Name: Bewertung der zellulären Oxidation mit einem subzellulären Kompartiment-spezifischeredox-sensitivegrüne fluoreszierende Protein (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Lernen Sie die Bewertung subzellulärer Redox-Zustände in intakten Zellen mit einem redox-sensitiven fluoreszierenden Protein. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht die Quantifizierung oxidativer Stressmechanismen in Echtzeit.

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Das Konstrukt und rekombinante Adenovirus zur Exdinierung von Cytosol-spezifischem RoGFP in Zellen wurden im Labor von Paul T. Schumacker, PhD, Freiberg School of Medicine, Northwestern University und ViraQuest Inc. erzeugt. Diese Studie wurde vom Center for Studies of Host Response to Cancer Therapy Grant P20GM109005 durch das NIH National Institute of General Medical Sciences Centers of Biomedical Research Excellence (COBRE NIGMS), National Institute of General Medical Sciences Systems Pharmacology and Toxicology Training Program Grant T32 GM106999, UAMS Foundation/Medical Research Endowment Award AWD00053956, UAMS Year-End Chancellor es Awards AWD00053484. Die Durchflusszytometrie-Kernanlage wurde teilweise vom Center for Microbial Pathogenesis und Host Inflammatory Responses Grant P20GM103625 über das COBRE NIGMS unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten des NIH dar. ATA wurde vom Wissenschafts- und Technologieforschungsrat der Türkei (TUBITAK) 2214-A Stipendium unterstützt.

