Name: Messung des Zusammenflusses von iPSCs mit einem automatisierten Bildgebungssystem. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Erfahren Sie die Bewertung von iPSC-Konfluenz auf verschiedenen ECM-Beschichtungen mittels automatisiertem Bildgebungssystem. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Analyse ohne Einzelzellzählung und verbessert die Stammzellkultur für regenerative Medizin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Studie wurde durch Zuschüsse der Fondazione Bambino Gesù und Ricerca Corrente (italienisches Gesundheitsministerium) an C.C.  Wir danken Dr. Enrico Bertini (Abteilung für Neurowissenschaften, Abteilung für neuromuskuläre und neurodegenerative Erkrankungen, Labor für Molekulare Medizin, Kinderforschungskrankenhaus Bambino Gesù), Dr. Stefania Petrini (Kerneinrichtung für Konfokale Mikroskopie, Forschungslabors, Kinderforschungskrankenhaus Bambino Gesù), Giulia Pericoli (Abteilung für Onkohämatologie, Gen- und Zelltherapie, Kinderforschungskrankenhaus Bambino Gesù) und Roberta Ferretti (Abteilung für Onkohämatologie, Gen- und Zelltherapie, Kinderforschungsklinik Bambino Gesù) für wissenschaftliche Diskussionen und technische Hilfe. Maria Vinci ist Empfängerin eines "Children with Cancer UK Fellowship".

