Name: Ein kleines Setup für Algentoxizitätstests von Nanomaterialien und anderen schwierigen Stoffen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Lernen Sie die LEVITATT-Plattform für Algentoxizitätstests kennen, die LED-Beleuchtung für gleichmäßige Lichtverhältnisse nutzt. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Tests von Nanomaterialien und anderen schwierigen Substanzen.

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Diese Forschung wurde von PATROLS – Advanced Tools for NanoSafety Testing, Grant Agreement 760813 im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizont 2020 finanziert.

1. Beschreibung des LEVITATT-Setups
<ol><li>Verwenden Sie 20 ml Szintillationsglasfläschchen(Abbildung 1, Einsatz 1), die ein Lichtdurchdringung ermöglichen. Alternativ können auch leichte durchlässige Kunststofffläschchen verwendet werden. Quantifizieren Sie die Lichtintensität mit einem Photometer.</li>
	<li>Verwenden Sie mindestens eine 4 ml-Testsuspension zu Beginn des Tests, um die Quantifizierung von Biomasse und die Charakterisierung/Quantifizierung von Nanomaterialien während und nach der Inkubation zu ermöglichen(Abbildung 1, Einsatz 2).</li>
	<li>Passen Sie die 20 ml Szintillationsfläschchen mit einer Kappe an(Abbildung 1, Einsatz 3), bei der ein kleines Loch (ca. 1 mm Durchmesser) gebohrt wird, um einenCO2-Austausch mit der Atmosphäre zu ermöglichen. Dieser Austausch ist entscheidend, um einen stabilen pH- undCO2-Gehalt während der Tests zu gewährleisten.</li>
	<li>Verwenden Sie für flüchtige Stoffe eine luftdichte Teflon-beschichtete Kappe, um eineCO2-Anreicherung des Kopfraums mit einer Spritze9 oder vollständig geschlossenen Kolben ohne Gasphase zu ermöglichen, in derCO2 in Lösung durch ein angereichertes Natriumbicarbonat (NaHCO3) Puffersystem10gehalten wird.</li>
	<li>Befestigen Sie die Durchstechflaschen mit Klemmen, die am Außengehäuse montiert sind(Abbildung 1, Einsatz 4).</li>
	<li>Verwenden Sie eine LED-Lichtquelle unterhalb der Testfläschchen(Abbildung 1, Einsatz 5), die eine gleichmäßige fluoreszierende Beleuchtung vom Typ "kühl-weiß" oder "Tageslicht" und eine Lichtintensität im Bereich von 60–120 'E'm-s-1 im photosynthetisch wirksamen Wellenlängenbereich von 400 nm bis 700 nm misst. Das Setup verwendet eine einstellbare Lichtintensität im Bereich von 5–160 'E'm-2's-1, indem ein Lichtdimmer an die Quelle anpasst. Dies ermöglicht Tests bei höheren und niedrigeren Lichtintensitäten.</li>
	<li>Montieren Sie das Setup auf einem Orbital-Shaker, um Proben während der gesamten Testdauer zu agitieren. Dies hält die Zellen in freier Suspension und erleichtert dieCO2-Massenübertragung von Luft zu Wasser(Abbildung 1, Einsatz 6).</li>
	<li>Platzieren Sie das Setup in einem temperaturgeregelten Raum oder einem Thermostatschrank, um während der gesamten Prüfung stabile Temperaturen zu erhalten(Abbildung 1, Einsatz 7).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61209/61209fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Bild der LED-Vertikalbeleuchtungstabelle für Algentoxizitätstests (LEVITATT). 1) 20 ml Glasszintillationsfläschchen zur Inkubation, 2) 4 ml Probe zur2 Analyse, 3) Deckel mit Bohrloch für CO 2-Austausch, 4) Gehäuse für definierte Lichtverhältnisse, 5) LED-Lichtquelle in der Mitte des Gehäuses, 6) Orbitalschüttler zur Erregung während des Experiments und 7) ein thermostatischer Schrank. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61209/61209fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
2. Vorbereitung des Algenwachstums medium
<ol><li>Das Algenwachstumsmedium ISO 8692 besteht aus vier verschiedenen Bestandslösungen. Die entsprechende Salzmenge abwiegen und in Reinstwasser nach Tabelle 1verdünnen.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Aktienlösungen</td>
			<td>Nährstoff</td>
			<td>Konzentration in Lagerlösung</td>
			<td>Konzentration in Dertestlösung</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">1: Makronährstoffe</td>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>1,5 g/L</td>
			<td>15 mg/L (N: 3,9 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl26H2O</td>