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde für 70 % –80 % konfluente MDA-MB-231-Zellen optimiert. Bei anderen Zelllinien sollten die Anzahl der Zellen und die Vielzahl der Infektionen (MOI) neu optimiert werden.
1. Vorbereitung der Zellen (Tag 1)
<ol><li>MDA-MB-231 Zelllinie in 75 cm2 Kolben mit 10 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) zu halten, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) bei 37 °C in einer 5%CO2 befeuchteten Atmosphäre. HINWEIS: DMEM, ergänzt durch 10% FBS, 37 °C und eine 5%CO2 befeuchtete Atmosphäre, werden für alle Befestigungs- und Behandlungsinkubationen während des gesamten Protokolls verwendet.</li>
	<li>Bereiten Sie die MDA-MB-231-Zellen für Experimente vor.<ol>
<li>Saugen Sie das Medium innerhalb des Kolbens, lösen Sie die Zellen mit 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung für 2 min und inaktivieren Sie die Trypsin-Aktivität mit 6 ml komplettem Medium (DMEM mit 10% FBS). Zentrifugieren Sie die Zellen bei 150 x g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 5 ml komplettem Medium.</li>
		<li>Mischen Sie eine Zelle mit gleichem Volumen und 0,4% Trypan blau. Nehmen Sie 10 l dieser Mischung und zählen Sie die Zellen mit dem automatisierten Zellzähler. HINWEIS: Ein Coulter-Zähler oder ein Hämozytometer kann auch für die Zellzählung verwendet werden.</li>
		<li>Säen Sie die Zellen in eine 6-Well-Platte für Durchflusszytometrie-Analysen und säen Sie 150.000 Zellen in 1 ml Medium pro Brunnen. Warten Sie 16 h auf Zellanhaftung.</li>
		<li>Säen Sie die Zellen in ein 4-Well-Kammer-Dia für fluoreszierende Bildgebung und Samen 25.000 Zellen in 0,5 ml Medium pro Brunnen. Warten Sie 16 h auf Zellanhaftung. HINWEIS: Samenkontrollbrunnen zusätzlich zu Behandlungsbrunnen. Verwenden Sie eine der Kontrollbrunnen, um die Zellnummer zu bestimmen (optional: wenn die Bindungsdauer für die Zellen kürzer als die Verdoppelungszeit ist, kann davon ausgegangen werden, dass die Zellenzahl mit der Saatdichte identisch ist) und die andere für eine nicht infizierte Kontrolle (0 MOI).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Adenovirale RoGFP-Transduktion (Tag 2 und 3)
VORSICHT: Adenoviren können Krankheiten verursachen. Verwenden Sie bei der Transducing der Zellen gefilterte Spitzen und dekontaminieren Sie Spitzen, Pasteurpipetten und Mikrozentrifugenröhrchen mit 10% Bleichmittel.
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde mit zytosolspezifischem RoGFP demonstriert, aber andere zelluläre Kompartimente (z. B. Mitochondrien oder mitochondrialer Intermembranraum) können mit demselben Protokoll gezielt werden.
<ol><li>Generieren Sie eine Dosis-Wirkungs-Kurve für den MOI, um die höchste Transduktionseffizienz zu erzielen, indem Sie das Volumen des Adenovirus (mL) berechnen, das für jeden MOI-Wert für die MDA-MB-231-Zelllinie erforderlich ist (Tabelle 1): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61229/61229equ01.jpg"> HINWEIS: Der funktionelle Titer jeder Charge adenoviraler Bestände, die als Plaque-Formeinheit (PFU) pro ml ausgedrückt wird, wird vom Unternehmen bereitgestellt. Der optimale MOI für die Transduktion unterscheidet sich von Zelltypen aus. Für die meisten Säugetierzellen liegt der optimale MOI-Bereich zwischen 10 und 300. Gemäß der zellulären Reaktion sollten MOI-Werte neu berechnet werden (z. B. sollte der MOI-Bereich reduziert werden, wenn Zellen eine zytotoxische Reaktion haben, oder der Bereich sollte erhöht werden, wenn Zellen eine geringe Transduktionseffizienz aufweisen).</li>
	<li>Machen Sie 1:100 Verdünnung von 6 x 1010 PFU/ml adenovirale roGFP-Lösung mit Zellkulturmedium (DMEM mit 10% FBS) für zuverlässige Pipettierung.</li>