1. Beschichtung von 96 Well-Platten
HINWEIS: Verschiedene Beschichtungen wurden in derselben Platte, aber separaten Vertiefungen getestet (siehe Zusatzdatei).
<ol><li>Verdünnen Sie das Matrigel 1:100 in DMEM. 100 μL pro Vertiefung in die 96 Wellplatten geben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie anschließend die Lösung und waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit 100 μL DMEM.</li>
	<li>Verdünnen Sie Laminin (20 μg/ml, LN-521) in PBS (mit Calcium und Magnesium). 100 μL in die Vertiefung geben und bei 4 °C über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag führen Sie zwei Wäschen mit DMEM durch, bevor Sie die Zellen säen.</li>
	<li>Verdünntes Invitronektin (10 μg/ml) in Verdünnungspuffer. 100 μL pro Vertiefung in die 96-Well-Platte geben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Vertiefungen mit PBS (ohne Kalzium und Magnesium), bevor Sie die Zellen plattieren.</li>
	<li>HU-Fibronektin (30 μg/ml) inddH2Overdünnen. 100 μL in die Vertiefungen geben und 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend waschen Sie die Vertiefungen mit dem Medium, bevor Sie die Zellen säen.</li>
</ol>2. Aufrechterhaltung von iPSC in Kultur
HINWEIS: iPSCs wurden kommerziell erworben. Die iPS-Zellen wurden aus gesunden menschlichen Fibroblasten gewonnen und mittels episomaler Technologie umprogrammiert.
<ol><li>Aus dem -80 °C Gefrierschrank oder flüssigem Stickstoff die kryokonservierten iPSCs in einem 37 °C warmen Wasserbad auftauen. Reinigen Sie die Durchstechflasche mit den Zellen mit 70% Ethanol, bevor Sie sie in die biologische Sicherheitswerkbank bringen.</li>
	<li>Geben Sie die Zellsuspension in 5 mL vorgewärmtes Zellkulturmedium (z. B. mTeSR1) Tropfen für Tropfen mit einer 1000 μL Pipette in einem 15 ml sterilen konischen Röhrchen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 304 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium und resuspendieren Sie das Zellpellet in 4 ml Zellkulturmedium.</li>
	<li>Die Zellsuspension wird in zwei Vertiefungen der 6 Wellplatten (105 iPSCs pro 6-Well-Zellkulturschale) gegeben, wo die embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus zuvor plattiert wurden. Seed MEFs zwei Tage vor der Beschichtung von iPSCs mit einer Dichte von 2,4 x 104/cm2 in DMEM (enthält 10% Fetal Bovine Serum, 1% L-Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin).</li>
	<li>Nach der Aussaat ergänzen Sie die Zellmedien mit 10 μM ROCK-Inhibitor Y-27632.</li>
	<li>Züchten Sie die iPSCs auf MEFs für die ersten 4-5 Wochen und dann in dosierfreiem Zustand (MEF-freier Zustand), wobei eine der interessierenden Beschichtungen (siehe Schritt 1 und Tabelle 1) in mTeSR1 verwendet wird.</li>
	<li>Wenn die iPSCs zu 70-80% konfluent sind, Durchgang 1:4 mit 0,5 mM EDTA-Behandlung für 3-5 min bei RT. Fügen Sie 1 ml 0,5 mM EDTA für eine 6-Well-Platte (oder proportionale Mengen für andere Arten von Platten) hinzu. Überführung in neue Bohrlöcher unter feederfreien Bedingungen und Inkubation bei 37 °C, 5% CO2, 20%O2.</li>
	<li>Wechseln Sie die Medien täglich mit frischem mTeSR1 und teilen Sie die Zellen alle 2 Tage.</li>
</ol>3. Charakterisierung der Zellkonfluenz
<ol><li>Verwenden Sie 96 Well-Platten für die Experimente.</li>
	<li>Aussaat von 10.000 Zellen pro Vertiefung nach mindestens 1 Monat Kultivierung in feederfreiem Zustand, um sicher zu sein, dass die MEFs nicht passiert wurden. Verwenden Sie Einweg-Zählobjektträger, um die Zellen mit dem Lichtmikroskop zu zählen.</li>
	<li>Führen Sie die Experimente in dreifacher Ausführung durch. Testen Sie daher jede Aussaatbedingung in drei Vertiefungen.</li>
	<li>Führen Sie eine automatisierte Bildaufnahme ab Tag 1 nach der Aussaat mit einem Zytometer im Hellfeldmodus durch. Führen Sie eine automatisierte Bildaufnahme alle 24 Stunden für 5 Tage durch. Ausführliche Informationen zu den experimentellen Parametern finden Sie in der Zusatzdatei.</li>
	<li>Verwenden Sie Autokontrast und Autobelichtung, um Zellen besser sichtbar zu machen.</li>
	<li>Legen Sie die Analyseeinstellung (siehe Zusatzdatei) für die Konfluenzanalyse so fest, dass eine Maske von 60%, 80% und 100% pro Vertiefung angewendet wird, um die Fokusänderungen aufgrund der Lichtbrechung am Rand der Vertiefungen zu bewerten. Verwenden Sie die oben erwähnte andere Maskenanalyseeinstellung, um den Zellzusammenfluss zu jedem Zeitpunkt zu analysieren.</li>
</ol>4. Statistische Analysen
<ol><li>Geben Sie quantitative Ergebnisse als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) an.</li>
	<li>Um die Gesamtunterschiede der verschiedenen Beschichtungsbedingungen zu vergleichen, erhalten Sie Daten mit denselben Proben und führen Sie den Paired-Sample-t-Test des Studenten durch. P-Werte kleiner als 0,05 gelten als statistisch signifikant, und alle gemeldeten p-Werte sind zweiseitig.</li>
</ol>5. Charakterisierung der Mikrofilamente des Zytoskeletts
<ol><li>Fixieren Sie Zellen mit 4% Paraformaldehyd (4% PFA) in PBS für 10 min bei RT, gefolgt von zwei Wäschen in PBS (10 min insgesamt).</li>
	<li>100 μL Blockierlösung (bestehend aus 5% BSA, 0,1% Triton in PBS) für 1 h RT in jede Vertiefung geben.</li>
	<li>Entfernen Sie die Blockierlösung und waschen Sie die Proben zweimal mit PBS für 10 min.</li>
	<li>100 μL der Phalloidin-konjugierten Arbeitslösung pro Probe zugeben und 1 h bei RT inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS (10 min bei RT).</li>
	<li>Färbekerne mit Hoechst 33342 verdünnt 1:10000 in PBS für 10 min bei RT.</li>
	<li>Entfernen Sie die Hoechst-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS für jeweils 10 Minuten.</li>
	<li>Die Probe mitH2Owaschen und unter einer chemischen Haube trocknen lassen.</li>
	<li>Fügen Sie 100 μL Montagemedien (z. B. PBS: Glycerin, 1: 1) hinzu, um die Zellen abzudecken und die Fluoreszenz der Proben zu erhalten.</li>
	<li>Beobachten Sie die Zelle bei Ex/Em 493/517 nm auf einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop, das mit einer Weißlichtlaserquelle (WLL) und einem 405-nm-Diodenlaser ausgestattet ist. Nehmen Sie sequenzielle konfokale Bilder mit einem HC PLAPO 40x Ölimmersionsobjektiv auf. Verwenden Sie die gleiche Laserleistung, Strahlteiler, Filtereinstellungen, Pinhole-Durchmesser und Scan-Modus für alle untersuchten Proben.</li>
</ol>