			<td>1,2 g/L</td>
			<td>12 mg/L (Mg: 2,9 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2x 2H2O</td>
			<td>1,8 g/L</td>
			<td>18 mg/L (Ca: 4,9 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4bei 7H2O</td>
			<td>1,5 g/L</td>
			<td>15 mg/L (S: 1,95 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>0,16 g/L</td>
			<td>1,6 mg/L (P: 0,36 mg/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">2: Fe-EDTA</td>
			<td>FeCl3x 6H2O</td>
			<td>64 mg/L</td>
			<td>64 g/L (Fe: 13 g/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2EDTA-2H2O</td>
			<td>100 mg/L</td>
			<td>100 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">3: Spurenelemente</td>
			<td>H3BO3a
</td>
			<td>185 mg/L</td>
			<td>185 g/L (B: 32 g/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MnCl2x 4H2O</td>
			<td>415 mg/L</td>
			<td>415 g/L (Mn: 115 g/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZnCl2
</td>
			<td>3 mg/L</td>
			<td>3 g/L (Zn: 1,4 g/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CoCl2x 6H2O</td>
			<td>1,5 mg/L</td>
			<td>1,5 g/l (Co: 0,37 g/l)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CuCl2x 2H2O</td>
			<td>0,01 mg/L</td>
			<td>0,01 g/l (Cu: 3,7 ng/L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2MoO4x 2H2O</td>
			<td>7 mg/L</td>
			<td>7 g/L (Mo: 2,8 g/l)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4: NaHCO3</td>
			<td>NaHCO3
</td>
			<td>50 g/L</td>
			<td>50 mg/L (C: 7,14 mg/L)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Konzentrationen von Nährstoffen in Stammlösungen für Algenwachstumsmedium
HINWEIS: H3BO3 kann durch Hinzufügen von 0,1 M NaOH aufgelöst werden. EDTA sollte bei der Prüfung von Metallen entfernt werden, um eine Komplexierung mit Metallionen zu vermeiden. Sterilisieren Sie die Lagerlösungen durch Membranfiltration (mittlerer Porendurchmesser 0,2 m) oder durch Autoklavieren (120 °C, 15 min). Keine Autoklaven-Lagerlösungen 2 und 4, sondern sterilisieren Sie sie durch Membranfiltration. Bewahren Sie die Lösungen im Dunkeln bei 4 °C auf.
<ol start="2"><li>Um 1 L Algenwachstumsmedium zu produzieren, 500 ml sterilisiertes Reinstwasser in einen 1 L sterilisierten Volumenkolben zu übertragen und 10 ml Stammlösung 1: Makronährstoffe, 1 ml Stammlösung 2: Fe-EDTA, 1 ml Stammlösung 3: Spurenelemente und 1 ml Stammlösung 4: NaHCO3hinzuzufügen.</li>
	<li>Bis zu 1 L mit sterilisiertem Reinstwasser füllen, den Kolben stoppen und gründlich schütteln, um das Algenwachstumsmedium zu homogenisieren.</li>
	<li>Gleichgewichten Sie die Lösung vor der Anwendung, indem Sie sie über Nacht in Kontakt mit Luft lassen oder indem Sie mit steriler, gefilterter Luft 30 min sprudeln. Nach dem Ausgleich den pH-Wert ggf. auf pH 8,1 ± 0,2 einstellen, entweder mit 1 M HCl oder 1 M NaOH.</li>
</ol>3. Einrichten des Algentests
HINWEIS: Ein Flussdiagramm des Algentestverfahrens ist in Abbildung 2dargestellt.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61209/61209fig2v6.jpg"> Abbildung 2: Flussdiagramm des Algentestaufbaus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61209/61209fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol><li>Bereiten Sie eine Lagerlösung der Testverbindung bei der gewünschten höchsten Testkonzentration im Algenwachstumsmedium vor, die gemäß Schritt 2 vorbereitet wird. Zur Herstellung von Stofflösungen/Suspensionen folgen Sie DER OECD 201 (für lösliche Verbindungen) oder DER OECD 318 (für Nanomaterialien).</li>
	<li>Messen Sie den pH-Wert in der Lagerlösung. Weicht er mehr als eine Einheit vom Algenwachstumsmedium ab, stellen Sie den pH-Wert auf 8 mit entweder 1 M HCl oder 1 M NaOH ein.</li>
	<li>Berechnen Sie das Inokulumvolumen, das erforderlich ist, um eine endgültige Zellkonzentration von 1 x 104 Zellen/ml in einer 25 ml Testlösung zu erreichen. HINWEIS: Das Inokulum sollte aus einer Kultur der nicht kontaminierten exponentiell wachsenden Raphidocelis subcapitata stammen, die mit dem LEVITATT-Setup angebaut wird.</li>
	<li>Berechnen Sie die Menge der Lagerlösung, die jedem 25 ml Volumetkolben hinzugefügt werden soll, um die gewünschten Testkonzentrationen zu erhalten. Der Faktor zwischen jeder Konzentration sollte 3,2 nicht überschreiten.</li>
