sie den Lichtpfad für Anregung und Emission ein. Für grüne Dendra2 486 bis 553 Nanometer hinzufügen, und für rote Dendra2 fügen Sie 580 bis 740 Nanometer hinzu.Stellen Sie die Leistung und Verstärkung beider Kanäle entsprechend der Intensität des Fluorophors ein und stellen Sie das Loch auf vollständig geöffnet ein. Wählen Sie einen sequenziellen Kanalmodus aus, und legen Sie die Spur so fest, dass sie jeden Frame wechselt. Legen Sie den Scanmodus als Rahmen und die Rahmengröße auf 1024 bis 1024 mit einem Linienschritt von 1 fest.Legen Sie die Mittelung auf zwei und die mittlere Methode und den Modus der unidirektionalen Linie auf den Mittelwert fest. Stellen Sie die Bittiefe auf acht Bit fest. Definieren Sie die multidimensionale Erfassungseinstellung für die Konvertierung von Dendra2.Verwenden Sie für die Umwandlung und Dasbleichung den 405 Nanometer Diodenlaser, der auf 60 % Energieleistung eingestellt ist. Wählen Sie eine Zeitreihe von zwei Zyklen mit einem Intervall von 0,0 Millisekunden zwischen den Zyklen und einem normalen Start und Stopp aus. Legen Sie die Bleichen nach dem Scannen einer von zwei zu starten, für 30 Iterationen zu wiederholen und zu stoppen, wenn die Intensität auf 50% sinkt Dann definieren Sie die Geschwindigkeit der Erfassung Pixel wohnen schnell für die Konvertierung und auf Medium für die Aufnahme eines Snap-Bild.Um die Nematoden auf den Dias zu montieren, verwenden Sie einen permanenten Marker, um ein Fenster mit vier Quadraten auf der gegenüberliegenden Seite des Agarose-Pads auf jeder Folie zu zeichnen und zu nummerieren. Fügen Sie 15 Mikroliter Levamisol in die Mitte des Agarose-Pads und verwenden Sie ein Stereomikroskop und einen Drahtpick, um für altersgerechte Nematoden in das Tröpfchen zu übertragen. Verwenden Sie eine Wimpernauswahl, um jede Nematode sanft in ein Fenster des Quadrats zu bewegen.Wenn alle Nematoden neu positioniert wurden, warten Sie, bis sich die Würmer nicht mehr bewegen, bevor Sie einen Deckelschlupf über die Flüssigkeit legen, um die Nematoden während der Bildgebung zu immobilisieren. Legen Sie dann die Folie auf die konfokale Mikroskopstufe. Für grüne Dendra2-Umwandlung verwenden Sie das Okular des 20 X Objektivs unter grüner Fluoreszenz, um die erste Nematode zu lokalisieren und sich auf den Kopf oder Schwanz zu konzentrieren.Wechseln Sie in den konfokalen Modus und erhöhen oder verringern Sie die Verstärkung und Laserleistung, um ein gesättigtes, aber nicht überbelichtetes Bild zu erhalten. Zeichnen Sie eine Region von Interesse um das ausgewählte Neuron und ziehen Sie eine zweite größere Region von Interesse um den Schwanz, die die erste Region von Interesse enthält. Legen Sie die erste region fest, die erworben, gebleicht und analysiert werden soll.Legen Sie den zweiten Bereich fest, der erworben und analysiert, aber nicht gebleicht werden soll. Stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf maximum ein und starten Sie den Scan, um die ausgewählten Dendra2-Neuronen zu konvertieren. Unmittelbar nach der Konvertierung beginnen Sie mit dem Grünen 561 Nanometer Laser mit dem Live-Scannen, um Dendra2 im roten Kanal zu visualisieren und den Fokus und die jeweilige maximale Projektion des umgewandelten Neurons zu finden.Stellen Sie die Scanrate schnell auf eine niedrigere Pixelverweilgeschwindigkeit ein und erfassen Sie ein Snapshot-Bild beider Kanäle mit einer höheren Auflösung. Dieses Bild wird nach der Konvertierung zum Zeitpunkt Null betrachtet. Speichern Sie dann den Scan mit einem identifizierbaren Namen und einer Nummer, gefolgt von der Bezeichnung "Zeit null".Um den Dendra2-Abbau im Laufe der Zeit zu verfolgen, öffnen Sie