<ol><li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aged+iPSCs+display+an+uncommon+mitochondrial+appearance+and+fail+to+undergo+in+vitro+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis.</a> Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Kleinman, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+type+IV+procollagen%2C+laminin%2C+and+heparan+sulfate+proteoglycan+from+the+EHS+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma.</a> Biochemistry. 21 (24), 6188-6193 (1982).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521%2FE-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nature Communications. 5, 3195(2014).</li>
<li>Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+culturing+and+cloning+of+human+pluripotent+stem+cells+on+laminin-521+based+matrices+under+xeno-free+and+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).</li>
<li>Laperle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-5+Laminin+Synthesized+by+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Promotes+Self-Renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal.</a> Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).</li>
<li>Albalushi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+521+stabilizes+the+pluripotency+expression+pattern+of+human+embryonic+stem+cells+initially+derived+on+feeder+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells.</a> Stem Cell International. 2018, 7127042(2018).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-derived+laminin-511+promotes+midbrain+dopaminergic+neuron+survival+and+differentiation+through+YAP%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP.</a> Science Signaling. 10 (493), (2017).</li>
<li>Lu, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+xeno-free+and+feeder-free+culture+system+for+the+derivation%2C+expansion+and+direct+differentiation+of+transgene-free+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).</li>
<li>Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+slow+cooling+cryopreservation+for+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells.</a> Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).</li>
<li>Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-free+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Xeno-free culture of human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).</li>
<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+vitronectin+is+a+functionally+defined+substrate+that+supports+human+embryonic+stem+cell+self-renewal+via+alphavbeta5+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin.</a> Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+vitronectin+concentration+and+surface+properties+on+the+stable+propagation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells.</a> Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).</li>
<li>Prowse, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells+on+recombinant+vitronectin+in+ascorbate+free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media.</a> Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).</li>
<li>Rowland, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+integrins+in+human+induced+pluripotent+stem+cell+growth+on+Matrigel+and+vitronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin.</a> Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).</li>
<li>Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+studies+on+amniotic+fluid+and+plasma+fibronectins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins.</a> Biochemistry. 193 (1), 295-299 (1981).</li>
<li>Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+activation+by+dithiothreitol+or+Mn2%2B+induces+a+ligand-occupied+conformation+and+exposure+of+a+novel+NH2-terminal+regulatory+site+on+the+beta1+integrin+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain.</a> Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).</li>
<li>Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+wound+healing+assay+in+an+epithelial-mesenchymal+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+%26+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system.</a> Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).</li>
<li>Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder+layer-and+serum-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells.</a> Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).</li>
<li>Vaheri, A., Mosher, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+molecular+weight%2C+cell+surface-associated+glyco-protein+%28fibronectin%29+lost+in+malignant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).</li>
<li>Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+fibrillogenesis%2C+a+cell-mediated+matrix+assembly+process%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process.</a> Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).</li>
<li>Polyak, K., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states%3A+acquisition+of+malignant+and+stem+cell+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).</li>
<li>Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fibrillogenesis%3A+fibronectin%2C+integrins%2C+and+minor+collagens+as+organizers+and+nucleators%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).</li>
<li>Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tightening+the+connections+between+cadherins+and+fibronectin+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix.</a> Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).</li>
<li>Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+The+evolution+of+human+pluripotent+stem+cell+culture%3A+from+feeder+cells+to+synthetic+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings.</a> Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Vigilante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+Extrinsic+versus+Intrinsic+Drivers+of+Variation+in+Cell+Behavior+in+Human+iPSC+Lines+from+Healthy+Donors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors.</a> Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Verwendung von iPS-Zellen für die Krankheitsmodellierung und das zukünftige Arzneimittelscreening zusammen mit ihrer möglichen Anwendung in der Präzisionsmedizin macht sie zu einer Technologie von großer Relevanz, und aus diesem Grund glauben wir, dass es notwendig ist, die In-vitro-Kultivierungsbedingungen klar zu verstehen, die der physiologischen Situation embryonaler Stammzellen besser ähneln. In diesem Zusammenhang haben wir verschiedene ECM-Beschichtungen mit Wildtyp-iPSCs getestet, um die Bedingungen zu verste...

Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) werden aus somatischen Zellen gewonnen und können in verschiedene Zelltypen differenziert werden. Sie werden oft als System zur Modellierung der Krankheitspathogenese oder zur Durchführung von Medikamentenscreenings eingesetzt und bieten auch das Potenzial, im Kontext der personalisierten Medizin eingesetzt zu werden. Da iPSCs ein großes Potenzial haben, ist es wichtig, sie für den Einsatz als zuverlässiges Modellsystem vollständig zu charakterisieren. Wir haben bereits gezeigt, wie wichtig es ist, iPS-Zellen in einer hypoxischen Umgebung zu züchten, da diese Zellen auf Glykolyse angewiesen sind und eine aerobe Umgebung ein Redoxungleichgewicht verursachen kann1. iPSCs sind auch anfällig für andere Kulturbedingungen, insbesondere die extrazelluläre Umgebung. Die Optimierung der Kulturbedingungen ist ein Schlüsselthema, um sie gesund zu halten und zu vermehren. Eine gesunde iPSC-Kultur führt zu gesunden, differenzierten Zellen, die im Allgemeinen der Endpunkt des Modells sind, das zum Verständnis molekularer, zellulärer und funktioneller Merkmale spezifischer menschlicher Störungen oder zellulärer Prozesse verwendet wird.
In dieser Studie wurde ein einfaches Protokoll verwendet, um den Zusammenfluss von iPSCs unter Verwendung verschiedener Beschichtungsbedingungen in separaten Vertiefungen zu testen. iPSCs benötigen eine Feederschicht von murinen embryonalen Fibroblasten (MEF), um richtig zu binden, aber die Koexistenz von iPSCs und MEF macht es schwierig, Analysen wie RNA- oder Proteinextraktion durchzuführen, da zwei Zellpopulationen vorhanden sind. Um die Feederschicht zu vermeiden, wurden verschiedene Proteine der extrazellulären Matrix (ECM) verwendet, um die natürliche Zellnische nachzubilden und eine feederfreie iPSC-Kultur zu haben. Insbesondere ist Matrigel ein lösliches Basalmembranpräparat, das aus dem Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)-Maussarkom extrahiert wird und mit extrazellulären Matrixproteinen (d. h. Laminin, Kollagen IV, Heparansulfat-Proteoglykanen, Entactin/Nidogen und Wachstumsfaktoren) angereichert ist2,3. Die anderen verwendeten Beschichtungsbedingungen sind stattdessen gereinigte Proteine mit bekannter Relevanz für den Aufbau der ECMs: Laminin-521 ist dafür bekannt, von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) in der inneren Zellmasse des Embryos sezerniert zu werden, und es ist eines der häufigsten Lamininine im Körper nach der Geburt 4,5,6,7,8,9, 10,11; vitronectin ist eine xenofreie Zellkulturmatrix, von der bekannt ist, dass sie das Wachstum und die Differenzierung von hPSC 12,13,14,15,16 unterstützt; Fibronektin ist ein ECM-Protein, das für die Entwicklung von Wirbeltieren und die Anheftung und Erhaltung embryonaler Stammzellen in einem pluripotenten Zustand wichtig ist 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Da unterschiedliche Beschichtungsbedingungen zur Verfügung stehen, vergleichen wir sie hinsichtlich ihrer Wirkung auf den Zusammenfluss von iPSCs.

<table><tbody><tr><td>Serologische Streifenpipetten mit 10 mL, Polystyrol, einzeln in Papier/Plastik verpackt, steril</td><td>Corning</td><td>4488</td><td>Werkzeug</td></tr><tr><td>15 mL konische Zentrifugenröhrchen aus hochklarem Polypropylen (PP)</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td>Tool</td></tr><tr><td>1x PBS (mit ca2+; Mg2+)</td><td>Thermofisher</td><td>14040133</td><td>Medium</td></tr><tr><td>1x PBS (ohne Ca2+; Mg2+)</td><td>Euroclone</td><td>ECB4004L</td><td>Medium</td></tr><tr><td>5 mL Stripette Serologische Pipetten, Polystyrol, einzeln in Papier/Plastik verpackt, steril</td><td>Corning</td><td>4487</td><td>Tool</td></tr><tr><td>Zellkultur-Mikroplatte, 96 WELL, PS, F-Bottom</td><td>Greiner Bio One</td><td>655090</td><td>Support</td></tr><tr><td>Zellkulturplatte, 6 Wells</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>Support</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium - High Glucose)</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td>Medium</td></tr><tr><td></td><td>EDTA Sigma</td><td>ED4SS-500g</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Epi Episomales iPSC Reprogrammierungskit</td><td>Invitrogen</td><td>A15960</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>FAST - READ 102</td><td>Biosigma</td><td>BVS100</td><td>Tool</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Merck</td><td>FC010</td><td>Beschichtung</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>H2O</td><td></td><td>MILLIQ</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Thermofisher</td><td>33342</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Laminin 521</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>77003</td><td>Beschichtung</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>LS25030081</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning Matrigel hESC-qualifizierte</td><td></td><td>Matrix-354277-Beschichtung</td></tr><tr><td>für embryonale Fibroblasten der Maus (MEF)</td><td>Life Technologies</td><td>A24903</td><td>Beschichtung</td></tr><tr><td>MTESR1 Medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85851</td><td>Medium</td></tr><tr><td>MTESR1 Supplement</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85852</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7180</td><td>Beschichtung</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td>Reagenz</td></tr></tbody></table>

messung des zusammenflusses von ipscs mit einem automatisierten bildgebungssystem.