	<li>Markieren Sie einen 25 ml Volumetrischen Kolben für jede gewählte Konzentration und eine zusätzliche 25 ml volumetrische Kolben markierte Kontrolle.</li>
	<li>Fügen Sie die Menge der Stammlösung der Testverbindung hinzu, die benötigt wird, um die gewünschten Konzentrationen zu erreichen, zum 25 ml Volumetrischen Kolben. Fügen Sie dem Steuerelement keine Lagerlösung hinzu.</li>
	<li>Fügen Sie das Medium zu jedem 25 ml volumetrischen Kolben hinzu, um ein Volumen von ca. 20 ml zu erreichen.</li>
	<li>Fügen Sie das in Schritt 3.3 berechnete Inokulumvolumen zu jedem 25 ml volumetrischen Kolben hinzu. Fügen Sie das Medium zu jedem 25 ml volumetrischen Kolben zu einem Endvolumen von 25 ml hinzu.</li>
	<li>Stoppen Sie die Kolben und mischen Sie gründlich, indem Sie die Kolben zwei Mal vertikal drehen.</li>
	<li>0,4 ml von jedem Kolben in einzelne Schraubkappenfläschchen geben und 1,6 ml Aceton (gesättigt mit MgCO3)hinzufügen: eine Probe für jede Prüfkonzentration und die Kontrolle. Schließen Sie die Deckel fest und lagern Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur bis zu Fluoreszenzmessungen (Abschnitt 4).</li>
	<li>Pipetten Sie 4 ml jeder Testlösung in 20 ml Szintillationsfläschchen (3 Replikationen pro Konzentration und 5 Replikationen für die Kontrolle). Schraubendeckel auf den Szintillationsfläschchen. Denken Sie daran, dass die Deckel ein Gebohrloch (ca. 1 mm Durchmesser) haben müssen, um einenCO2-Austausch zu ermöglichen.</li>
	<li>Nach 24 h, 48 h und 72 h, Pipetten 0,4 ml von jeder Durchstechflasche in Schraubkappenfläschchen und 1,6 ml Aceton hinzufügen (gesättigt mit MgCO3). Schließen Sie die Deckel fest und lagern Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur bis zu Fluoreszenzmessungen (Abschnitt 4).</li>
	<li>Nachdem die letzte Probe bei 72 h entnommen wurde, die drei Replikationen für eine bestimmte Konzentration vorsichtig in einer Durchstechflasche bündeln und den pH-Wert messen. Wiederholen Sie dies für alle Konzentrationen und die Steuerung. Der pH-Wert sollte für eine der gemessenen Proben nicht mehr als 1,5 Einheiten vom ursprünglichen pH-Wert abweichen.</li>
	<li>Entleeren Sie die restlichen Flüssigkeiten gemäß Ihren institutionellen Regeln und Vorschriften in einen Abfallbehälter.</li>
</ol>4. Analyse von Algenproben
<ol><li>Verwenden Sie ein Fluoreszenzspektrophotometer, um die Algenbiomasse zu messen (hier ausgedrückt als Chlorophyll A). Die Spitzenemission für Chlorophyll A beträgt 420 nm für die Anregungswellenlänge und 671 nm für die Emissionswellenlänge.</li>
	<li>Messen Sie die Fluoreszenz jeder einzelnen Probe dreimal und berechnen Sie den Durchschnittswert für jede Probe.</li>
	<li>Verwenden Sie Gleichung 1, um die Wachstumsrate zu berechnen. Die gemessene Fluoreszenz (relative Einheiten) kann direkt als Biomasseparameter in Gleichung 1 verwendet werden. Gleichung 1: μ = (ln Nt – ln N0) / t wobei μ die Wachstumsrate (d-1), N0 die ursprüngliche Biomasse ist, Nt die Biomasse zum Zeitpunkt t und t die Länge des Testzeitraums (d). Hinweis: N0 und Nt sollten in derselben Einheit ausgedrückt werden.</li>
	<li>Verwenden Sie eine statistische Software, um eine nichtlineare Regressionskurve (z. B. eine Log-Logistik- oder Weibull-Funktion) an die Wachstumsratendaten anzupassen, um effektive Konzentrationswerte bei 10 %, 20 % und 50 % Hemmung zu erhalten. In den Zusatzinformationen ist ein Beispiel für Code für die Anpassung an die statistische Software R mit dem DRK-Paket11 gegeben.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Phytoplankton wandelt Sonnenenergie und Kohlendioxid in organische Materie um und spielt damit eine zentrale Rolle im aquatischen Ökosystem. Aus diesem Grund werden Algenwachstumshemmungstests als einer von drei obligatorischen aquatischen Toxizitätstests aufgenommen, die für die regulatorische Risikobewertung von Chemikalien erforderlich sind. Die Fähigkeit, einen zuverlässigen und reproduzierbaren Algentoxizitätstest durchzuführen, ist in dieser Hinsicht von entscheidender Bedeutung. Test-Setups mit Erlenmeyer-Kolben f...