	<li>Pipette und fügen Sie 0,0125 ml (12,5 l), 0,025 ml (25 l), 0,05 ml (50 l) adenovirale roGFP-Verdünnung in jeden Brunnen der 6 Brunnenplatte, um die 150.000 Zellen mit 50, 100 bzw. 200 MOI für die Durchflusszytometrieanalyse zu transduzieren (1).</li>
	<li>Pipette und fügen Sie 0,0042 ml (4,2 l) adenovirale roGFP-Verdünnung in den 4-Kammer-Diabrunnen hinzu, um 25.000 Zellen mit 100 MOI für Fluoreszenz-Bildgebung zu transduzieren (Tabelle 1). HINWEIS: In den Brunnen sollte eine minimale Menge an Medium verwendet werden, um die höchste Wechselwirkung zwischen dem adenoviralen RoGFP-Konstrukt und den Zellen zu gewährleisten. Der Serumgehalt des Kulturmediums muss möglicherweise für verschiedene Zelllinien verringert werden, da hohe Serumwerte die Transduktionseffizienz in einigen Zelltypen negativ beeinflussen können.</li>
	<li>Inkubieren Sie Zellen für 16–24 h unter den Bedingungen der Zellerhaltung. Am nächsten Tag (Tag 3) ändern Sie das Medium-Zell-Kulturmedium (DMEM mit 10% FBS), um eine Zellwiederherstellung für weitere 24 h zu ermöglichen. Visualisierung von Zellen unter dem Mikroskop, um ihre Morphologie zu bewerten; Zellen können roGFP ausdrücken, auch wenn sie morphologische Veränderungen haben. HINWEIS: Am 3. Tag sollten die Zellen beginnen, roGFP auszudrücken; Daher kann die Transduktionseffizienz mit der Fluoreszenzmikroskopie (Filter mit ex. 488/em. 525) überwacht werden. Um konsistente Assay-Ergebnisse zu erhalten, sollten Sie sich der morphologischen Veränderungen unter dem Phasenkontrastmikroskop bewusst sein und diese dokumentieren und die Morphologie beobachten, während Sie die Transduktionseffizienz bewerten.</li>
	<li>Konstruieren Sie eine Dosis-Wirkungs-Kurve mit den 50, 100 und 200 MOI-Proben, die in Schritt 2.3 erstellt wurden, und deren Transduktionseffizienzergebnisse aus der Durchflusszytometrieanalyse (Schritte 3.1 und 4.1). Bewerten Sie die optimale Transduktionseffizienz mit der Dokumentation morphologischer Veränderungen (Schritt 2.5) und der Dosis-Wirkungs-Kurve von MOI. HINWEIS: Obwohl mehr als 98% der Zellpopulation bei 100 MOI und 200 MOI roGFP ausdrücken (siehe repräsentative Ergebnisse), zeigten 200 MOI-Gruppen wesentliche Veränderungen in der Zellmorphologie von MDA-MB-231-Zellen. Folglich wurde die wirksamste MOI für MDA-MB-231-Zellen auf 100 MOI festgelegt.</li>
	<li>Nachdem optimales MOI (hier 100 MOI) für die MDA-MB-231-Zelllinie ausgewählt wurde, führen Sie Experimente mit Testmaterialien (10 M H2O2 und seinem Fahrzeug 0,1% entionisiertes Wasser) durch.<ol>
<li>Bereiten Sie die Zellen gemäß Abschnitt 1 vor und säen Sie sie aus. Unter Verwendung des adenoviralen Transduktionsvolumens für 100 MOI, berechnet in Schritt 2.1, wiederholen Sie die Schritte 2.2-2.4 für 100 adenovirale MOI-Transduktion von Zellen. Dann inkubieren Sie die Platte und Kammer gleitet nach Schritt 2.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Erwerb der CyS/CySS-Bilanz
<ol><li>Durchflusszytometrie (Tag 4)<ol>
<li>An Tag 4 die Zellen ab Schritt 2.7.1 mit 10 'MH2O2 für 1 h inkubieren. ANMERKUNG: Als Prüfsubstanz wurden 10 m H2O2 und in diesem Protokoll 0,1 % entionisiertes Wasser als Fahrzeugbehandlung verwendet. Andere Oxidationsmittel können hier als positiv gesteuert werden.</li>
		<li>Aspirieren Sie Medien aus der 6-Well-Platte, ersetzen Sie durch 750 l 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung und warten Sie 2 min, bis sich die Zellen lösen. Inaktivieren Sie Trypsin mit 2 ml komplettem Medium (DMEM mit 10% FBS) und sammeln Sie das Volumen in 15 ml konische Rohre.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei 150 x g für 5 min bei 4oC. Überstand entsorgen und die Zellen in 500 l Phosphat-gepufferter Saline (PBS) aussetzen.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 3.1.3</li>