das Mal Nullbild des jeweiligen Nematoden-Neurons. Mit der gleichen Bildeinstellung beginnen Sie live im roten Kanal zu scannen und das konvertierte rote Neuron in den Fokus zu rücken. Dann, ohne Erfassungsparameter zu ändern, erhalten Sie einen Snapshot mit der gleichen Geschwindigkeit wie das erste Bild.Achten Sie darauf, Ihre Konvertierungseinstellung sorgfältig zu definieren, um Dendra2 effizient und ausreichend zu konvertieren und die gleichen Erfassungsparameter über verschiedene Zeitpunkte hinweg beizubehalten. Um die konvertierten Dendra2-Bilder zu analysieren, öffnen Sie die Zeit-Null- und zweiten Zeitpunktbilder in Fidschi und öffnen Sie "Messungen analysieren und festlegen". Wählen Sie die Funktionen Fläche und integrierte Dichte aus, und wählen Sie das Bild aus, das mit dem roten Kanal erhalten wurde.Zeichnen Sie mit dem Polygonauswahlwerkzeug einen Interessenbereich um die Zeit Null konvertiertes Neuron. Um die Konturen des Neurons richtig zu identifizieren, wählen Sie Bild, Anpassen und Schwellenwert aus, um die Intensitätsschwellen hervorzuheben. Nachdem die Auswahl definiert wurde, klicken Sie auf Analysieren und Messen.Es wird ein Popup-Ergebnisfenster angezeigt, das die Flächen-, integrierten Dichte- und integrierten Rohdichtewerte für den ausgewählten Interessenbereich einschließen wird. Führen Sie den gleichen Auswahl- und Messprozess für das Bild ab dem zweiten Zeitpunkt durch. Kopieren Sie dann die Werte in die Kalkulationstabelle.In dieser repräsentativen Analyse vor der Konvertierung war kein rotes Signal sichtbar, wenn die Probe im roten Kanal angeregt wurde. Bei bestrahlung verringerte sich das grüne Signal, als HTT-D2 umgewandelt wurde und anschließend ein rotes Signal erschien. HTT-D2-Expression im Laufe der Zeit abgebaut, was zu einer Verringerung der Niveaus des roten HTT-D2-Signals und eine mögliche Erhöhung des grünen HTT-D2-Signals, da mehr Fusion Protein neu synthetisiert wurde.Insbesondere wurden die Neuronen der Schwanzregion als signifikant aktiver im Vergleich zu denen des Kopfes bestimmt. Darüber hinaus gab es deutlich mehr Abbau der Kontrolle HTTQ25-D2 24 Stunden nach der Umwandlung, dann nach zwei Stunden in den Kopf und Schwanz Neuronen. Dieser Unterschied wurde bei pathogenen HTTQ97-D2 nicht beobachtet, was darauf hindeutet, dass das Proteostase-Netzwerk nicht in der Lage war, HTT-D2 zu entfernen, das längere Glutamin-Strecken im gesamten Nervensystem enthält.HTTQ97-D2 wurde nicht so effizient abgebaut wie HTTQ25-D2 in sehr alten Nematoden, was die Unfähigkeit des Proteostase-Netzwerks unterstreicht, aggregierte und möglicherweise toxische Arten von Huntingtin bei älteren Tieren zu entfernen. Wichtig ist, Schwanz neuronen waren in der Lage, mit toxischen HTTQ97-D2 in jungen Nematoden zu bewältigen, was darauf hindeutet, dass verschiedene begleite Proteostase Netzwerkmechanismen am Werk sein könnte, um HTT-D2 zu entfernen. Für jede Probe erfassen und nicht überbelichtet und ungesättigte Bild unmittelbar nach der Konvertierung und wiederverwenden sie die gleiche Einstellung für diese Probe im Laufe der Zeit.Mit diesem Protokoll ist es möglich, Veränderungen in einem Proteostatis-Netzwerk zu testen und mit Hilfe der superhochauflösenden Mikroskopie die Ausbreitung von krankheitsassoziierten Proteinen zu verfolgen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Skelettmuskulatur ist wichtig für die Fortbewegung und ist der betreffenden Einrichtungen Hauptproteinspeicher. Muscle Gesundheitsmessungen innerhalb C. elegans beschrieben. Potenzielle Änderungen an Muskel Struktur und Funktion werden mit lokalisierten GFP und kationische Farbstoffe bewertet.