Der Algentoxizitätstest ist einer von nur drei obligatorischen Tests, die zur Generierung der Ökotoxizitätsdaten verwendet werden, die für die Registrierung von Chemikalien vor und nach dem Inverkehrbringen durch europäische und internationale Vorschriften (z. B. REACH1 und TSCA (USA)) erforderlich sind. Zu diesem Zweck wurden standardisierte Algentestrichtlinien von internationalen Organisationen (z.B. ISO und OECD) entwickelt. Diese Prüfnormen und -richtlinien schreiben ideale Prüfbedingungen in Bezug auf pH, Temperatur, Kohlendioxidgehalt und Lichtintensität vor. Die Aufrechterhaltung stabiler Testbedingungen während der Algenprüfung ist jedoch in der Praxis schwierig, und die Ergebnisse leiden unter Problemen mit der Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit einer Reihe chemischer Substanzen und Nanomaterialien (häufig als "schwierige Stoffe" bezeichnet)2. Die meisten der vorhandenen Algentoxizitätstests arbeiten mit relativ großen Volumina (100–250 ml) auf einem Orbital-Shaker in einem Inkubator. Ein solches Setup begrenzt die Anzahl der Testkonzentrationen und repliziert erreichbare und hohe Mengen an Algenkultur und Testmaterial. Darüber hinaus haben diese Setups selten ein einheitliches Lichtfeld und zuverlässige Lichtverhältnisse sind zudem in großen Kolben schwer zu bekommen, teils, da die Lichtintensität exponentiell abnimmt, je weiter sich das Licht bewegt, und teils aufgrund der Kolbengeometrie. Alternative Aufbauten umfassen Kunststoff-Mikrotiter-3-Platten mit kleinen Probenvolumina, die keine ausreichenden Probenahmemengen zur PH-Messung, zusätzliche Biomassemessungen, Pigmentextraktion oder andere Analysen, die eine destruktive Probenahme erfordern, zulassen.3 Eine besondere Herausforderung bei der Verwendung bestehender Setups für Algentoxizitätstests von Nanomaterialien und Substanzen, die farbige Suspensionen bilden, ist die Interferenz oder Blockierung des Lichts, das den Algenzellen zur Verfügung steht, oft als "Schattierung"4,5bezeichnet. Schattierungen können innerhalb von Durchstechflaschen durch das Testmaterial und/oder Wechselwirkungen zwischen dem Testmaterial und den Algenzellen auftreten, oder Schattierungen zwischen Durchstechflaschen können aufgrund ihrer Positionierung relativ zueinander und der Lichtquelle auftreten.
Die Methode basiert auf dem von Arensberg et al.6 eingeführten Testaufbau für die Kleinalgentoxizität, der Tests in Übereinstimmung mit Normen wie OECD 2017und ISO 86928ermöglicht. Das Verfahren wird weiter optimiert, um die oben genannten Einschränkungen zu beheben: 1) Einsatz der LED-Lichttechnologie, um einheitliche Lichtverhältnisse bei minimaler Wärmeerzeugung zu gewährleisten, 2) bereitstellung eines ausreichenden Probenvolumens für die chemische/biologische Analyse unter Beibehaltung konstanter pH-,CO2-Werte und 3) ermöglicht den Einsatz von vielseitigem Testbehältermaterial zur Prüfung flüchtiger Stoffe oder Substanzen mit hohem Sorptionspotenzial.