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

Diese Studie konzentriert sich auf das Verständnis, wie wachsende iPS-Zellen auf verschiedenen ECM-Beschichtungssubstraten die Zellkonfluenz beeinflussen können. Es wurde ein Protokoll zur Bewertung der iPSC-Konfluenz in Echtzeit erstellt, ohne dass Zellen in Einzelzellsuspension gezählt werden müssen, um Wachstumsstörungen zu vermeiden. Ein High-Content-Bildanalysesystem wurde verwendet, um die iPCS-Konfluenz auf 4 verschiedenen ECMs im Laufe der Zeit automatisiert zu bewerten. Verschiedene Analyseeinstellungen wurden verwendet, um die Zellkonfluenz von adhärenten iPS-Zellen zu beurteilen, und es wurde nur ein geringer Unterschied (nach 24 und 48 Stunden mit Laminin) beobachtet, ob eine 60-, 80- oder 100%-Maske angewendet wurde. Wir zeigen auch, dass Laminin im Vergleich zu Matrigel, Vitronektin und Fibronektin zum besten Zusammenfluss führt.

In dieser Studie untersuchten wir den Zusammenfluss von iPSCs, wenn er unter verschiedenen Beschichtungsbedingungen gezüchtet wurde. Mit einem Zytometer konnten wir in 5 Tagen leicht aussagekräftige Ergebnisse in dreifacher Ausfertigung erhalten. Da iPSCs kaum an Kunststoffgefäßen haften und eine Beschichtung notwendig ist, um ihre Proliferation zu unterstützen, haben wir uns entschieden, den Zusammenfluss von humanen iPSCs zu überwachen, da dies auf die Gesundheit der Zellkultur hinweist und ihr Differenzierungspotenzia...

Das Ziel des Protokolls ist es, verschiedene extrazelluläre Matrix-Beschichtungsbedingungen (ECM) zu vergleichen, um zu beurteilen, wie sich eine differentielle Beschichtung auf die Wachstumsrate von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) auswirkt. Insbesondere wollen wir Bedingungen schaffen, um ein optimales Wachstum von iPSC-Kulturen zu erreichen.