		<li>Filtern Sie die Zellsuspensionen in strömungszytometrie-kompatible Rohre mit 40 m Mesh. Halten Sie die Rohre auf Eis und weg vom Licht und folgen Sie Schritt 4.1 für die Datenanalyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroskopische Bildgebung (Tag 4)<ol>
<li>Behandeln Sie am 4. Tag Zellen mit 10 M H2O2, erfassen Sie bilder sofort (Zeitpunkt 0) und 1 h nach der Behandlung und folgen Sie Schritt 4.2 für die Datenanalyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Datenanalyse
<ol><li>Flusszytometrie-Quantifizierung<ol>
<li>Festlegen der Durchflusszytometriemethode für 3 verschiedene Analysen über Probenerfassungssoftware (siehe Materialtabelle):Vorwärtsstreuung (FCS) auf x-Achse und Seitenstreuung (SSC) auf y-Achse zur Bewertung der Zellgröße und -komplexität von Zellen (SSC kann zur groben Identifizierung von toten und lebenden Zellen verwendet werden); z.B. 488 nm/em. 525 nm (Fluorescein isothiocyanat [FITC]) Bandpassfilter auf x-Achse und SSC auf y-Achse zur Beurteilung von CyS-roGFP; z.B. 405 nm/em. 525 nm (Brilliant Violet 510 [BV510]) Bandpassfilter auf x-Achse und SSC auf y-Achse zur Beurteilung von CySS-roGFP.</li>
		<li>Erfassen Sie 0 MOI-Steuerung und visualisieren Sie Zellen mit Probenerfassungssoftware. Wiederholen Sie diesen Schritt für die verbleibenden Proben (50, 100, 200 MOI-Gruppen und später 10 M H2O2 behandelte Zellen und fahrzeugbehandelte Zellen). Speichern Sie die Dateien für die Datenanalyse.</li>
		<li>Öffnen Sie Datenanalysesoftware (siehe Tabelle der Materialien) und öffnen Sie 0 MOI-Beispieldatei. Bewerten Sie die Zellpopulation von Interesse (Tor 1). Richten Sie die folgenden Gatings ein, um die Hintergrundfluoreszenz für z.B. 488 nm/em zu minimieren. 525 nm (Tor 2) und ex. 405 nm/em. 525 nm (Gate 3) Bandpassfilter mit den nicht infizierten (0 MOI) Steuerzellen.</li>
		<li>Öffnen Sie 50, 100 und 200 MOI-Beispieldateien in der Datenanalysesoftware, um die Dosis-Wirkungs-Kurve zu bewerten. Analysieren Sie die mittleren Fluoreszenzintensitäten mit Gates 2 und 3 für jede Probe. Wiederholen Sie diesen Schritt für Testproben (10 M H2O2 behandelte Zellen und fahrzeugbehandelte Zellen).</li>
		<li>Berechnen Sie das mittlere fluoreszierende Intensitätsverhältnis zwischen oxidierten und reduzierten Formen von RoGFP mit der folgenden Gleichung.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61229/61229equ02.jpg">
<ol start="2"><li>Image-Bewertung<ol>
<li>Verwenden Sie ein Mikroskop, das Fluoreszenzfilter für CyS-roGFP und CySS-roGFP (z.B. 488 nm/em. 525 nm bzw. ex. 405 nm/em. 525 nm Filter) enthält.</li>
		<li>Wählen Sie in jedem Brunnen der Kammerfolie 4 zufällige Bereiche aus, um Bilder zu erfassen, wobei sie das 4x-Ziel verwenden, um größere Bereiche zu visualisieren. HINWEIS: 20x Objektiv kann auch für Bildanzeigen verwendet werden.</li>
		<li>Öffnen Sie das Bild mit ImageJ Software11. Anwenden von Analyze | Messen Sie Befehle für jedes Bild, und verwenden Sie die Gleichung in Schritt 4.1.5, um die Daten zu quantifizieren. ANMERKUNG: Die Quantifizierung der Bilder ist ratiometrisch; Daher enthält das Protokoll keine Subtraktion des Hintergrunds. Um Bilder vergleichen zu können, müssen Helligkeit, Kontrast und Sättigung jedoch für jedes Bild gleich sein. Die statistische Signifikanz wurde mit einer einseitigen Varianzanalyse (ANOVA) und Tukeys Post-hoc-Test bewertet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das Thiol/Disulfid-Gleichgewicht in einem Organismus spiegelt den Redoxstatus von Zellen wider. Lebende Organismen haben Glutathion, Cystein, Proteinthiole und niedermolekulare Thiole, die alle von der Oxidation betroffen sind und den Redoxstatus der Zellen4wiedergeben. Technische ROGFPs ermöglichen die unterbrechungsfreie Quantifizierung des Thiol/Disulfid-Gleichgewichts über ihre CyS-Rückstände7. Die ratiometrische Eigenschaft von roGFP liefert zuverlässige Redoxmessungen...