<table><tbody><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V179124</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254134</td><td></td></tr><tr><td>BlueCap Flaschen (1L)</td><td>Buch & Deutschland Holm A/S</td><td>&nbsp; </td><td></td>9072335</tr><tr><td>Borsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0394</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208290</td><td></td></tr><tr><td>Klare Acrylplatte (40x40 cm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kobalt(II)-chlorid-Hexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255599</td><td></td></tr><tr><td>Kupfer(II)-chlorid-Dihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>307483</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalzdihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; E5134</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Spektrophotometer F-7000</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Eisen(III)-chlorid-Hexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236489 LED-Lichtquelle</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Helmholt Elektronik A/S</td><td>H35161</td><td>Neutralweiß, 6500K</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Mangan(II)-chlorid-Tetrahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>Orbitalschüttler</td><td>IKA</td><td>2980200</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Raphidocelis subcapitata</td><td>NORCCA</td><td></td><td>NIVA-CHL1 </td></tr><tr><td>Stamm-Szintillationsfläschchen (20 mL)</td><td>Fisherscientific</td><td>11526325</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td></td></tr><tr><td>Natriummolybdat-Dihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>331058&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Federklemme</td><td>Frederiksen Scientific A/S</td><td>472002</td><td></td></tr><tr><td>Thermostatschrank</td><td>VWR</td><td>WTWA208450</td><td>Alternative: klimatisierter Raum</td></tr><tr><td>Lüftungsrohr (&Oslash; 125 mm)</td><td>Silvan</td><td>22605630165</td><td></td></tr><tr><td>Messkolben (25 mL)</td><td>DWK Life Sciences</td><td>246781455</td><td></td></tr><tr><td>Zinkchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr></tbody></table>

