Bewertung der zellulären Oxidation mit einem subzellulären Kompartiment-spezifischeredox-sensitivegrüne fluoreszierende Protein

Aktuelle Protokollbewerter in Textil- und Redoxzustandsänderungen in intrazellulärer Kompartiment-spezifisch. Unser Protokoll ermöglicht ein besseres Verständnis und überwachung aller physiologischen oder pathophysiologischen Mechanismen von oxidativem Stress. Diese Technik ermöglicht eine unterbrechungsfreie Quantifizierung des gefliesten Augensulfid-Verhältnisses in intakten Zellen unter Verwendung einer ratiometrischen Ausgabe, um die Unterschiede zwischen Signalexpressionsniveaus, Fotobleichungen und Erkennungsempfindlichkeiten auszugleichen.

Dieses Protokoll kann auf verschiedene Organismen angewendet werden, einschließlich Bakterien in Pflanzen. Am ersten Tag des Experiments behandeln die Zellen aus einer konfluenten Brustkrebs-Zelllinie für zwei Minuten, mit zwei Millilitern von 0,2, 5%Trips in EDTA. Wenn die Zellen beginnen, die Reaktion mit sechs Millilitern des vollständigen Mediums zu lösen und die Zellen durch Zentrifugation zu sedimentieren.

Das Pellet in fünf Milliliter frisches, vollständiges Medium aussetzen, die Zellen zählen und auf 1,5 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro einem Milliliter kompletten Medium verdünnen. Dann säen Sie 1,5 mal 10 bis die fünften Zellen pro Milliliter Zellen pro Brunnen in einer 6-Well-Platte, und inkubieren sie die Zellen im Zellkultur-Inkubator über Nacht. Oder fügen Sie keine virale Zeile GFP-Transduktion hinzu.

Am nächsten Morgen, fügen Sie 12,5, 25 und 50 Mikroliter eines ein bis 100 verdünnt sechs mal 10 der 10. Plaque bildende Einheiten pro Milliliter hinzufügen keine virale erodierte GFP-Lösung, in vollständigem Medium. Fügen Sie dies zu den entsprechenden Brunnen oder die 6 Brunnenplatte hinzu, um die Zellen mit 50, 100 bzw. 200 Infektionsmultiplizitäten zu transducieren. Wenn alle Proben Wells mit Virus transduziert wurden, kehren Sie die Zellen für 16 bis 24 Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück.

Am nächsten Tag visualisieren Sie die Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie und ersetzen Sie den Überstand durch Medium, ohne Virus, damit sich die Zellen für weitere 24 Stunden erholen können. Um die optimale Transduktionseffizienz zu bestimmen, bewerten Sie die Fluoreszenzintensität und Morphologie der Zellen durch Durchflusszytometrie. Achten Sie darauf, alle Verfahren durchzuführen, die Infektionen durch Aerosole oder Spritzer innerhalb eines Biosicherheitsniveaus zwei zertifizierten biologischen Sicherheitsschrank verursachen können.

Um den Redoxstatus der Zellen zu bewerten, bebrüten Sie am nächsten Morgen die Zellen und die entsprechenden Wells der 6 Well-Platte mit 10 mikromolarem Wasserstoffperoxid für eine Stunde, bevor Sie die Zellen mit 750 Mikrolitern 0,2 5%Tropfen in EDTA pro Brunnen ablösen, wie gezeigt. Stoppen Sie die Reaktion mit zwei Millilitern komplettem Medium pro Brunnen und ziehen Sie die Überstände für jeden Zustand in einzelnen 15 Milliliter konischen Rohren. Sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und waschen Sie die Pellets in 500 Mikroliter PBS pro Brunnen durch Zentrifugationen zweimal.

Filtern Sie die Zellsuspensionen nach der zweiten Wäsche durch 40 Mikrometer-Netze in strömungszytometriekompatible Rohre auf Eis, die vor Licht geschützt sind. Führen Sie in der Flow-Zytometer-Software die Null-Multiplizität der Infektionskontrollprobe aus. Analysieren Sie dann das Wasserstoffperoxid und unbehandelte Zellen.

Es wird die Berechnung des mittleren fluoreszierenden Intensitätsverhältnisses zwischen den oxidierten und reduzierten Formen des ReihenGFP ermöglichen, unter Verwendung der angegebenen Formel. Hier ist die Gating-Strategie für die Auswahl einer großen Anzahl von Zellen durch Durchflusszytometrie wird gezeigt. Die Durchflusszytometrie kann auch verwendet werden, um die Dosis-Antwort-Kurve für die Rand-GFP-Analyse und die effizienteste Multiplizität der Infektionseingaben zu bestimmen.

Nach der Vielzahl der Infektion, Dosis-Reaktions-Kurve in dieser repräsentativen Analyse, eine 200 Vielzahl von Infektionen gab die höchste Straße GFP-Expression, aber die Zellmorphologie wurde durchgeführt, die Zytotoxizität suggeriert. Daher wurde die optimale Transduktionseffizienz als eine Vielzahl von Infektionen von 100 bestimmt. In dieser Redoxstatusanalyse wurden oxidierte und reduzierte Reihen-GFP-Mittelfluoreszenzintensitäten aus der Durchflusszytometrie-Analyse für Fahrzeuge und vier 10 mikromolaren Positivkontroll-Wasserstoffperoxid-Behandlungen erhalten.

Die überlagerten Histogramme stellen die Verschiebungen der Zellzahl in den 10 mikromollaren Wasserstoffperoxid- und fahrzeugbehandelten Gruppen oder reduzierten und oxidierten Erodieren GFP dar. Die Berechnung des Verhältnisses zwischen dem oxidierten und reduzierten Reihen-GFP für diese Analyse ergab, dass 10 mikromolares Wasserstoffperoxid eine Verdreifachung der Oxidation des ReihenGFP im Vergleich zur Fahrzeugbehandlung verursachte. Genaue Zellzahlen sind wichtig für MRT-Berechnungen und Reproduzierbarkeit.

Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, sollten die Forscher die antiviralen Lösungen gründlich mischen, um homogene Suspensionen zu erhalten. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, schnelle Redox-Änderungen als integralen Bestandteil des breiten Spektrums normaler zellulärer Prozesse und des Krankheitsverlaufs in Echtzeit zu untersuchen.