Oxidativer Stress wurde 1985 von Helmut Sies als "Störung des prooxidant-antioxidativen Gleichgewichts zu Gunsten des ersten"definiert,und es wurde eine Fülle von Forschungsarbeiten durchgeführt, um einen krankheits-, ernährungs- und alterungsspezifischen Redoxstatus von Organismen1,2,3zu erhalten. Seitdem ist das Verständnis von oxidativem Stress breiter geworden. Das Testen der Hypothesen der Verwendung von Antioxidantien gegen Krankheiten und/oder Alterung hat gezeigt, dass oxidativer Stress nicht nur Schaden verursacht, sondern auch andere Rollen in Zellen spielt. Darüber hinaus haben Wissenschaftler gezeigt, dass freie Radikale eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion2spielen. Alle diese Studien stärken die Bedeutung der Bestimmung der Veränderungen des Reduktions-Oxidations-Verhältnisses (Redox) von Makromolekülen. Enzymaktivität, Antioxidantien und/oder Oxidationsmittel sowie Oxidationsprodukte können mit verschiedenen Methoden bewertet werden. Unter diesen, Methoden, die Thiol-Oxidation bestimmen sind wohl die am häufigsten verwendeten, weil sie über das Gleichgewicht zwischen Antioxidantien und Prooxidantien in Zellen berichten, sowie Organismen4. Insbesondere werden die Verhältnisse zwischen Glutathion (GSH)/Glutathiondisulfid (GSSG) und/oder Cystein (CyS)/Cystin (CySS) als Biomarker zur Überwachung des Redoxstatus von Organismen2verwendet.
Methoden, die zur Aschägung des Gleichgewichts zwischen Prooxidanzien und Antioxidantien verwendet werden, basieren hauptsächlich auf dem Niveau reduzierter/oxidierter Proteine oder kleiner Moleküle in Zellen. Westliche Flecken und Massenspektrometrie werden verwendet, um die Verhältnisse von reduzierten/oxidierten Makromolekülen (Protein, Lipide usw.) umfassend zu bewerten, und GSH/GSSG-Verhältnisse können mit Spektrophotometrie5bewertet werden. Ein gemeinsames Merkmal dieser Methoden ist die physikalische Störung des Systems durch Zelllyse und/oder Gewebehomogenisierung. Diese Analysen werden auch dann schwierig, wenn es notwendig ist, den Oxidationsstatus verschiedener Zellkompartimente zu messen. Alle diese Störungen verursachen Artefakte in der Assay-Umgebung.
Redoxempfindliche fluoreszierende Proteine eröffneten eine vorteilhafte Ära zur Bewertung des Redoxgleichgewichts, ohne eine Störung in den Zellen zu verursachen6. Sie können verschiedene intrazelluläre Kompartimente ins Visier nehmen, um die Quantifizierung von kompartifenspezifischen Aktivitäten (z. B. Die Untersuchung des Redoxzustands von Mitochondrien und des Zytosols) zu ermöglichen, um das Übersprechen zwischen zellulären Organellen zu untersuchen. Gelbefluoreszenzproteine (YFP), grünes fluoreszierendes Protein (GFP) und HyPeR-Proteine werden von Meyer undKollegen6 überprüft. Unter diesen Proteinen ist Redox-sensitive sywertGFP (roGFP) aufgrund unterschiedlicher fluoreszierender Auslesungen seiner CyS (z.B. 488 nm/em. 525 nm) und CySS (z.B. 405 nm/525 nm) Rückstände einzigartig, was im Gegensatz zu anderen Redox-empfindlichen Proteinen wie YFP7,8eine ratiometrische Analyse ermöglicht, was eine ratiometrische Analyse ermöglicht. Die ratiometrische Ausgabe ist wertvoll, da sie die Unterschiede zwischen Expressionsstufen, Erkennungsempfindlichkeiten und Photobleaching8ausbalanciert. Subzelluläre Kompartimente von Zellen (Zytosol, Mitochondrien, Kern) oder verschiedenen Organismen (Bakterien sowie Säugetierzellen) können durch Modifizieren von roGFP7,9,10gezielt werden.
roGFP-Assays werden mit fluoreszierenden Bildgebungstechniken durchgeführt, insbesondere für Echtzeit-Visualisierungsexperimente. Flow-zytometrische Analysen von roGFPs sind auch für Experimente mit vorgegebenen Zeitpunkten möglich. Der aktuelle Artikel beschreibt sowohl die Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie als auch die Durchflusszytometrie, um eine ratiometrische Bewertung des Redoxstatus in Säugetierzellen durchzuführen, die roGFP (gezielt auf Zytosol) über adenovirale Transduktion überexzieren.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA</td><td>Gibco von Life Sciences</td><td>25200-056</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>4-Well-Kammer-Objektträger</td><td>Thermo Scientific</td><td>154526</td><td>Cell Seeding-Material für die Fluoreszenzbildgebung</td></tr><tr><td>5-ml-Röhrchen mit Zellsiebkappe</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>Einzelzell-Suspensionsröhrchen für die Durchflusszytometrie-Analyse</td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>353046</td><td>Zellaussaatmaterial für die Durchflusszytometrie-Analyse</td></tr><tr><td>15 ml konische Röhrchen</td><td>MidSci</td><td>C15B</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>75 cm2 belüftete Kappen-Gewebekulturflaschen</td><td>Corning</td><td>4306414</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Adenovirales Zytosol-spezifisches roGFP</td><td>ViraQuest</td><td>VQAd roGFP</td><td>roGFP-Konstrukt freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Schumaker</td></tr><tr><td>Klasse II, Typ A2 Sicherheitshaubenschrank</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 Serie A2</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Countess automatisierter Zellzähler</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td>Zellzählung</td></tr><tr><td>Countess Zellzähler Objektträger</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Zellzählung</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco by Life Sciences</td><td>11995-065</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Gefilterte Pipettenspitzen, steril, 20 & Mikro; l</td><td>Fisherbrand</td><td>02-717-161</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Gefilterte Pipettenspitzen, steril, 1000 & Mikro; l</td><td>Fisherbrand</td><td>02-717-166</td><td>Zellkultur-Durchflusszytometer</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>LSRFortessa</td><td>Instrument ausgestattet mit FITC- und BV510-Bandpassfiltern für Durchflusszytometrie-Analysen</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Advanced Microscopy Group (AMG)</td><td>Evos FL</td><td>Fluoreszenzbildgebung</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid 30%</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-100</td><td>Positivkontrolle</td></tr><tr><td>Light Cube, Custom</td><td>Life Sciences</td><td>CUB0037</td><td>Fluoreszenzbildgebung von roGFP-exprimierenden Zellen (ex 405 nm)</td></tr><tr><td>Light Cube, GFP</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMEP4651</td><td>Fluoreszierende Bildgebung von roGFP-exprimierenden Zellen (ex 488 nm)</td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>American Tissue Culture Collection</td><td>HTB-26</td> Mikrozentrifugenröhrchen <td>der humanen epithelialen Brustkrebszelllinie</td></tr><tr><td>, 2 ml</td><td>Grenier Bio-One</td><td>623201</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco by Life Sciences</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pipettierhilfe</td> für Zellkulturen <td>Drummond</td><td>Hood Mate Model 360</td><td></td></tr><tr><td>Serologiepipette für Zellkulturen, 1 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11B</td><td></td></tr><tr><td>Serologiepipette für Zellkulturen, 5 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>Serologiepipette für Zellkulturen, 10 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr> Zellkultur-Gewebekultur-Inkubator <tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>HERACell 150i</td><td>CO2 Inkubator für Zellkulturen</td></tr><tr><td>Trypanblau-Färbung 0,4%</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Zellzählung</td></tr></tbody></table>