Messung des Zusammenflusses von iPSCs mit einem automatisierten Bildgebungssystem.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es eine schnelle Bewertung der induzierten Konfluenz pluripotenter Stammzellen auf verschiedenen extrazellulären Matrix-Beschichtungssubstraten in Echtzeit ermöglicht. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es keine Zählung der Einzelzellsuspensionen erfordert, wodurch eine Wachstumsstörung bei iPSCs verhindert wird, die empfindlich auf Passage reagieren. Das Verfahren wird von Valentina Magliocca, einer Postdoktorandin aus meinem Labor, demonstriert.Um Basalmembranmatrix-beschichtete Platten einzurichten, verdünnen Sie die Basalmembranmatrix, stellen Sie ein Verhältnis von 1 zu 100 in DMEM ein und geben Sie 100 Mikroliter der resultierenden Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Wenn alle Vertiefungen codiert sind, legen Sie die Platte für eine Stunde in den Zellkultur-Inkubator. Entsorgen Sie am Ende der Inkubation die Basalmembranmatrixlösung und waschen Sie jede Vertiefung zweimal mit 100 Mikrolitern frischem DMEM pro Vertiefung.Um lamininbeschichtete Platten einzurichten, verdünnen Sie 20 Mikrogramm pro Milliliter Laminin in PBS mit Calcium und Magnesium und geben Sie 100 Mikroliter der Lamininlösung in jede Vertiefung einer neuen 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platte dann über Nacht bei vier Grad Celsius, bevor Sie die Vertiefungen wie demonstriert zweimal mit frischem DMEM waschen. Um Vitronectin-beschichtete Platten einzurichten, verdünnen Sie 10 Mikrogramm pro Milliliter Vitronectin in Verdünnungspuffer und geben Sie 100 Mikroliter Puffer in jede Vertiefung einer neuen 96-Well-Platte.Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur waschen Sie die Vertiefungen mit 100 Mikrolitern PBS ohne Kalzium und Magnesium pro Vertiefung. Zur Herstellung von mit Fibronektin beschichteten Platten für den Menschen verdünnen Sie 30 Mikrogramm pro Milliliter Fibronektin in doppelt destilliertem Wasser und geben Sie 100 Mikroliter der Fibronektinlösung in jede Vertiefung einer neuen 96-Well-Platte. Nach einer 45-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur waschen Sie die Vertiefungen wie gezeigt mit frischem DMEM.Zwei Tage vor dem Einrichten einer iPSC-Kultur werden embryonale Fibroblasten der Maus mit einer Dichte von 2,4 x 10 x 10 bis einem Viertel pro Quadratzentimeter in vollständigem Zellkulturmedium in jede der beiden Vertiefungen mit Sechs-Well-Zellkulturplatten gesät und die Platten in den Zellkultur-Inkubator gelegt. Um eine iPS-Kultur einzurichten, erwärmen Sie eine Stammlösung aus kryokonservierten iPS-Zellen in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Wenn die Zellen gerade aufgetaut sind, reinigen Sie das Fläschchen mit 70 % Ethanol und legen Sie die Zellen in eine biologische Sicherheitswerkbank.Mit einer 1000-Mikroliter-Pipette werden die Zellen tropfenweise in ein steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern vorgewärmtem Zellkulturmedium überführt. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in vier Millilitern frischem Zellkulturmedium. Dann Platte 1 x 10 zu den fünften Zellen in jede der beiden Vertiefungen der mit embryonalen Fibroblasten besiedelten Sechs-Well-Platten der Maus.Ergänzen Sie die Zellkulturen nach der Aussaat mit 10 Mikromolaren des ROCK-Inhibitors Y-27632 und legen Sie die Platten für vier bis fünf Wochen in den Zellkultur-Inkubator. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreichen, behandeln Sie jede Kultur drei bis fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem Milliliter 0,5 millimolare EDTA. Wenn sich die Zellen abgelöst haben, spalten Sie die Zellen im Verhältnis eins zu vier in frischem Zellkulturmedium und plattieren Sie die Zellen in jeder der vier verbleibenden Vertiefungen der Sechs-Well-Platte unter Feeder-freien Bedingungen.Anschließend stellen Sie die Platten wieder in den Zellkultur-Inkubator. Um die Auswirkungen der verschiedenen Beschichtungen auf die Zellkonfluenz nach mindestens einem Monat Kultur unter feederfreien Bedingungen zu beurteilen, verwenden Sie Einweg-Zählobjektträger, um die Zellen aus jeder Kultur in einer Zählkammer zu zählen. Verdünnen Sie die Zellen auf eine x 10 bis eine vierte Zelle pro 200 Mikroliter mittlerer Konzentration und säen Sie die Zellen in dreifacher Ausfertigung in jede der drei Vertiefungen einer abdeckend beschichteten 96-Well-Platte pro Bedingung aus.Wenn alle Zellen plattiert sind, legen Sie die Platten für 24 Stunden in den Zellkultur-Inkubator. Führen Sie am nächsten Tag und an jedem Tag für die nächsten fünf Tage eine automatische Bildgebung der Zellen mit den Einstellungen für Autokontrast und automatische Belichtung durch, um eine optimale Visualisierung zu gewährleisten. Um die Fokusänderungen aufgrund der Lichtbrechung am Rand der Vertiefungen zu bewerten, setzen Sie die Analyseeinstellungen auf Konfluenzanalyse, um eine Maske von 60, 80 oder 100 % pro Vertiefung anzuwenden, und verwenden Sie die verschiedenen Einstellungen für die Maskenanalyse, um die Zellkonfluenz zu jedem Zeitpunkt zu analysieren.Um die Gesamtunterschiede der verschiedenen Kodierungsbedingungen zu vergleichen, verwenden Sie die Beispieldaten, um den T-Test des Schülers für gepaarte Stichproben durchzuführen, und geben Sie die quantitativen Ergebnisse als mittlere Änderungen der Konfluenz plus oder minus dem Standardfehler des Mittelwerts an. Zur Charakterisierung der Mikrofilamente des Zytoskeletts fixieren Sie die Zellen zunächst 10 Minuten lang mit 100 Mikrolitern 4%-Paraformaldehyd in PBS pro Vertiefung für 10 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von zwei 10-minütigen Wäschen in 200 Mikrolitern PBS pro Waschgang. Übertragen Sie das zuvor platzierte Deckglas von der Platte auf den Objektträger.Geben Sie jeweils 100 Mikroliter 5 %iges Rinderserum und 0,1 % Triton in PBS eine Stunde lang bei Raumtemperatur in jede Vertiefung, um eine unspezifische Bindung zu verhindern, und waschen Sie die Proben wie gezeigt mit zwei 10-minütigen PBS-Waschgängen. Nach dem zweiten Waschen fügen Sie 100 Mikroliter Phalloidin-konjugierte Arbeitslösung pro Probe für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu, gefolgt von zwei 10-minütigen Waschgängen in PBS. Als nächstes färben Sie die Zellkerne mit Hoechst 33342, verdünnt auf eine Konzentration von eins bis 10.000 in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von zwei PBS-Waschungen.Spülen Sie die Zellen nach dem zweiten Waschen mit Wasser ab und lassen Sie die Platten unter einer chemischen Haube trocknen. Wenn das Deckglas getrocknet ist, bedecken Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern eines geeigneten Einbettmediums pro Vertiefung und platzieren Sie die Zellen auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, das mit einer Weißlicht-Laserquelle und einem 405-Nanometer-Diodenlaser bei den entsprechenden Anregungs- und Emissionswellenlängen ausgestattet ist. Wählen Sie dann das 63-fache Ölimmersionsobjektiv und nehmen Sie sequenzielle konfokale Bilder der Zellen auf.Die Phalloidin-Färbung ermöglicht die Visualisierung des Grades der Zelladhäsion an der Oberfläche eines Gefäßes und insbesondere der für das Gefäß verwendeten Beschichtung. Zellen, die an einer Beschichtung haften, zeigen deutlich sichtbare Mikrofilamente des Zytoskeletts anstelle von kollabierten Mikrofilamenten. Die Hellfeld-Bildgebung ermöglicht auch die Abbildung des Adhäsionsgrades der iPSCs auf den beschichteten Oberflächen.iPSCs, die auf Laminin ausgesät werden, zeigen im Vergleich zu anderen Beschichtungen eine hohe Rate der Zellproliferation linear über die Zeit. Zellen, die auf Basalmembranmatrix, Vitronectin und humanem Fibronektin ausgesät wurden, zeigen im Gegensatz dazu eine lineare Proliferationsrate in den ersten 96 Stunden mit einer erhöhten Steigung in der Konfluenzkurve während der letzten 24 Stunden, unabhängig von der verwendeten Maske. Da der anfängliche Unterschied nach 24 Stunden für die verschiedenen Beschichtungen auf Unterschiede in der Zelladhäsion zurückzuführen sein kann, kann das Zellwachstum auf die 24-Stunden-Daten für die späteren Zeitpunkte normalisiert werden.Wie beobachtet, gibt es keine Unterschiede in Bezug auf die Konfluenz zwischen den verschiedenen Beschichtungen, was darauf hindeutet, dass die innerhalb der lamininbeschichteten Kulturen beobachteten Unterschiede höchstwahrscheinlich auf eine erhöhte Fähigkeit der iPSCs zurückzuführen sind, bei der Passage an dieser Beschichtung zu haften. Diese Studie kann zur Entwicklung standardisierter Methoden für die Kultivierung von iPSCs beitragen und deren zukünftige mögliche Verwendung in Kliniken unterstützen. Wir untersuchen derzeit die Biologie der wichtigsten Zelloberflächenrezeptoren, die Zell-EZM-Kontakte vermitteln und für die Aufrechterhaltung ihrer Selbsterneuerungsfähigkeit verantwortlich sein könnten.