ein kleines setup für algentoxizitätstests von nanomaterialien und anderen schwierigen stoffen

A Small-Scale Setup for Algal Toxicity Testing of Nanomaterials and Other Difficult Substances

Ökotoxizitätsdaten sind eine Voraussetzung für die Registrierung von Chemikalien vor und nach dem Inverkehrbringen durch europäische und internationale Vorschriften (z. B. REACH). Der Algentoxizitätstest wird häufig bei der regulatorischen Risikobewertung von Chemikalien verwendet. Um eine hohe Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit zu erreichen, ist die Entwicklung standardisierter Richtlinien unerlässlich. Für Algentoxizitätstests erfordern die Richtlinien stabile und einheitliche Bedingungen für Parameter wie pH, Temperatur, Kohlendioxidgehalt und Lichtintensität. Nanomaterialien und andere so genannte schwierige Stoffe können das Licht stören und eine große Streuung der erzielten Ergebnisse zur Behinderung ihrer regulatorischen Akzeptanz verursachen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests) entwickelt. Das Setup nutzt led-Beleuchtung von unten, was eine homogene Lichtverteilung und Temperaturregelung ermöglicht und gleichzeitig die Beschattung der Proben minimiert. Das Setup optimiert das Probenvolumen für die Biomassequantifizierung und sorgt2 gleichzeitig für einen ausreichenden CO2-Zustrom, um das exponentielle Wachstum der Algen zu unterstützen. Darüber hinaus kann das Material der Testbehälter so angepasst werden, dass Adsorption und Verflüchtigung minimiert werden. Bei der Prüfung von farbigen Substanzen oder Partikelsuspensionen ermöglicht der Einsatz von LED-Leuchten auch eine Erhöhung der Lichtintensität ohne zusätzliche Wärmeerzeugung. Die kompakte Bauweise und minimale Ausstattungsanforderungen erhöhen die Möglichkeiten zur Implementierung des LEVITATT in einer Vielzahl von Laboren. WÄHREND LEVITATT den standardisierten ISO- und OECD-Richtlinien für Algentoxizitätstests entspricht, zeigte es eine geringere Variabilität zwischen Proben für zwei Referenzsubstanzen (3,5-Dicholorophenol und K2Cr2O7) und drei Nanomaterialien (ZnO, CeO2und BaSO4) im Vergleich zu Erlenmeyerkolben und Mikrotiterplatten.