bewertung der zellulären oxidation mit einem subzellulären kompartiment-spezifischeredox-sensitivegrüne fluoreszierende protein

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Die Messung des intrazellulären Oxidations-/Reduktionsgleichgewichts bietet einen Überblick über den physiologischen und/oder pathophysiologischen Redoxstatus eines Organismus. Thiole sind besonders wichtig für die Beleuchtung des Redoxstatus von Zellen über ihre reduzierten Dithiol- und oxidierten Disulfidverhältnisse. Entwickelte cysteinhaltige fluoreszierende Proteine eröffnen eine neue Ära für Redox-empfindliche Biosensoren. Eines davon, redoxsensitives grünes fluoreszierendes Protein (roGFP), kann leicht in Zellen mit adenoviraler Transduktion eingeführt werden, so dass der Redoxstatus subzellulärer Kompartimente ausgewertet werden kann, ohne zelluläre Prozesse zu stören. Reduzierte Cysteins und oxidierte Zystiker von roGFP haben Anregungsmaxima bei 488 nm bzw. 405 nm, mit Emission bei 525 nm. Die Beurteilung der Verhältnisse dieser reduzierten und oxidierten Formen ermöglicht die bequeme Berechnung des Redox-Gleichgewichts innerhalb der Zelle. In diesem Methodenartikel wurden verewigte menschliche dreifach-negative Brustkrebszellen (MDA-MB-231) verwendet, um den Redoxstatus innerhalb der lebenden Zelle zu bewerten. Die Protokollschritte umfassen MDA-MB-231 Zelllinientransduktion mit Adenovirus zur Exprimierbarkeit von Zytosol-RoGFP, Behandlung mit H2O2und Bewertung des Cystein- und Cystin-Verhältnisses mit Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie.