Methoden zur subzellulärer Kompartimente der Muskel in Beurteilen C. elegans

Protein-Spiegel in Zellen und Geweben werden oft dicht durch das Gleichgewicht der Proteinproduktion und Freigabe geregelt. Verwendung Fluoreszenzabklingzeit Nach Photokonversion (FDAP) können die Clearance-Kinetik von Proteinen experimentell in vivo gemessen werden.

Mess Protein Stabilität in Wohnzebrafischembryonen unter Einsatz von Fluoreszenz Decay Nach Photokonversion (FDAP)

Hier präsentieren wir Ihnen einen Rahmen für die breite Palette diätetische Einschränkung auf Genexpression und Lebensdauer zu beziehen. Wir beschreiben Protokolle für die breite Palette diätetische Einschränkung und quantitative Bildgebung der Genexpression unter diesem Paradigma. Wir skizzieren weitere numerische Analysen zu offenbaren zugrunde liegenden Informationen Bearbeitungsfunktionen der genetischen Schaltungen in Essen-sensing beteiligt.

Quantifizierung der Information kodiert durch Gene Expression Ebenen während der Lebensdauer Modulation unter breiter Palette diätetische Einschränkung in C. elegans

Das Ziel der hier vorgestellten Methode ist Proteinaggregation während der normalen Alterung bei Modellorganismus C. Eleganszu erkunden. Das Protokoll stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, sehr unlöslichen großen Aggregaten, die mit zunehmendem Alter bilden zu studieren und zu klären, wie Änderungen in Proteostase Proteinaggregation auswirken.

Methoden zur Untersuchung Veränderungen inhärenten Proteinaggregation mit dem Alter in Caenorhabditis elegans

Fluoreszenzlebensdauer Bildgebung überwacht, quantifiziert und unterscheidet die Aggregationstendenzen von Proteinen in lebenden, Alterung, und gestressten C. elegans Krankheitsmodelle.

Charakterisierung von Amyloidstrukturen im Altern C. Elegans mit Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebung

Der proteostatische Rückgang ist ein Kennzeichen des Alterns und erleichtert das Auftreten neurodegenerativer Erkrankungen. Wir skizzieren ein Protokoll zur quantifizierbaren Messung der Proteostase in zwei verschiedenen Caenorhabditis elegans-Geweben durch heterologe Expression von Polyglutamin-Wiederholungen, die mit einem fluoreszierenden Reporter verschmolzen sind. Dieses Modell ermöglicht eine schnelle genetische In-vivo-Analyse der Proteostase.

Quantifizierung des gewebespezifischen proteostatischen Rückgangs bei Caenorhabditis elegans

Hier stellen wir eine nicht-radioaktive und nichtinvasive Methode zur Bewertung der de novo Proteinsynthese in vivo vor und beschreiben sie unter Verwendung des Nematoden Caenorhabditis elegans und der Fluoreszenzrückgewinnung nach dem Photobleichen (FRAP). Diese Methode kann mit genetischen und/oder pharmakologischen Screens kombiniert werden, um neuartige Modulatoren der Proteinsynthese zu identifizieren.

Bewertung der de novo Proteinsyntheseraten bei Caenorhabditis elegans

Hier wird eine Methode zur Analyse der Proteinaggregationskinetik im Fadenwurm Caenorhabditis elegans vorgestellt. Tiere aus einer alterssynchronisierten Population werden zu verschiedenen Zeitpunkten abgebildet, gefolgt von einer halbautomatischen Inklusionszählung in CellProfiler und Anpassung an ein mathematisches Modell in AmyloFit.

Überwachung der Proteinaggregationskinetik in vivo mittels automatisierter Einschlusszählung bei Caenorhabditis elegans

Der Unterricht in den Biowissenschaften kann für die Studierenden durch Experimente anregender gestaltet werden. Dieses Manuskript stellt zwei verschiedene, aber sich ergänzende Protokolle vor, die im Unterricht verwendet werden können, um die Schüler zu ermutigen, Hypothesen in Bezug auf kalorienreiche Ernährung, Hunger und Altern zu formulieren und zu testen.

Verwendung kostengünstiger Farbstoffe zur Visualisierung der Glykogenakkumulation und der Darmintegrität bei Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll bietet einen standardisierten Ansatz für die Abbildung der mitochondrialen Morphologie in mehreren Geweben von C. elegans während des Alterns.

Bildgebung und Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie bei C. elegans während des Alterns

Erfahren Sie die Quantifizierung des Proteinumsatzes in vivo bei C. elegans mit dem photokonvertierbaren Fluorophor Dendra2. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht die Untersuchung von Proteostase-Netzwerken im Alter.

In Vivo Quantifizierung des Proteinumsatzes im Alter C. Elegans mit Photoconvertible Dendra2

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