Ein erster Test mit einer Referenzsubstanz wird durchgeführt, um die Empfindlichkeit des Algenstamms zu bestimmen. Referenzsubstanzen, die regelmäßig für R. subcapitata verwendet werden, sind Kaliumdichromat und 3,5-Dichlorphenol7,8. Abbildung 3 und Tabelle 2 zeigen ein repräsentatives Ergebnis eines Algentests einschließlich Kurvenanpassung und statistischer Ergebnisse, wenn das DRK-Paket in R auf die Wachs...

Wir zeigen Algentoxizitätstests für schwierige Stoffe (z.B. farbige Substanzen oder Nanomaterialien) anhand eines vertikal mit einer LED beleuchteten Setups.

Ein kleines Setup für Algentoxizitätstests von Nanomaterialien und anderen schwierigen Stoffen

Ecotoxicity data is a requirement for pre- and post-market registration of chemicals by European and international regulations (e.g., REACH). The algal ...

Wenn ein Chemieunternehmen eine neue Chemikalie oder ein anderes Material auf den Markt bringen will, muss es Daten aus einer Reihe von Ökotoxizitätstests liefern. Der Algentest ist einer der drei obligatorischen Tests, die durchgeführt werden müssen. Der Algentest leidet unter der Tatsache, dass es ziemlich schwierig ist, durchzuführen.Aus diesem Grund haben wir die LEVITATT-Testplattform entwickelt. Der LEVITATT verwendet LED-Licht, um Probleme bei übermäßiger Wärmeerzeugung zu vermeiden. Darüber hinaus sorgt es für ein gleichmäßiges Lichtfeld.Es hat eine kompakte Größe, was bedeutet, dass Sie nicht viel Platz benötigen, um den Algentest durchzuführen, aber gleichzeitig ermöglicht es die Verwendung von genügend Probenvolumen, um chemische Analysen und Charakterisierungen vor, während und nach dem Testen durchzuführen. Dies ist besonders wichtig, wenn Sie Nanomaterialien testen. Dieses Video zeigt die Verwendung von LEVITATT für Algentoxizitätstests von Nanomaterialien und anderen schwierigen Substanzen.Die Demonstration besteht aus den folgenden vier Schritten. Beschreiben Sie zunächst die Komponenten des LEVITATT. Der zweite Schritt besteht darin, die Lösung für Algenwachstumsmedien vorzubereiten.Und der dritte Schritt besteht darin, einen Überblick über das Verfahren zu geben, wie ein Algentoxizitätstest durchgeführt werden kann. Der letzte Schritt besteht darin, den Anstieg der Algenbiomasse per Fluorometer zu messen. Der LEVITATT kann im temperaturgeregelten Raumschrank platziert werden.Dies ermöglicht eine stabile Temperatur während der gesamten Belichtung. Das Setup wird auf einem Orbital-Shaker platziert, um die Rotation der Proben während des Tests zu ermöglichen. Der Test wird in 20-Milliliter-Szintillationsfläschchen mit vier Milliliter Nein-Medium durchgeführt.Ein Schraubverschluss mit bohrendem Loch ermöglicht den CO2-Austausch mit Luft während der Belichtung. Die LED-Quelle befindet sich zwischen zwei Kunststoffplatten und befindet sich in der Mitte jedes Gehäuses. Die Platzierung erzeugt ein homogenes Lichtfeld und minimiert die Schattierung zwischen den Proben.Jedes Gehäuse ist mit Klemmen montiert und kann bis zu fünf Proben aufnehmen. Die kompakte Größe minimiert den Fürden erforderlichen Speicherplatz für das Experiment. Um die Lagerlösungen vorzubereiten, wägen Sie die entsprechende Menge jeder Verbindung ab.Die Stammlösung besteht aus verschiedenen Salzen, die für das Wachstum der Algen lebenswichtig sind. Wenn die entsprechende Menge salzig abgewogen wurde, werden sie mit reinem reinem Wasser verdünnt. Die Lagerlösungen werden entweder durch Filtrieren oder Autoklavieren sterilisiert.Nach der Sterilisation können die Lagerlösungen bei vier Grad Celsius im Dunkeln gelagert werden. Bereiten Sie eine Reihe von Expositionskonzentrationen vor. Der Faktor zwischen den Expositionskonzentrationen sollte 3,2 nicht überschreiten.Jedem Test wird das entsprechende Volumen exponentiell wachsender Algen zugesetzt. Die endgültige Zelldichte sollte etwa 10.000 Algenzellen pro Milliliter betragen. Es ist entscheidend, dass die Vorkultur exponentiell wächst, um die Gültigkeitskriterien des Tests zu erfüllen.Die Messfläschchen werden gemischt, um eine homogene Verteilung von Algen und Verbindungen vor der Probenahme zu ermöglichen. Die Proben werden in Becher gegossen, und vier Milliliter werden in 20-Milliliter-Szintillationsfläschchen pipettiert. Die Szintillationsfläschchen sind nun gedeckelt.Pipette 0,4 Milliliter aus jeder Konzentration. 1,6 Milliliter Aceton hinzufügen, um die Zellwand zu stören und das Chlorophyll in die flüssige Phase freizusetzen. Jede Glasdurchstechflasche ist nun dicht, um eine Verdunstung von Aceton während der Lagerung zu vermeiden.Die gedeckelten Szintillationsfläschchen werden nun zufällig im LEVITATT verteilt und 72 Stunden lang inkubiert. Messen Sie die Lichtintensität und die Temperatur zu Beginn und am Ende der Inkubation, um die Einhaltung der gewünschten Richtlinien zu gewährleisten. Die Unterprobe erfolgt im 24-Stunden-Intervall, indem 0,4 Milliliter von jeder Szintillationsfläschchen in Glasfläschchen geleitet werden.Fügen Sie 1,6 Millionen Aceton hinzu, um die Zellwand zu stören und das Chlorophyll in die flüssige Phase freizusetzen. Nachdem Aceton zugegeben wurde, schrauben Sie die Deckel fest auf und lassen Sie die Proben bis zur Analyse im Dunkeln. Verwenden Sie ein Fluorometer, um die Biomasse in der während des Testzeitraums erworbenen Probe zu quantifizieren.Die Einstellungen auf dem Fluorometer sollten 420 Nanometer als Anregungswellenlänge und eine Emissionswellenlänge von 671 Nanometern betragen. Jede einzelne Probe wird dreimal gemessen, und die relativen Werte werden notiert. Die relativen Werte des Fluorometers werden zur Berechnung der Wachstumsrate verwendet, die für die weitere Datenbehandlung verwendet wird.Verwenden Sie eine statistische Software, um eine nichtlineare Regressionskurve an die berechneten Wachstumsratendaten anzupassen. Ein Beispiel für eine nichtlineare Regressionskurve könnte eine Loglogistik der lebensfähigen Funktion sein. Das zugeordnete 95%-Konfidenzintervall wird neben der Modellanpassung angezeigt.Regelmäßig wirksame Konzentrationswerte wie 10, 20 und 50% ineffizient werden verwendet, um das Ergebnis eines Ökotoxizitätstests zu melden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das LEVITATT eine kompakte Plattform für Dieontoxizitätsprüfungen regelmäßiger Chemikalien bietet, die internationalen standardisierten Richtlinien entsprechen. Darüber hinaus bietet das Setup eine robuste Plattform für die Prüfung schwieriger Substanzen, die den Durchgang von Licht in Richtung Desal, wie Nanomaterialien oder farbige Substanzen stören.

a-small-scale-setup-for-algal-toxicity-testing-nanomaterials-other

Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

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