measuring-the-confluence-of-ipscs-using-an-automated-imaging-system

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt, wie zu Synapse Anzahl sowohl in dissoziierten neuronalen Kultur und in Hirnschnitten mittels Immunzytochemie quantifizieren. Mit Fach-spezifische Antikörper, label wir präsynaptischen Terminals sowie Standorte der postsynaptischen Spezialisierung. Wir definieren Synapsen als Punkte der Kolokalisation zwischen den Signalen, die von dieser Marker erzeugt.

Die Quantifizierung der Synapsen: eine Immunzytochemie-basierten Assay zur Synapse Anzahl Quantify

Wir präsentieren eine diskrete Tröpfchen Probeneinführungssystem für induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS). Es basiert auf einem günstigen und Einweg-Mikrofluidik-Chip, hochmonodispersen Tröpfchen von 90 bis 7000 Hz erzeugt in einem Größenbereich von 40 bis 60 &amp; mgr; m bei Frequenzen basiert.

Eines mikrofluidischen Chips für ICPMS Probenaufgabe

Um die Strömungsgeschwindigkeiten und die Richtungsabhängigkeit von filamentösem Aktin an der immunologischen T-Zell-Synapse zu untersuchen, wird die hochauflösende Bildgebung lebender Zellen mit Totalreflexionsfluoreszenz kombiniert und mit räumlich-zeitlicher Bildkorrelationsspektroskopie quantifiziert.