Der Redoxzustand von CyS/CySS lässt sich leicht mit transduzierten RoGFPs überprüfen. Die fluoreszierende Sonde quantifiziert das Verhältnis zwischen den reduzierten und oxidierten Formen (Erregungswellenlängen 488 nm bzw. 405 nm). Fluoreszenzdaten können sowohl durch Durchflusszytometrie als auch durch Mikroskopie ermittelt werden.
Eine große Anzahl von Zellen kann konsistent und bequem mit Durchflusszytometrie erfasst werden. Die Analyse besteht aus 3 Hauptschritten: 1) Wählen Sie die von In...

Dieses Protokoll beschreibt die Bewertung des subzellulären Kompartiment-spezifischen Redoxstatus innerhalb der Zelle. Eine redoxempfindliche Fluoreszenzsonde ermöglicht eine komfortable ratiometrische Analyse in intakten Zellen.

Bewertung der zellulären Oxidation mit einem subzellulären Kompartiment-spezifischeredox-sensitivegrüne fluoreszierende Protein

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

Aktuelle Protokollbewerter in Textil- und Redoxzustandsänderungen in intrazellulärer Kompartiment-spezifisch. Unser Protokoll ermöglicht ein besseres Verständnis und überwachung aller physiologischen oder pathophysiologischen Mechanismen von oxidativem Stress. Diese Technik ermöglicht eine unterbrechungsfreie Quantifizierung des gefliesten Augensulfid-Verhältnisses in intakten Zellen unter Verwendung einer ratiometrischen Ausgabe, um die Unterschiede zwischen Signalexpressionsniveaus, Fotobleichungen und Erkennungsempfindlichkeiten auszugleichen.Dieses Protokoll kann auf verschiedene Organismen angewendet werden, einschließlich Bakterien in Pflanzen. Am ersten Tag des Experiments behandeln die Zellen aus einer konfluenten Brustkrebs-Zelllinie für zwei Minuten, mit zwei Millilitern von 0,2, 5%Trips in EDTA. Wenn die Zellen beginnen, die Reaktion mit sechs Millilitern des vollständigen Mediums zu lösen und die Zellen durch Zentrifugation zu sedimentieren.Das Pellet in fünf Milliliter frisches, vollständiges Medium aussetzen, die Zellen zählen und auf 1,5 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro einem Milliliter kompletten Medium verdünnen. Dann säen Sie 1,5 mal 10 bis die fünften Zellen pro Milliliter Zellen pro Brunnen in einer 6-Well-Platte, und inkubieren sie die Zellen im Zellkultur-Inkubator über Nacht. Oder fügen Sie keine virale Zeile GFP-Transduktion hinzu.Am nächsten Morgen, fügen Sie 12,5, 25 und 50 Mikroliter eines ein bis 100 verdünnt sechs mal 10 der 10. Plaque bildende Einheiten pro Milliliter hinzufügen keine virale erodierte GFP-Lösung, in vollständigem Medium. Fügen Sie dies zu den entsprechenden Brunnen oder die 6 Brunnenplatte hinzu, um die Zellen mit 50, 100 bzw. 200 Infektionsmultiplizitäten zu transducieren. Wenn alle Proben Wells mit Virus transduziert wurden, kehren Sie die Zellen für 16 bis 24 Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück.Am nächsten Tag visualisieren Sie die Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie und ersetzen Sie den Überstand durch Medium, ohne Virus, damit sich die Zellen für weitere 24 Stunden erholen können. Um die optimale Transduktionseffizienz zu bestimmen, bewerten Sie die Fluoreszenzintensität und Morphologie der Zellen durch Durchflusszytometrie. Achten Sie darauf, alle Verfahren durchzuführen, die Infektionen durch Aerosole oder Spritzer innerhalb eines Biosicherheitsniveaus zwei zertifizierten biologischen Sicherheitsschrank verursachen können.Um den Redoxstatus der Zellen zu bewerten, bebrüten Sie am nächsten Morgen die Zellen und die entsprechenden Wells der 6 Well-Platte mit 10 mikromolarem Wasserstoffperoxid für eine Stunde, bevor Sie die Zellen mit 750 Mikrolitern 0,2 5%Tropfen in EDTA pro Brunnen ablösen, wie gezeigt. Stoppen Sie die Reaktion mit zwei Millilitern komplettem Medium pro Brunnen und ziehen Sie die Überstände für jeden Zustand in einzelnen 15 Milliliter konischen Rohren. Sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und waschen Sie die Pellets in 500 Mikroliter PBS pro Brunnen durch Zentrifugationen zweimal.Filtern Sie die Zellsuspensionen nach der zweiten Wäsche durch 40 Mikrometer-Netze in strömungszytometriekompatible Rohre auf Eis, die vor Licht geschützt sind. Führen Sie in der Flow-Zytometer-Software die Null-Multiplizität der Infektionskontrollprobe aus. Analysieren Sie dann das Wasserstoffperoxid und unbehandelte Zellen.Es wird die Berechnung des mittleren fluoreszierenden Intensitätsverhältnisses zwischen den oxidierten und reduzierten Formen des ReihenGFP ermöglichen, unter Verwendung der angegebenen Formel. Hier ist die Gating-Strategie für die Auswahl einer großen Anzahl von Zellen durch Durchflusszytometrie wird gezeigt. Die Durchflusszytometrie kann auch verwendet werden, um die Dosis-Antwort-Kurve für die Rand-GFP-Analyse und die effizienteste Multiplizität der Infektionseingaben zu bestimmen.Nach der Vielzahl der Infektion, Dosis-Reaktions-Kurve in dieser repräsentativen Analyse, eine 200 Vielzahl von Infektionen gab die höchste Straße GFP-Expression, aber die Zellmorphologie wurde durchgeführt, die Zytotoxizität suggeriert. Daher wurde die optimale Transduktionseffizienz als eine Vielzahl von Infektionen von 100 bestimmt. In dieser Redoxstatusanalyse wurden oxidierte und reduzierte Reihen-GFP-Mittelfluoreszenzintensitäten aus der Durchflusszytometrie-Analyse für Fahrzeuge und vier 10 mikromolaren Positivkontroll-Wasserstoffperoxid-Behandlungen erhalten.Die überlagerten Histogramme stellen die Verschiebungen der Zellzahl in den 10 mikromollaren Wasserstoffperoxid- und fahrzeugbehandelten Gruppen oder reduzierten und oxidierten Erodieren GFP dar. Die Berechnung des Verhältnisses zwischen dem oxidierten und reduzierten Reihen-GFP für diese Analyse ergab, dass 10 mikromolares Wasserstoffperoxid eine Verdreifachung der Oxidation des ReihenGFP im Vergleich zur Fahrzeugbehandlung verursachte. Genaue Zellzahlen sind wichtig für MRT-Berechnungen und Reproduzierbarkeit.Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, sollten die Forscher die antiviralen Lösungen gründlich mischen, um homogene Suspensionen zu erhalten. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, schnelle Redox-Änderungen als integralen Bestandteil des breiten Spektrums normaler zellulärer Prozesse und des Krankheitsverlaufs in Echtzeit zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Video beschreibt die Technik zur Visualisierung von oxidativem Stress in kultivierten Organoiden. Diese Arbeit hilft dabei, das Ausmaß des oxidativen Stresses aufgrund der ROS-Akkumulation in den verschiedenen Zelltypen zu verstehen, die in einem Organoid nach der Behandlung mit verschiedenen ROS-Modulatoren vorhanden sind.

Fluoreszenzsonden-Imaging-Assay: Eine Technik zur Visualisierung von oxidativem Stress in kultivierten Darmorganoidzellen von reaktiven Sauerstoffspezies, die mit Induktoren behandelt wurden

Wir beschreiben die Verwendung von zwei ratiometrischen, genetisch kodierte Biosensoren, die auf GFP basieren, zu mitochondrialen Redox-Zustand und ATP-Spiegel in subzellulären Auflösung in lebenden Hefezellen überwachen.