Kortikalen Aktin Fluss in T-Zellen durch Raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie von Structured Illumination Microscopy Daten Quantifizierte

Wir präsentieren ein Protokoll für die Anwendung von interferometrischen photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (iPalm), einer 3-dimensionalen Einzelmoleküllokalisierung Super Resolution Mikroskopie-Methode, um die Abbildung des Aktin-Zytoskelett in adhärenten Säugerzellen. Dieser Ansatz ermöglicht es Licht-basierte Visualisierung von Nanostrukturmerkmale, die sonst mit herkömmlichen beugungsbegrenzten optischen Mikroskopie ungelöst bleiben würde.

Dreidimensionale Super Resolution Mikroskopie von F-Aktin durch interferometrische fotoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (iPalm)

In dieser Arbeit wird ein praktischer Leitfaden gegeben, der die verschiedenen Schritte zur Herstellung der Kopplung von SMPS- und ICPMS-Systemen beschreibt und wie man sie benutzt. Es werden drei beschreibende Beispiele vorgestellt.

Ein praktischer Leitfaden zur Kopplung eines Scanning Mobility Sizer und induktiv gekoppelten Plasma-Massenspektrometers (SMPS-ICPMS)

Antikörper, die Ziel-Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden können Konformation und clustering Veränderungen verleihen. Diese dynamischen Veränderungen haben Auswirkungen für die Charakterisierung von Arzneimittelentwicklung in Zielzellen. Dieses Protokoll nutzt konfokalen Mikroskopie und Bild Korrelation Spektroskopie durch ImageJ/Fidschi, das Ausmaß des Rezeptors auf der Zelloberfläche clustering zu quantifizieren.

Konfokale Mikroskopie zeigt Zelle Oberfläche Rezeptor Aggregation über Bild Korrelation Spektroskopie

Hier präsentieren wir Ihnen eine praktische Anleitung für eine integrierte Mikroskopie Bausystem, das konventionelle Epi-fluoreszierende Bildgebung, Einzelmolekül-Erkennung-basierte Höchstauflösung Bildgebung und Multi-Color Einzelmolekül-Erkennung übergeht, einschließlich Einzelmolekül-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer imaging, in einer Aufspannung auf kostengünstige Weise.

Durchführung von mehreren Imaging-Modi mit einem Fluoreszenzmikroskop

Wir präsentieren ein Protokoll für die Echtzeit-optische Erkennung von einzelnen unbeschriftete Proteine, wie sie von lebenden Zellen abgesondert werden. Grundlage hierfür ist interferometrischen Streuung (iSCAT) Mikroskopie, die auf eine Vielzahl von unterschiedlichen biologischen Systemen und Konfigurationen angewendet werden können.

Markierungsfreie Imaging der einzelnen Proteine abgesondert von lebenden Zellen über iSCAT Mikroskopie

Hier stellen wir einen kombinatorischen Ansatz vor, bei dem hochauflösende Mikroskopie, Rechenwerkzeuge und Einzellen-Beschriftungen in lebenden C. eleganischen Embryonen verwendet werden, um die Einzelzellendynamik während der Neuroentwicklung zu verstehen.

Isotrope Licht-Sheet-Mikroskopie und automatisierte Zelllineage-Analysen zu Katalog-Caenorhabditis elegans Embryogenese mit subzellulärer Auflösung

Die Bildung eines richtigen Sarcomere-Netzwerks ist wichtig für die Reifung von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten. Wir präsentieren einen super Auflösungs-basierten Ansatz, der die quantitative Bewertung der strukturellen Reifung von Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten ermöglicht, um die Kulturbedingungen zu verbessern, die die Herzentwicklung fördern.

Analyse des α-Actinin-Netzwerks in humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten mittels Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie

Wir stellen eine Methode zur Erfassung von Fluoreszenz-Reporter-Zeitkursen aus einzelnen Zellen mit mikrostrukturierten Arrays vor. Das Protokoll beschreibt die Vorbereitung von Einzelzellarrays, den Aufbau und Betrieb der Live-Cell-Scanning-Zeitraffermikroskopie und ein Open-Source-Bildanalyse-Tool zur automatisierten Vorauswahl, visuellen Kontrolle und Verfolgung von zellintegrierten Fluoreszenzzeitverläufen pro Adhäsionsstelle.

Live-Cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - eine vielseitige Technik zur Quantifizierung der zellulären Kinetik

Erfahren Sie die Bewertung von iPSC-Konfluenz auf verschiedenen ECM-Beschichtungen mittels automatisiertem Bildgebungssystem. Diese Methode ermöglicht eine schnelle Analyse ohne Einzelzellzählung und verbessert die Stammzellkultur für regenerative Medizin.

Messung des Zusammenflusses von iPSCs mit einem automatisierten Bildgebungssystem.

Weitere Videos entdecken