Ratiometric Biosensors, dass die mitochondriale Redox Staats-und ATP in lebenden Hefezellen Messen

Die konfokale Scanning-Mikroskopie zur Abbildung Einzel mitochondriale Ereignisse in perfundierten Herz-oder Skelettmuskulatur in lebenden Tieren angewendet. Echtzeit-Überwachung von einzelnen mitochondrialen Prozesse wie Superoxid blinkt und Membranpotentialschwankungen ermöglicht die Auswertung der mitochondrialen Funktion in einer physiologisch relevanten Kontext und bei pathologischen Störungen.

Die konfokale Bildgebung von Einzel Mitochondrial Super Blinkt Intact Herz oder In Vivo

Hier berichten wir über ein Protokoll zur Messung von oxidativem Stress in lebenden Zebrafischembryonen. Dieses Verfahren ermöglicht den Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) sowohl in ganzen Embryogeweben als auch in Einzelzellpopulationen. Mit diesem Protokoll werden sowohl qualitative als auch quantitative Analysen durchgeführt.

Analyse von oxidativem Stress in Zebrafischembryonen

Dieses Papier präsentiert einen hochauflösenden Mikroskopie-Workflow zur gleichzeitigen Quantifizierung von intrazellulären ROS-Niveaus sowie mitochondrialem Membranpotential und Morphologie - gemeinsam als mitochondriale Morphofunktion bezeichnet - in lebenden adhärenten Zellen unter Verwendung der zellpermeablen fluoreszierenden Reportermoleküle 5- (und- 6) -chlormethyl-2 ', 7'-dichlordihydrofluoresceindiacetat, Acetylester (CM-H 2 DCFDA) und Tetramethylrhodaminmethylester (TMRM).

Cellular Redox Profiling mit hochauflösender Mikroskopie

Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung von genetisch codierte Fluorogenic Reporter in einer live Cell Imaging-Anwendung für die Prüfung der Harnblase-induzierten oxidativen Stress. Diese experimentelle Ansatz bietet unvergleichliche räumlich-zeitliche Auflösung, Sensitivität und Spezifität vieler die Unzulänglichkeiten der konventionellen Methoden zur Erkennung von toxikologischen oxidativen Stress zu vermeiden.

Imaging-Ansätze zur Bewertung der toxikologischen oxidativen Stress mit genetisch codierte Fluorogenic Sensoren

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis der gesamten ulzellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) mit 2',7'--Dichlordihydrofluorescein-Diaacetat (DCFH-DA) vor. Diese Methode kann die zelluläre ROS-Lokalisierung in anhaftenden Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop visualisieren und die ROS-Intensität mit einem Fluoreszenzplattenleser quantifizieren. Dieses Protokoll ist einfach, effizient und kostengünstig.

Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies insgesamt in anhaftenden Zellen durch 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetat-Färbung

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines genetisch kodierten Wasserstoffperoxid (H2O2)-Biosensors in kultivierten Zebrafischneuronen und Larven zur Beurteilung der physiologischen Signalfunktionen vonH2O2während der Entwicklung des Nervensystems. Es kann auf verschiedene Zelltypen angewendet und mit experimentellen Behandlungen modifiziert werden, um reaktive Sauerstoffspezies (ROS) in der allgemeinen Entwicklung zu untersuchen.

ROS Live Cell Imaging während der neuronalen Entwicklung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zum Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in den intestinalen murinen Organoiden unter Verwendung qualitativer Bildgebung und quantitativer Zytometrie-Assays. Diese Arbeit kann möglicherweise auf andere fluoreszierende Sonden ausgedehnt werden, um die Wirkung ausgewählter Verbindungen auf ROS zu testen.

Analyse von oxidativem Stress in murinen Darmorganoiden mit reaktiver Sauerstoffspezies-sensitiver fluorogener Sonde

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Bestimmung von Unterschieden im basalen Redoxzustand und in den Redoxreaktionen auf akute Störungen in primären Hippocampus- und kortikalen Neuronen unter Verwendung der konfokalen Live-Mikroskopie. Das Protokoll kann mit minimalen Modifikationen auf andere Zelltypen und Mikroskope angewendet werden.

Live-Bildgebung des mitochondrialen Glutathion-Redox-Zustands in primären Neuronen unter Verwendung eines ratiometrischen Indikators

Lernen Sie die Bewertung subzellulärer Redox-Zustände in intakten Zellen mit einem redox-sensitiven fluoreszierenden Protein. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht die Quantifizierung oxidativer Stressmechanismen in Echtzeit.

Bewertung der zellulären Oxidation mit einem subzellulären Kompartiment-spezifischeredox-sensitivegrüne fluoreszierende Protein

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